Summary
Het doel van de hier gepresenteerde methode is om te laten zien hoe micro Environment micro arrays (MEMA) kunnen worden gefabriceerd en gebruikt voor het ondervragen van de impact van duizenden eenvoudige combinatorische micro-omgevingen op het fenotype van gekweekte cellen.
Abstract
Het begrijpen van de impact van de micro-omgeving op het fenotype van cellen is een moeilijk probleem vanwege het complexe mengsel van zowel oplosbare groeifactoren als matrix-geassocieerde eiwitten in de micro-omgeving in vivo. Bovendien, gemakkelijk beschikbare reagentia voor het modelleren van micro-omgevingen in vitro meestal gebruik maken van complexe mengsels van eiwitten die zijn niet volledig gedefinieerd en lijden aan batch variabiliteit. Het micro Environment Microarray-platform (MEMA) maakt het mogelijk om duizenden eenvoudige combinaties van micro-milieu proteïnen te beoordelen voor hun impact op cellulaire fenotypes in één enkele test. De mema's worden bereid in goed platen, die het mogelijk maakt de toevoeging van individuele liganden om putten met opgesteld extracellulaire matrix (ECM) eiwitten scheiden. De combinatie van de oplosbare ligand met elke gedrukte ECM vormt een unieke combinatie. Een typische MEMA-test bevat meer dan 2.500 unieke combinatorische micro-omgevingen waarin cellen worden blootgesteld aan een enkelvoudige test. Als test case werd de borstkanker cellijn MCF7 verguld op het MEMA-platform. Analyse van deze assay geïdentificeerd factoren die zowel verbeteren en remmen van de groei en de proliferatie van deze cellen. Het MEMA-platform is zeer flexibel en kan worden uitgebreid voor gebruik met andere biologische vragen buiten kankeronderzoek.
Introduction
Het kweken van kanker cellijnen op plastic in tweedimensionale (2D) monolagen blijft een van de belangrijkste werkpaarden voor kanker onderzoekers. Echter, de micro-omgeving wordt steeds meer erkend voor haar vermogen om cellulaire fenotypes beïnvloeden. Bij kanker, de tumor micro omgeving is bekend dat het beïnvloeden van meerdere cellulaire gedrag, met inbegrip van de groei, overleving, invasie, en reactie op therapie1,2. Traditionele monolaag celculturen hebben doorgaans geen invloed op de micro-omgeving, wat heeft geleid tot de ontwikkeling van complexere driedimensionale (3D) assays om cellen te kweken, inclusief in de handel verkrijgbare gezuiverde kelder membraan extracten. Echter, deze gezuiverde matrices zijn meestal ingewikkeld om te gebruiken en lijden aan technische problemen zoals batch variabiliteit3 en complexe composities3. Als gevolg hiervan kan het moeilijk zijn om functie toe te wijzen aan specifieke eiwitten die invloed kunnen hebben op cellulaire fenotypes3.
Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we de micro Environment Microarray (MEMA) technologie ontwikkeld, die de micro-omgeving verlaagt tot eenvoudige combinaties van extracellulaire matrix (ECM) en oplosbare groeifactor eiwitten4,5 . Het MEMA-platform maakt identificatie mogelijk van dominante micro-omgevingsfactoren die van invloed zijn op het gedrag van cellen. Met behulp van een array-indeling, kunnen duizenden combinaties van micro-omgevingsfactoren worden getest in één experiment. De MEMA hier beschreven ondervraagt ~ 2.500 verschillende unieke micro voorwaarden. ECM-eiwitten gedrukt in goed platen vormen groei pads waarop cellen kunnen worden gekweekt. Oplosbare liganden worden toegevoegd aan individuele putten, waardoor unieke combinatorische micro-omgevingen (ECM + ligand) worden gemaakt op elke andere plek waar de cellen worden blootgesteld. Cellen worden meerdere dagen gecultiveerde, vervolgens vast, gekleurd en afbeelding gemaakt om cellulaire fenotypes te beoordelen als gevolg van blootstelling aan deze specifieke combinaties van micro omgevingen. Omdat de micro-omgevingen eenvoudige combinaties zijn, is het eenvoudig om eiwitten te identificeren die belangrijke fenotypische veranderingen in cellen stimuleren. Mema's zijn met succes gebruikt voor het identificeren van factoren die invloed hebben op meerdere cellulaire fenotypes, met inbegrip van die die de beslissingen van de cel van het lot stimuleren en de respons op therapie4,5,6,7. Deze antwoorden kunnen worden gevalideerd in eenvoudige 2D-experimenten en kunnen vervolgens worden beoordeeld onder omstandigheden die meer volledig even de complexiteit van de tumor-micro omgeving. Het MEMA-platform is zeer aanpasbaar aan een verscheidenheid aan celtypen en eindpunten, op voorwaarde dat er goede fenotypische biomarkers beschikbaar zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Een overzicht van het gehele MEMA-proces, inclusief de geschatte tijd, wordt beschreven in het stroomdiagram in Figuur 1. Dit protocol Details de fabricage van MEMAs in 8-well platen. Het protocol kan worden aangepast voor andere platen of dia's.
1. bereiding van eiwitten, verdunningsmiddelen en kleurings buffers
- Evenwichts flacons met ECMs, liganden en cytokines op kamertemperatuur (RT) en centrifugeer kort. Voeg het juiste volume van de juiste RT-buffer toe zoals aangegeven op het productgegevensblad. Volg de aanbeveling van de fabrikant voor voorraad concentraties.
Opmerking: In tabel 1 en tabel 2vindt u een volledige lijst van de liganden en ecm's met hun voorraad en de uiteindelijke concentraties. Beide liganden en Ecm's worden meestal gebruikt bij de hoogste concentratie van het bereik dat door de fabrikant wordt aanbevolen en die een biologisch effect uitlokken in standaardcultuur testen van 2 dagen. Behandel eiwitten zachtjes en in bioveiligheidskasten onder laminaire stroming om verontreiniging te voorkomen. - Inincuberen flesjes met zachte schommelen bij RT voor 1 uur. Vortex eiwitten niet, want dit kan leiden tot denatureren.
- Aliquot eiwitten voor lange termijn opslag, zodat alle aliquots alleen voor eenmalig gebruik zijn om afbraak met herhaalde vries/dooi cycli te voorkomen. Bewaar gelyofiliseerde eiwitten bij-80 °C (tenzij anders aangegeven) totdat het nodig is. Zorg voor het verzamelen van alle metadata voor toekomstig gebruik, zoals: (i) eiwit naam, (II) datum voorbereid, (III) partij/partijnummer, (IV) leverancier, (v) catalogus nummer, (VI) concentratie, (VII) volume, en (VIII) Voorbereider.
- Bereid een verdunnings vloeistof buffer met 20% (v/v) glycerol, 10 mM EDTA, 200 mM tris-HCl, pH 7,2 en filter steriliseren. Bewaar deze buffer steriel en bewaar deze bij RT.
- Bereid de kleurings buffer voor met 2% (w/v) BSA, 1 mM MgCl2en 0,02% Nan3 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Filter en bewaar bij 4 °C.
2. bereiding van een ECM-bron plaat
- Verwijder aliciteerde voorraden ECM-eiwitten die moeten worden gedrukt en ontdooien op ijs. Noteer alle lotnummers voor het bijhouden van metagegevens.
- Veeg buisjes van ontdooide eiwitten zachtjes om een goede resuspensie te garanderen en in een centrifuge te draaien.
-
Maak ECM-print mengsels (Epm's) en een fluorescerende fiducial om te worden gebruikt door een vloeistof behandelings robot die de gerandomiseerde 384-well-bron platen zal maken.
Opmerking: de 384-well bron platen worden gebruikt door een touch PIN array printer om de bedrukte arrays te maken in 8 well Plates.- Label 1,5 mL micro centrifugebuizen voor elke EPM en de fiducial.
- Bereid elke EPM met een combinatie van 125 μL verdunningsmiddel buffer (zie stap 1,4) met het juiste volume ECM-voorraad en breng het mengsel tot een totaal volume van 250 μL met PBS. De uiteindelijke concentraties in elke EPM-buis zullen 1x ECM-eiwitten, 5 mM EDTA, 10% glycerol en 100 mM tris zijn.
- Maak een fluorescerende fiducial door het op te lossen in de door de fabrikant gespecificeerde juiste buffer en breng 250 μL over naar een gelabeld fiducial Tube.
3. creatie van de bron plaat met behulp van een Liquid handler
- Ontwerp een 384-well plate layout die de posities van de ECMs willekeurig maakt en is geoptimaliseerd voor de array printer PIN Head die wordt gebruikt. Ontwerp de plaatsing van de fiducial zodat deze wordt afgedrukt in de rij 1, kolom 1 positie van elk goed om te helpen in de matrix oriëntatie.
Opmerking: In totaal worden 14 − 15 replicaten van elke ECM gebruikt om robuuste gegevens te garanderen. Neem extra replicaten van collageen of een andere ECM op die een robuuste bevestiging oplevert voor de beoordeling van de uniformiteit van de binding. De lay-out moet mogelijk meerdere 384-put-platen gebruiken, afhankelijk van het aantal ECMs van belang. - Breng EPM-buizen over naar een vloeistof behandelaar, houd tubes bij 4 °C met een gekoeld buisrek of met een vloeibare Handling robot die zich in een koude ruimte bevindt.
- Gebruik de software van de Liquid handler om een programma uit te voeren om 15 μL van elke EPM en de fiducial over te brengen naar de vooraf aangewezen putten binnen de 384-bron plaat (en).
- Pipet in alle ongebruikte putjes om de luchtvochtigheid te verhogen en te beschermen tegen uitdroging tijdens het drukproces.
Opmerking: Zie afbeelding 2 voor een voorbeeld van een 384-bron plaat set die is geoptimaliseerd voor een 4 x 7-pins kop en bevat een collageen I-blok en PBS. - Afdichtings plaat (en) en houd deze bij 4 °C tot u klaar bent om af te drukken.
4. Mema's printen met een array Printing robot
Opmerking: Het volgende deel van het protocol beschrijft specifiek de voorbereiding en het gebruik van MEMA om de impact van verschillende micro-milieu proteïnen op de groei en proliferatie van MCF7 cellen te onderzoeken. Het protocol kan echter gemakkelijk worden aangepast om verschillende liganden, Ecm's en cellen te gebruiken om andere cellijnen en eindpunten van belang te bestuderen.
-
Met behulp van een touch PIN printer, afdrukken EPMs en fiducial spots in 8 put platen. Druk meerdere replicaten van elke ECM-voorwaarde af om de reproduceerbaarheid te garanderen.
Opmerking: andere plaat formaten of-dia's kunnen worden gebruikt voor afdrukken, maar buffer optimalisatie kan nodig zijn om optimale spot vorming te bereiken.- Print de ECMs voor de MEMA met behulp van 350 μm diameter pinnen gerangschikt in een 4 x 7 printkop configuratie. Print de arrays in de 8-well platen als 20 kolommen door 35 rijen, voor een totaal van ~ 700 vlekken. Grotere arrays zijn mogelijk in deze platen, maar komen met een trade-off van verhoogde randeffecten in zowel celbinding als kleuring.
- Na het printen, bewaar de platen in een exsiccator gedurende minimaal 3 dagen voorafgaand aan het gebruik.
5. creatie van ligand behandelings platen
- Ontwerp een 96-well plate layout inclusief liganden van belang. Om de behandeling van veel MEMA platen tegelijk te vergemakkelijken, ontwerpt u deze plaat met spatiëring die het mogelijk maakt om een meerkanaals pipet te gebruiken met 4 verdeelde tips om vloeistoffen over te brengen tussen de putjes van 8-well MEMAs en een 96-well plate.
Opmerking: In dit protocol wordt de volledige set van liganden die worden vermeld in tabel 2 gebruikt. - Liganden op ijs ontdooien. Knip en draai elke Tube kort.
- Verdun de liganden met de door de fabrikant aanbevolen buffer (meestal PBS) tot een 200x werkvoorraad.
- Pipet keer 10 μL van elke 200x ligand kolf in de overeenkomstige put binnen de 96-well plate.
- Afdichting en bewaar de platen bij-20 °C.
Opmerking: Maak ligand-behandelings platen in batches, waarbij alle metagegevens voor downstream-analyse worden vastgelegd.
6. culturing cellen op MEMAs
- Blok Mema's gedurende 20 minuten met 2 mL per put van een niet-fouling blokkerende buffer met 1% niet-fouling blokkerende middel (tabel met materialen) in dubbel gedestilleerd water (DDH2O).
- Aanzuig buffer en drievoudige spoel putten met PBS. Om uitdroging te voorkomen, laat u het laatste volume van PBS in putjes tot het celbeplating klaar is.
Opmerking: Het is zeer nuttig om twee bench arbeiders voor celkweek stappen op MEMAs hebben. Een werkbank medewerker kan aspiratie stappen uitvoeren, terwijl de tweede de additie stappen uitvoert. Het wordt aanbevolen om een 1 mL multichannel pipet te gebruiken met tips die zijn gespatieerd om de 8-Wells plaat te passen voor pipetteren en een Y-Splitter met twee Pasteur-pipetten om meerdere putten tegelijk te aspireren. - Zaad 2 x 105 MCF7 cellen per goed in 2 ml van dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM) medium met 10% foetaal runderserum (FBS).
Opmerking: Voorafgaand aan een volledig MEMA-experiment, voert u een celtitratie-experiment uit om celaantallen zodanig te optimaliseren dat MEMA-vlekken hoge celaantallen hebben (maar niet Confluent zijn) aan het einde van de gewenste experimentele duur. - Na 2 − 18 h van adhesie, aspiraat medium en vervangen door 2 ml verlaagd groeimedium (DMEM met 0,1% FBS).
Opmerking: Verlaagd serum (bijv. 0,1% FBS) of groeifactor-verarmd omstandigheden kunnen op dit moment worden gebruikt om de stimulerende impact van specifieke liganden te isoleren. - Een ligand-behandelings plaat op ijs ontdooien. Centrifugeer de ontdooide plaat bij 200 x g gedurende 1 minuut.
- Breng 200 μL medium van elke put in de kweek plaat over naar de juiste put in de behandelings plaat. Pipet omhoog en omlaag om ligand volume te mengen met medium en breng dit mengsel terug naar de juiste put in de MEMA plaat.
- Licht rots met de hand en retourneer MEMA platen naar de incubator. Cultuur voor de duur van het experiment in aanwezigheid van de ligand/ECM combinatie bij 37 °C en 5% CO2.
Opmerking: Een typische MEMA experiment loopt voor 72 h; experimenten met langere duur kunnen vervanging van medium en herbehandeling met ligand vereisen. - Pulse MEMA Wells bij 71 h met 100x 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) voor een uiteindelijke concentratie van 10 μM. inbroed in experimentele omstandigheden met EdU gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2.
Opmerking: Andere Live Cell behandelingen kunnen ook op dit moment worden gebruikt.
7. fixatie en kleuring van de Mema's
- Na 72 h en eventuele Live-cel behandelingen, aspiraat Wells. Fixeer Mema's in 2 mL per put van 2% Paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 min bij RT.
- Aspirate PFA. Permeabilize met 2 ml per put van 0,1% nietionogene oppervlakteactieve stof gedurende 15 min.
- Aspireren de nonionische oppervlakteactieve stof en wassen met 2 mL per put van PBS. De aspirate PBS. Was met 2 mL PBS met 0,05% Polysorbaat 20 (PBS-T).
Opmerking: Het MEMA-oppervlak is hydrofoob en het niet wassen met PBS-T vóór de incubatie van vlekken en antilichamen zal resulteren in de vorming van holtes in putten tijdens incubatie stappen en aanleiding geven tot kleurings artefacten. - Aspirate PBS-T. Voeg EdU-detectie reactie reagentia toe. Incuberen voor 1 uur op RT, schommelen en beschermd tegen licht. Na 1 uur incubatie, dorst lessen-reactie met de meegeleverde commerciële dorst lessen-buffer.
Opmerking: EdU detectie en vlekken/antilichaam stappen kunnen worden uitgevoerd in 1,5 mL per goed om de kosten te verlagen. - Zuig de dorst lessen-buffer op en was met PBS-T voordat u met vlekken of antilichamen inbroed.
- Inincuberen MEMA putten met antilichamen tegen Histon H3K9me3 (1:1000) en fibrillarin (1:400) in kleurings buffer met 2% (w/v) boviene serumalbumine (BSA), 1 mM MgCl2 en 0,02% Nan3 's nachts bij 4 °c.
Opmerking: Voer antilichaamtitraties uit om optimale concentraties te bepalen voordat u ze op een volledige MEMA-set gebruikt. - Na primair antilichaam of vlek incubatie, was Wells 2x met PBS en één keer met PBS-T.
- Voeg secundaire antilichamen toe (Donkey anti-muis IgG en Donkey anti-konijn IgG, beide 1:300) en 0,5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI). Inincuberen voor 1 uur bij RT in het donker.
- Was Wells 2x met 2 mL per putje van PBS en laat ze in de laatste 2 mL PBS.
- Ga verder naar Imaging of bewaar gekleurd MEMAs voor latere beeldvorming in PBS bij 4 °C beschermd tegen licht.
8. beeldvorming van Mema's
- Afbeelding MEMA op een geautomatiseerd beeldvormings systeem met geschikte fluorescerende detectie kanalen.
- Uitvoer resulterende afbeeldingsgegevens naar een beeldbeheersysteem. Segmenteer cellen en bereken intensiteitsniveaus met CellProfiler8.
9. gegevensanalyse
Opmerking: Gegevensanalyse bestaat uit normalisatie, variatie correctie en samenvatting van de onbewerkte CellProfiler afgeleide gegevens. In dit geval wordt de R-omgeving met aangepaste code gebruikt om alle stappen uit te voeren. Echter, elke statistische omgeving of softwareprogramma kan worden gebruikt om de equivalente acties uit te voeren. Een voorbeeld van de open source aangepaste code voor de R-omgeving voor analyse is beschikbaar op: https://www.Synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
- De gesegmenteerde afbeeldingsgegevens vooraf verwerken en normaliseren.
- Bepaal het aantal steun cellen met behulp van de DAPI gebeitste kernen.
- Auto-Gate EdU-intensiteit om cellen te labelen als EdU+. Meet de proliferatie met behulp van het aandeel van EdU+ -cellen op elke plek.
- Mediaan vat cytoplasmische vlekken en nucleaire morfologie metingen op het niveau van de spot.
- Voer verwijdering van ongewenste variatie (RUV) normalisering op de gegevens om gegevenskwaliteit9te verbeteren.
Opmerking: Deze aanpak wordt toegepast op elke intensiteit en morfologie signaal onafhankelijk als een matrix met matrices met behulp van de rijen en vlekken als de kolommen zoals eerder beschreven9. - Bivariate löss normalisering toepassen op de RUV genormaliseerde restanten met behulp van de array rij en array kolom als de onafhankelijke variabelen om te corrigeren voor ruimtelijke of intensiteit gerelateerde effecten.
- Zodra de normalisatie is voltooid, de mediaan vat de replicaten voor elke micro-omgeving voorwaarde voor rapportage en verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de micro-milieueffecten op celgroei en proliferatie te vereenvoudigen en om voorwaarden te identificeren die de celgroei en-proliferatie bevorderen of remmen, werd de borstkanker cellijn MCF7 op een set van acht 8-goed-Mema's, zoals beschreven in het Protocol, gesebeerd. Deze test blootgestelde de cellen aan 48 verschillende ECMs en 57 verschillende liganden, voor een totaal van 2736 combinatorische micromilieuvoor waarden. Na 71 h in de cultuur werden cellen gepulseerd met EdU, vast, doordrongen en gekleurd met DAPI, de reactie voor EdU-detectie, een anti-fibrillin antilichaam en een anti-H3K9me3 antilichaam. Cellen werden op een hoge inhouds Microscoop afgebeeld. De afbeeldingen zijn geüpload naar een Omero server10, gesegmenteerd met behulp van cellprofiler8en genormaliseerd en geanalyseerd in R9. De hieronder beschreven resultaten zijn gericht op de DAPI-en EdU-signalen.
Het beeldanalyse platform van MEMAs levert een aantal resultaten op die vergelijkbaar zijn met die welke beschikbaar zijn via Flowcytometrie benaderingen, zoals DNA-inhouds plots met 2N-en 4N-fracties voor cellen die met een gegeven ligand worden behandeld (Figuur 3a), op basis van de DAPI intensiteit en gebied. Deze waarnemingspunten leveren bewijsmateriaal voor omstandigheden die actieve celcycling bevorderen versus zoals aangegeven door duidelijke bimodale pieken die overeenkomen met cellen in G1-of G2-fasen versus groei gearresteerde cellen, die veranderingen in de pieken in vergelijking met controle omstandigheden zouden vertonen. We gebruiken de gegevens van het celnummer en de kleurings intensiteit om de gegevens samen te vatten, waarbij de impact van de micro omgeving (liganden op één as, ECM op de tweede as) op zowel het celnummer (Figuur 3B) als de oprichting van EdU (Figuur 3C) kan gemakkelijker worden gezien als veranderingen in de kleur en intensiteit van de heatmap. Zoals blijkt uit deze percelen, zijn veel van de effecten ligand-driven, omdat de ECM-aandoening het celgetal of EdU-positiviteit niet sterk heeft beïnvloeden. Nidogen-1 is een duidelijke uitzondering, omdat de aanwezigheid van dit ECM-molecuul celbinding en groei van MCF7 remt. Liganden zoals FGF6 en NRG1α (NRG 1.1 op plots) verbeteren het celnummer en hebben hoge percentages EdU-integratie, terwijl liganden zoals AREG en NRG1-smdf (NRG 1.10 op plots) celbinding en/of groei van cellen remmen. Deze bevindingen worden ondersteund door de beelden van de cellen die op de vlekken groeien, waarbij een duidelijk verschil in het celgetal en de positiviteit van EdU duidelijk is (zie voorbeeld in Figuur 3D).
Omdat het MEMA-platform een nieuwere technologie is, werden de resultaten gevalideerd in afzonderlijke assays. MCF7 cellen werden in 24-put platen gesekt met collageen I in DMEM medium met 10% FBS. Na 18 uur, media werden uitgewisseld voor verminderde groeimedium (DMEM met 0,1% FBS) en cellen werden behandeld met NRG1α, FGF6, of AREG en gekweekt voor 72 h. EdU werd toegevoegd 1 h voorafgaand aan de fixatie. Cellen werden bevlekt met DAPI en voor EdU-integratie, imaged, gesegmenteerd en geanalyseerd. Net als bij de resultaten van het MEMA-platform gaven FGF6 en NRG1α allebei aanleiding tot hogere celaantallen (Figuur 4A) en EdU-incorporatie percentages (Figuur 4B) vergeleken met AREG behandelde cellen, waardoor onze observaties in de originele MEMA experimenten.
Figuur 1 : Stroomdiagram waarin de werkstroom en de tijdlijn voor de verschillende fasen van een typisch MEMA-experiment worden weergegeven. Zodra de Mema's zijn gedrukt, kunnen ze worden bewaard bij kamertemperatuur die enkele maanden vóór gebruik wordt uitgesorbeerd. Typisch, de experimentele fase duurt 3 − 4 dagen, maar sommige langzaam groeiende primaire cellen zijn gekweekt op MEMAs voor maximaal 2 weken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : ECM-bron plaat indeling voor array afdrukken. Het collageen blok wordt op MEMA gedrukt als een raster, dat een zeer repetitieve reeks voorwaarden biedt die een robuustere normalisatie tussen putten mogelijk maken. De met PBS gevulde putjes bieden vochtigheid om de verdamping te voorkomen tijdens het drukproces. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Voorbeelden van gegevens die worden gegenereerd op basis van een typisch MEMA-experiment. A) celcyclus profielen van BINNED DAPI-intensiteitswaarden versus celtellingen van een 8-well plaat die met verschillende liganden is behandeld, met bifasische DAPI-intensiteits kleuring die de cellen in G1 versus de G2-celcyclus fase aangeeft. (B) heatmap met genormaliseerde steun cellen die geclusterd zijn door gelijkenis met behulp van hiërarchische clustering. Rood geeft het hogere celnummer aan en blauw is een lager celnummer. Liganden zijn op de x-as, ECMs zijn op de y-as. (C) heatmap met genormaliseerde edu-integratie, waarbij rood wordt aangegeven dat hoger en blauw wijst op lagere edu-integratie. Liganden zijn op de x-as, ECMs zijn op de y-as. (D) voorbeeld van MCF7 cellen die groeien op een MEMA spot behandeld met NRG1-α met hoge percentages EdU-integratie (roze kernen). Groene vlek is celmasker en blauw is DAPI. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Validatie van MEMA resulteert in celkweek. A) kwantificering van het celgetal als gevolg van de behandeling van MCF7 met verschillende liganden. Equivalente aantallen MCF7 cellen werden geplateerd in meerkleurige platen en vervolgens behandeld met AREG, FGF6 of NRG1α. Putten behandeld met AREG hadden significant minder cellen dan die behandeld met FGF6 (* * wat de student t-test p-waarden minder dan 0,01 aangeeft) of NRG1α (* duidt op een p-waarde van 0,05) bij 72 h post ligand behandeling. B) kwantificering van het niveau van de oprichting van edu in MCF7 als gevolg van behandeling met verschillende liganden, zoals in panel A. AREG-behandeling resulteert in een significant lager percentage cellen waarin EdU is verwerkt dan cellen die zijn behandeld met FGF6 (* *, p < 0,01) of NRG1α (* * *, p = 0,01). Foutbalken staan voor standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Eiwit naam | Uniprot ID | Voorraad Concentratie (μg/mL) |
Definitieve Concentratie (μg/mL) |
| ANGPT1 | 1 | Q15389 | 1 | 100 | 0,04 |
| ANGPT2 | 1 | O15123 | 1 | 100 | 0,2 |
| AREG | P15514 | 100 | 0,02 |
| BMP2 | P12643 | 100 | 0,1 |
| BMP3 | P12645 | 1000 | 0,1 |
| BMP4 | P12644 | 100 | 0,1 |
| BMP5 | 1 | P22003 | 1 | 100 | 0,1 |
| BMP6 | P22004 | 100 | 0,1 |
| BMP7 | P18075 | 100 | 0,1 |
| CSF2 | P04141 | 100 | 0,02 |
| CTGF | 1 | P29279 | 1 | 100 | 0,05 |
| CXCL12 | Alpha | P48061 | 2 | 100 | 0,01 |
| CXCL12 | Beta | P48061 | 1 | 100 | 0,03 |
| CXCL1 | P09341 | 100 | 0,004 |
| CXCL8 | 1 | P10145 | 1 | 100 | 0,3 |
| DLL1-| 1 | O00548 | 1 | 500 | 0,5 |
| DLL4 | Q9NR61 | 200 | 0,6 |
| EFG | 1 | P01133 | 1 | 500 | 0,01 |
| FASLG | 1 | P48023 | 1 | 10 | 0,02 |
| FGF2 | 3 | P09038 | 2 | 100 | 0,01 |
| FGF6 | P10767 | 100 | 0,01 |
| FLT3LG | 1 | P49771 | 1 | 50 | 0,001 |
| GPNMB | 1 | Q14956 | 1 | 100 | 0,5 |
| HGF | 1 | P14210 | 1 | 50 | 0,04 |
| IGF1 | 1 | P05019 | 1 | 200 | 0,01 |
| IGFBP2 | P18065 | 100 | 0,05 |
| IGFBP3 | 1 | P17936 | 1 | 100 | 0,1 |
| IL13 | P35225 | 100 | 0,01 |
| IL15 | IL15S48AA | P40933 | 1 | 50 | 0,01 |
| IL1B | P01584 | 25 | 0,001 |
| IL6 | P05231 | 100 | 0,01 |
| IL7 | 1 | P13232 | 1 | 100 | 0,01 |
| JAG1 | 1 | P78504 | 1 | 200 | 0,5 |
| JAG2 | Lange | Q9Y219 | 1 | 100 | 0,5 |
| KITLG | 1 | P21583 | 1 | 100 | 0,005 |
| KNG1 | HMW | P01042 | 1 | 100 | 0,2 |
| Lep | P41159 | 1000 | 0,002 |
| LYVE1 | Q9Y5Y7 | 100 | 0,05 |
| NRG1 | 10 | Q02297 | 10 | 100 | 0,01 |
| NRG1 | 1 | Q02297 | 1 | 100 | 0,05 |
| NRG1 | 6 | Q02297 | 6 | 100 | 0,01 |
| PDGFAB | go1990265 | 100 | 0,05 |
| PDGFB | 1 | P01127 | 1 | 100 | 0,05 |
| PTN | P21246 | 100 | 0,5 |
| Shh | Q15465 | 100 | 0,5 |
| TGFB1 | | Cterminus | P01137 | Cterminus | 20 | 0,01 |
| TGFB1 | | Ronde | P01137 | Ronde | 100 | 0,15 |
| TGFB2 | A | P61812 | 1 | 20 | 0,01 |
| THPO | 1 | P40225 | 1 | 50 | 0,002 |
| TNFRSF11B | O00300 | 100 | 0,02 |
| TNFSF11 | 1 | O14788 | 1 | 100 | 0,01 |
| Tnf | P01375 | 100 | 0,01 |
| VEGFA | VEGF206 | P15692 | 1 | 100 | 0,01 |
| WNT10A | Q9GZT5 | 100 | 0,1 |
| WNT3A | 1 | P56704 | 1 | 200 | 0,1 |
| Wnt5a | 1 | P22725 | 1 | 100 | 0,1 |
Tabel 1: de volledige lijst van liganden die worden gebruikt voor de MEMA-experimenten. De uniprot ID, voorraad concentraties en de uiteindelijke werk concentraties zijn aanwezig.
| ECM-eiwit | UniprotID | Voorraad concentratie (μg/mL) |
Definitieve Concentratie (μg/mL) |
Notities |
| ALCAM | 1 | Q13740 | 1 | 100 | 30 | |
| CDH20 | Q9HBT6 | 300 | 80 | |
| CDH6 | 1 | P55285 | 1 | 100 | 40 | |
| CDH8 | P55286 | 100 | 20 | |
| CD44 | 1 | P16070 | 1 | 100 | 30 | |
| CEACAM6 | P40199 | 100 | 30 | |
| COL1A1 | P02453 | 5000 | 200 | meerdere subeenheden met meerdere uniprot-id's |
| COL2A1 | 2 | P02458 | 2 | 1000 | 200 | |
| COL3A1 | 1 | P02461 | 1 | 1000 | 200 | |
| COL4A1 | 1 | P02462 | 1 | 1000 | 200 | meerdere subeenheden met meerdere uniprot-id's |
| COL5A1 | P20908 | 1000 | 200 | |
| COL23A1 | 1 | Q86Y22 | 1 | 200 | 80 | |
| DSG2 | Q14126 | 100 | 30 | |
| CDH1 | 1 | P12830 | 1 | 100 | 40 | |
| ECM1 | 1 | Q16610 | 1 | 100 | 40 | |
| FN1 | 1 | P02751 | 1 | 1000 | 200 | |
| GAP43 | 1 | P17677 | 1 | 158 | 40 | |
| HyA-500K | 1000 | 200 | LOR-0005 | |
| HyA-50K | 1000 | 200 | LOR-0007 | |
| ICAM1 | P05362 | 400 | 80 | |
| ALCAM | 1 | Q13740 | 1 | 100 | 30 | |
| CDH20 | Q9HBT6 | 300 | 80 | |
| CDH8 | P55286 | 100 | 20 | |
| CD44 | 1 | P16070 | 1 | 100 | 30 | |
| CEACAM6 | P40199 | 100 | 30 | |
| DSG2 | Q14126 | 100 | 30 | |
| CDH15 | P55291 | 100 | 20 | |
| VCAM1 | 1 | P19320 | 1 | 1000 | 200 | |
| LAMA1 | P25391 | 500 | 200 | meerdere subeenheden met meerdere uniprot-id's |
| LAMA3 | 2 | Q16787 | 2 | 130 | 40 | |
| Lum | P51884 | 200 | 80 | |
| CDH15 | P55291 | 100 | 20 | |
| NID1 | 1 | P14543 | 1 | 100 | 9,3 μg/mL Nid, 130 μg/mL lam, 46,5 μg/mL COL4 | + COL4 en laminine |
| OMD | Q99983 | 100 | 40 | |
| SPP1 | A | P10451 | 1 | 100 | 40 | |
| CDH3 | 1 | P22223 | 1 | 100 | 40 | |
| PECAM1 | Lange | P16284 | 1 | 150 | 40 | |
| TNC | 1 | P24821 | 1 | 500 | 200 | |
| VCAM1 | 1 | P19320 | 1 | 1000 | 200 | |
| VTN | P04004 | 100 | 40 | |
| Bgn | P21810 | 100 | 40 | |
| DCN | A | P07585 | 1 | 300 | 80 | |
| POSTN | 1 | Q15063 | 1 | 100 | 40 | |
| Sparc | P09486 | 100 | 40 | |
| THBS1 | 1 | P07996 | 1 | 100 | 40 | |
| BCAN | 1 | Q96GW7 | 1 | 100 | 40 | |
| ELN | 3 | P15502 | 3 | 1000 | 200 | |
| FBN1 | P35555 | 254 | 80 |
Tabel 2: de volledige lijst van ECM-eiwitten en-voorwaarden die in de MEMA-experimenten worden gebruikt. De uniprot ID, voorraad concentraties en de uiteindelijke werk concentraties zijn aanwezig. In sommige gevallen vertegenwoordigt de afgedrukte voorwaarde een eiwit complex of een combinatie van meerdere eiwitten, die wordt aangegeven in de kolom Notities.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het belang van "dimensionaliteit" en context is een motiverende factor geweest in de ontwikkeling van in-vitro cultuur systemen als hulpmiddelen bij de karakterisering van kankercellen door hun interactie met de micro-omgeving11, en het vermogen van in vitro cultuur systemen die de in vivo-omgeving nabootsen, zijn een drijvende kracht achter de zoektocht naar verbetering van die cultuur systemen. In-vitro systemen blijven echter belangrijke instrumenten voor kankeronderzoek, juist vanwege hun vermogen om het complex in vivo-situatie af te breken tot een vereenvoudigd model12.
Hoewel 2D-systemen Ecm's en liganden kunnen bevatten, hebben ze van oudsher ontbrak aan de doorvoercapaciteit om een breed panel van combinatorische pertubagens te ondervragen. Populaire commerciële kelder membraan extracten zorgen voor kweek in 3D, maar missen de herkomst van een zorgvuldig gedefinieerde panel van eiwitten. De commerciële extracten hebben doorgaans te kampen met een niet-volledig gedefinieerde samenstelling, die analyse kan verpanden en resulteert in significante variatie van batch tot batch3,13. Het MEMA platform overkomt deze barrières, waardoor de studie van veranderingen in cellulaire fenotypes, metabole activiteit, differentiatie status, en variaties in celgroei en proliferatie, omdat ze worden gemoduleerd door specifieke en gedefinieerde endogene Factoren.
Het MEMA-platform is een krachtige, middelgrote tot hoge doorvoer benadering om de impact van de micro-omgeving (zowel ECM als oplosbare factoren) op het fenotype van cellen te beoordelen. Het platform toont grote flexibiliteit voor de soorten assays en cellen waarvoor het kan worden gebruikt. We kunnen effecten waarnemen van zowel oplosbare liganden als de ECM-eiwitten waaraan de cellen blootstaan. Sterker nog, we ontdekten onlangs dat liganden een belangrijke drijf tand waren voor resistentie tegen HER2-gerichte remmers, maar dat deze effecten konden worden gemoduleerd door de ECM5. Een verscheidenheid van cellen, met inbegrip van primaire cellen en cellijnen afgeleid van verschillende celtypen, waaronder Long, blaas, prostaat, borst en alvleesklier, evenals geïnduceerde pluripotente stam (iPS) cellen, zijn met succes gekweekt op het MEMA platform (Zie voorbeelden in de referenties5,7en14). Het gebruik van verschillende vlekken zorgt voor de uitlezen van meerdere cellulaire eindpunten, met inbegrip van celgroei, differentiatie, en metabolisme. Andere onderzoekers hebben het platform uitgebreid om de impact van stijfheid of elastische modulus te ondervragen, wat een extra dimensie toevoegt aan het MEMA-platform15. Tot slot, het platform is vatbaar voor het uitvoeren van drug schermen voor de identificatie van micro-omgeving voorwaarden die ofwel verbeteren of remmen van de werkzaamheid van het geneesmiddel, zoals wij en anderen hebben onlangs gemeld5,14,15 .
Misschien is de meest kritieke stap naar het succes van een MEMA-experiment het optimaliseren van de celplating dichtheid. Het optimaliseren van de dichtheid van de cellen zorgt ervoor dat er voldoende cellen aanwezig zijn om robuuste gegevens te leveren, maar niet zo veel dat de vlek te Confluent wordt. Confluente vlekken kunnen significant gevonden resultaten, met name als proliferatie wordt gebruikt als een eindpunt, waardoor het onmogelijk om te bepalen als lage proliferatie tarieven zijn het gevolg van interacties met micro-milieufactoren of als gevolg van de remming van de contactpersoon van hoge cellulaire dichtheid. Celtitratie-experimenten kunnen deze problemen onthullen, omdat gemiddelde celaantallen per vlek een lineaire toename met toenemend aantal cellen laten zien, maar uiteindelijk plateau zal worden. Het optimale celnummer moet worden gekozen in het lineaire bereik van de curve.
Zoals hierboven vermeld, is het MEMA-platform flexibel en kan het worden bereid op een verscheidenheid aan ondergronden met verschillende oppervlakken. Deze omvatten glazen glijbanen en multi wandplaat formaten. In onze ervaring, niet alle oppervlakte-chemici zijn vatbaar voor MEMA afdrukken, zoals we hebben waargenomen vlek loslating op sommige oppervlakken als gevolg van slechte adhesie eigenschappen en het onvermogen om celadhesie op andere hoge wrijvingsoppervlakken blokkeren. Bovendien vereist het wisselen tussen verschillende substraten het optimaliseren van buffer condities, omdat de prestaties van het printen met dezelfde printbuffer kunnen variëren afhankelijk van de Oppervlaktechemie.
De diameter van de gedrukte ECM-spots speelt een belangrijke rol in de kwaliteit van de gegevens. In het algemeen raden wij het gebruik van de grootste diameter print pinnen beschikbaar voor de arrayer in gebruik (we gebruiken momenteel 350 μm diameter pinnen). Grotere diameter plekken zorgen voor een groter aantal cellen om een plek te bezetten, die meestal resulteert in robuustere gegevens dan worden gegenereerd met kleinere diameter pinnen. Aangezien de binding van de cellen een stochastisch proces is, bestaat de neiging om een hoge mate van variabiliteit te zijn in de gegevens die verband houden met het aantal cellen dat oorspronkelijk aan elke plek is gekoppeld. Daarom raden we aan een groot aantal replicaties voor elke ECM-voorwaarde af te drukken. We printen 10 − 15 ECM-replicaties in elk goed met onze huidige afdruk condities om robuuste statistieken te garanderen.
We hebben opgemerkt in onze verleden experimenten die voor het grootste deel, ligand effecten neigen te domineren over ECM effecten. Dit kan deels te wijten zijn aan onze beslissing om collageen I toe te voegen aan alle ECM-spots, wat een robuuste celbinding garandeert. We geloven echter dat dit ook de ECM-effecten kan homogeniseren, omdat de meeste plekken de neiging hebben zich te gedragen op een manier die sterk vergelijkbaar is met collageen I. de plek samenstelling wijzigen om collageen uit te sluiten I kan leiden tot differentieel Celgedrag als gevolg van de interactie met de ECM, maar heeft ook een aanzienlijke invloed op de celbinding, wat resulteert in veel meer onbezette vlekken. Gebruikers moeten hun ECM-compositie aanpassen om deze verschillen in gedachten te houden, met name diegenen die geïnteresseerd zijn in stam-en voorlopercellen en differentiatie, waarbij de matrix een aanzienlijke invloed kan hebben16.
Meestal voeren we de MEMA-assays uit voor relatief korte perioden (bijv. maximaal 72 h). Dit is omdat de cellen worden beperkt tot de vlekken (de blokkerende buffer niet toestaan voor groei buiten de vlekken in onze ervaring). Met snel verdelen cellen, groei langer dan 72 h zal leiden tot overgroei van de plek, die op zijn beurt compliceert beeldsegmentatie als cellen worden druk en opstapelen op elkaar, en kan ook invloed hebben op gegevens als groei arrestatie kan optreden met contact remming. We hebben langere behandelingen uitgevoerd met zeer langzaam groeiende primaire cellen (10 − 14 dagen), maar voorzichtigheid moet in deze testen worden genomen om de media te veranderen en liganden elke 3 − 4 dagen aan te vullen.
Voortdurende inspanningen om het MEMA-platform te ontwikkelen zijn gericht op twee interessegebieden, maximalisatie van de optische kwaliteit voorbeeld vorming en optimalisatie binnen kleinere kweek schepen. Optische kwaliteit wordt een cruciale factor wanneer onderzoekers hogere resolutie microscopie vereisen om subcellulaire lokalisatie van hun markers van belang te identificeren. Eerste schermen kunnen worden uitgevoerd met een lagere resolutie op high-throughput microscopen gevolgd door beeldvorming van specifieke interessante plekken op hogere resolutie-instrumenten, maar de beeldkwaliteit kan worden aangetast als de optische eigenschappen van het substraat slecht zijn. Verbetering van de optische eigenschappen van de ondergrond zou onderzoekers in staat stellen om de eerste schermen op hoge resolutie imagingsystemen uit te voeren zonder de noodzaak om geselecteerde beelden bij een hogere resolutie opnieuw te verwerven. Ten slotte zou de mogelijkheid om Mema's uit te voeren in kleinere kweekvaten, zoals 96-well Plates, een afname van het behandelings volume en een uitbreiding van ondervragende liganden en replicaten mogelijk maken. Deze transitie vereist het optimaliseren van de substraat-buffer-eiwit interacties en array Printing binnen nieuwe kweekvaten. Dergelijke voortdurende inspanningen zullen het MEMA-platform verbeteren en zijn krachtige capaciteiten uitbreiden om relevante micro-milieu proteïnen te identificeren die cellulaire fenotypes voor verschillende celtypen veranderen, die vervolgens kunnen worden onderzocht in bevestigende assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NIH common Fund Library van Network Cellular signaturen (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H. en J. E. K).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| Vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
- Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
- Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
- Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , Report No. 820 (2013).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
- Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
- Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
- Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
