שימוש במיקרו מערכים לחקור השפעה מיקרוסביבתית על פנוטיפים סלולריים בסרטן
Summary
מטרת השיטה המוצגת כאן היא להראות כיצד מיקרומערכים מיקרואקולוגיה (MEMA) ניתן לזייף ולהשתמש כדי לחקור את ההשפעה של אלפי קומבינטורית מיקרו סביבות פשוטות על הפנוטיפ של תאים מתורבתים.
Abstract
הבנת ההשפעה של המיקרוסביבה על הפנוטיפ של התאים היא בעיה קשה בשל התערובת המורכבת של שני גורמי גדילה מסיסים וחלבונים הקשורים מטריקס ב מיקרוסביבה ב vivo. יתר על כן, ריאגנטים זמין עבור מידול של מיקרו סביבות בתוך החוץ בדרך כלל לנצל תערובות מורכבות של חלבונים כי הם מוגדרים לחלוטין וסובלים אצווה להשתנות אצווה. פלטפורמת המיקרו-מיקרו של הסביבה (MEMA) מאפשרת הערכה של אלפי שילובים פשוטים של חלבונים מיקרוסביבתיים להשפעה שלהם על הפנוטיפים הסלולריים בתוך שיטת יחיד. MEMAs מוכנים צלחות היטב, אשר מאפשר תוספת של ליגונים בודדים להפריד בארות המכילות מטריקס מוליכי הרכב (ECM) חלבונים. השילוב של הליטרים מסיסים עם כל ECM מודפס יוצר שילוב ייחודי. שיטת MEMA טיפוסית מכילה יותר מ-2,500 מיקרוסביבות קומבינטורית ייחודיות שתאים חשופים אליהם בתוך שיטת יחיד. כמקרה מבחן, סרטן השד התאים קו MCF7 היה מצופה על פלטפורמת MEMA. ניתוח זה מזוהה גורמים שניהם לשפר ולעכב את הצמיחה והתפשטות של תאים אלה. פלטפורמת MEMA היא גמישה מאוד והוא יכול להיות מורחב לשימוש עם שאלות ביולוגיות אחרות מעבר למחקר הסרטן.
Introduction
Culturing של שורות תאים סרטניים על פלסטיק דו מימדי (2D) monolayers נשאר אחד הסוסים העיקריים עבודה עבור חוקרי סרטן. עם זאת, המיקרו-סביבה מוכרת יותר ויותר בשל יכולתה להשפיע על פנוטיפים סלולריים. בסרטן, מיקרוסביבה הגידול ידוע להשפיע על התנהגויות סלולר מרובות, כולל צמיחה, הישרדות, פלישה, ותגובה לטיפול1,2. תרביות תאים מסורתיים בדרך כלל חוסר השפעות מיקרו הסביבה, אשר הובילה לפיתוח של מורכב יותר תלת-מימדי (3d) בחני לגדול תאים, כולל מסחרית זמין מרתף מטוהרים מתחת תמציות קרום. עם זאת, אלה מטריצות מטוהרים הם בדרך כלל מורכבים להשתמש וסובלים מבעיות טכניות כגון השתנות אצווה3 וקומפוזיציות מורכבות3. כתוצאה מכך, זה יכול להיות קשה להקצות פונקציה חלבונים ספציפיים שעשויים להשפיע על פנוטיפים סלולריים3.
כדי לטפל במגבלות אלה, פיתחנו את הטכנולוגיה microenvironment מיקרו-הסביבה (mema), אשר מפחית את המיקרו-סביבה עד שילובים פשוטים של מטריקס מטריצה (ecm) ומסיס גורם צמיחה חלבונים4,5 . פלטפורמת MEMA מאפשרת זיהוי של גורמים מיקרוסביבתיים דומיננטי המשפיעים על התנהגות של תאים. באמצעות תבנית מערך, ניתן לקבל בניסוי אחד אלפי שילובים של גורמי מיקרו-סביבה. MEMA תיאר כאן חוקר שערים ~ 2,500 שונים בתנאים מיקרו סביבה ייחודית. חלבונים מסוג ECM המודפסים בלוחות הגידול של הטופס שעליהם יכולים להיות מתורבתים. ליגפות מסיסים מתווספים לבארות בודדות, ויוצרות קומבינטורית מיקרו-סביבות ייחודיות (ECM + ligands) בכל נקודה שונה אליה נחשפים התאים. תאים הם מתורבתים במשך מספר ימים, לאחר מכן קבוע, מוכתם, והתמונה כדי להעריך פנוטיפים הסלולר כתוצאה של חשיפה אלה שילובים ספציפיים מיקרו הסביבה. מאז המיקרוסביבות הם שילובים פשוטים, זה פשוט לזהות חלבונים כי כונן שינויים פנוטימית עיקריים בתאים. Memas השתמשו בהצלחה כדי לזהות גורמים המשפיעים על מספר פנוטיפים סלולריים, כולל אלה כי כונן החלטות הגורל תא תגובה לטיפול4,5,6,7. תגובות אלה ניתן לאמת בניסויים 2D פשוטים ולאחר מכן ניתן להעריך בתנאים כי יותר לכידה מלאה של המורכבות של מיקרוסביבה הגידול. פלטפורמת MEMA היא להתאים מאוד למגוון של סוגי תאים ונקודות קצה, בתנאי כי בסמנים פנוטיפים טובים זמינים.
Protocol
Representative Results
Discussion
חשיבותה של “ממדי” והקשר היה גורם מניע בפיתוח במערכות תרבות מבחנה ככלים לאפיון תאים סרטניים באמצעות האינטראקציה שלהם עם המיקרו-סביבה11, והיכולת של מבחנה מערכות תרבות לחקות את הסביבה vivo הוא כוח המניע מאחורי החיפוש כדי לשפר את מערכות התרבות. אולם, במערכות חוץ גופית, נותרו כלים משמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי ספריית הקרן המשותפת של NIH של הרשת חתימות סלולריות (LINCS) גרנט HG008100 (J.W.G., L.M.H., ו-J. E. K).
Materials
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
- Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
- Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
- Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , (2013).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a “normal” cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
- Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
- Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
- Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
