Micro arrays gebruiken om micro-milieueffecten te ondervragen op cellulaire fenotypes bij kanker
Summary
Het doel van de hier gepresenteerde methode is om te laten zien hoe micro Environment micro arrays (MEMA) kunnen worden gefabriceerd en gebruikt voor het ondervragen van de impact van duizenden eenvoudige combinatorische micro-omgevingen op het fenotype van gekweekte cellen.
Abstract
Het begrijpen van de impact van de micro-omgeving op het fenotype van cellen is een moeilijk probleem vanwege het complexe mengsel van zowel oplosbare groeifactoren als matrix-geassocieerde eiwitten in de micro-omgeving in vivo. Bovendien, gemakkelijk beschikbare reagentia voor het modelleren van micro-omgevingen in vitro meestal gebruik maken van complexe mengsels van eiwitten die zijn niet volledig gedefinieerd en lijden aan batch variabiliteit. Het micro Environment Microarray-platform (MEMA) maakt het mogelijk om duizenden eenvoudige combinaties van micro-milieu proteïnen te beoordelen voor hun impact op cellulaire fenotypes in één enkele test. De mema’s worden bereid in goed platen, die het mogelijk maakt de toevoeging van individuele liganden om putten met opgesteld extracellulaire matrix (ECM) eiwitten scheiden. De combinatie van de oplosbare ligand met elke gedrukte ECM vormt een unieke combinatie. Een typische MEMA-test bevat meer dan 2.500 unieke combinatorische micro-omgevingen waarin cellen worden blootgesteld aan een enkelvoudige test. Als test case werd de borstkanker cellijn MCF7 verguld op het MEMA-platform. Analyse van deze assay geïdentificeerd factoren die zowel verbeteren en remmen van de groei en de proliferatie van deze cellen. Het MEMA-platform is zeer flexibel en kan worden uitgebreid voor gebruik met andere biologische vragen buiten kankeronderzoek.
Introduction
Het kweken van kanker cellijnen op plastic in tweedimensionale (2D) monolagen blijft een van de belangrijkste werkpaarden voor kanker onderzoekers. Echter, de micro-omgeving wordt steeds meer erkend voor haar vermogen om cellulaire fenotypes beïnvloeden. Bij kanker, de tumor micro omgeving is bekend dat het beïnvloeden van meerdere cellulaire gedrag, met inbegrip van de groei, overleving, invasie, en reactie op therapie1,2. Traditionele monolaag celculturen hebben doorgaans geen invloed op de micro-omgeving, wat heeft geleid tot de ontwikkeling van complexere driedimensionale (3D) assays om cellen te kweken, inclusief in de handel verkrijgbare gezuiverde kelder membraan extracten. Echter, deze gezuiverde matrices zijn meestal ingewikkeld om te gebruiken en lijden aan technische problemen zoals batch variabiliteit3 en complexe composities3. Als gevolg hiervan kan het moeilijk zijn om functie toe te wijzen aan specifieke eiwitten die invloed kunnen hebben op cellulaire fenotypes3.
Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we de micro Environment Microarray (MEMA) technologie ontwikkeld, die de micro-omgeving verlaagt tot eenvoudige combinaties van extracellulaire matrix (ECM) en oplosbare groeifactor eiwitten4,5 . Het MEMA-platform maakt identificatie mogelijk van dominante micro-omgevingsfactoren die van invloed zijn op het gedrag van cellen. Met behulp van een array-indeling, kunnen duizenden combinaties van micro-omgevingsfactoren worden getest in één experiment. De MEMA hier beschreven ondervraagt ~ 2.500 verschillende unieke micro voorwaarden. ECM-eiwitten gedrukt in goed platen vormen groei pads waarop cellen kunnen worden gekweekt. Oplosbare liganden worden toegevoegd aan individuele putten, waardoor unieke combinatorische micro-omgevingen (ECM + ligand) worden gemaakt op elke andere plek waar de cellen worden blootgesteld. Cellen worden meerdere dagen gecultiveerde, vervolgens vast, gekleurd en afbeelding gemaakt om cellulaire fenotypes te beoordelen als gevolg van blootstelling aan deze specifieke combinaties van micro omgevingen. Omdat de micro-omgevingen eenvoudige combinaties zijn, is het eenvoudig om eiwitten te identificeren die belangrijke fenotypische veranderingen in cellen stimuleren. Mema’s zijn met succes gebruikt voor het identificeren van factoren die invloed hebben op meerdere cellulaire fenotypes, met inbegrip van die die de beslissingen van de cel van het lot stimuleren en de respons op therapie4,5,6,7. Deze antwoorden kunnen worden gevalideerd in eenvoudige 2D-experimenten en kunnen vervolgens worden beoordeeld onder omstandigheden die meer volledig even de complexiteit van de tumor-micro omgeving. Het MEMA-platform is zeer aanpasbaar aan een verscheidenheid aan celtypen en eindpunten, op voorwaarde dat er goede fenotypische biomarkers beschikbaar zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het belang van “dimensionaliteit” en context is een motiverende factor geweest in de ontwikkeling van in-vitro cultuur systemen als hulpmiddelen bij de karakterisering van kankercellen door hun interactie met de micro-omgeving11, en het vermogen van in vitro cultuur systemen die de in vivo-omgeving nabootsen, zijn een drijvende kracht achter de zoektocht naar verbetering van die cultuur systemen. In-vitro systemen blijven echter belangrijke instrumenten voor kankeronderzoek, juist vanwege hun verm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NIH common Fund Library van Network Cellular signaturen (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H. en J. E. K).
Materials
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
- Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
- Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
- Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , (2013).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a “normal” cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
- Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
- Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
- Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
