Summary
Formålet med metoden som presenteres her er å vise hvordan mikromiljøet Microarrays (MEMA) kan være fabrikkert og brukes til å forhøre virkningen av tusenvis av enkle Kombinatorisk microenvironments på fenotype av kulturperler celler.
Abstract
Forstå virkningen av mikromiljøet på fenotype av celler er et vanskelig problem på grunn av den komplekse blanding av både oppløselige vekstfaktorer og matrise-assosiert proteiner i mikromiljøet in vivo. Videre er lett tilgjengelige reagenser for modellering av microenvironments in vitro vanligvis bruk av komplekse blandinger av proteiner som er ufullstendig definert og lider fra parti til parti variasjon. Den mikromiljøet Microarray (MEMA) plattformen tillater vurdering av tusenvis av enkle kombinasjoner av mikromiljøet proteiner for deres innvirkning på mobilnettet fenotyper i en enkelt analysen. MEMAs er klargjort i brønn plater, som gjør det mulig å legge til individuelle ligander for å skille brønner som inneholder plassert ekstracellulære Matrix (ECM) proteiner. Kombinasjonen av løselig ligand med hver trykte ECM danner en unik kombinasjon. En typisk MEMA analysen inneholder større enn 2 500 unike Kombinatorisk microenvironments at cellene er eksponert for i en enkelt analysen. Som en test tilfellet var brystkreft cellelinjen MCF7 belagt på MEMA plattformen. Analyse av denne analysen identifiserte faktorer som både forsterke og hemme vekst og spredning av disse cellene. Den MEMA plattformen er svært fleksibel og kan utvides for bruk med andre biologiske spørsmål utover kreftforskning.
Introduction
Dyrking av kreftcelle linjer på plast i to-dimensjonale (2D) monolagere er fortsatt en av de store arbeidshester for kreft forskere. Imidlertid er mikromiljøet i økende grad blir anerkjent for sin evne til å påvirke mobilnettet fenotyper. I kreft, tumor mikromiljøet er kjent for å påvirke flere cellulære atferd, inkludert vekst, overlevelse, invasjon, og respons på terapi1,2. Tradisjonell monolag cellekulturer vanligvis mangler mikromiljøet påvirkninger, noe som har ført til utvikling av mer komplekse tredimensjonale (3D) analyser for å dyrke celler, inkludert kommersielt tilgjengelige renset kjeller membran ekstrakter. Men disse renset matriser er vanligvis komplisert å bruke og lider av tekniske problemer som batch variasjon3 og komplekse komposisjoner3. Som et resultat, kan det være vanskelig å tildele funksjon til bestemte proteiner som kan påvirke cellulære fenotyper3.
For å løse disse begrensningene har vi utviklet mikromiljøet Microarray (MEMA)-teknologi, som reduserer mikromiljøet ned til enkle kombinasjoner av ekstracellulære Matrix (ECM) og løselig vekstfaktor proteiner4,5 . MEMA-plattformen muliggjør identifisering av dominerende microenvironmental faktorer som påvirker virkemåten til celler. Ved å bruke et array-format, kan tusenvis av kombinasjoner av mikromiljøet faktorer bli analyseres i et enkelt eksperiment. Den MEMA beskrevet her interrogates ~ 2 500 forskjellige unike mikromiljøet forhold. ECM proteiner trykt inn i brønn platene danner vekst pads på hvilke celler kan være kultivert. Oppløselige ligander legges til individuelle brønner, og skaper unike Kombinatorisk microenvironments (ECM + ligand) på hvert annet sted som cellene utsettes for. Celler er kultivert i flere dager, deretter fast, beiset, og avbildet å vurdere cellulære fenotyper som følge av eksponering for disse spesifikke mikromiljøet kombinasjoner. Siden microenvironments er enkle kombinasjoner, er det enkelt å identifisere proteiner som driver store fenotypiske endringer i cellene. MEMAs har blitt brukt med hell for å identifisere faktorer som påvirker flere cellulære fenotyper, inkludert de som driver celle skjebne beslutninger og respons på terapi4,5,6,7. Disse svarene kan valideres i enkle 2D eksperimenter og kan deretter vurderes under forhold som mer fullstendig recapitulate kompleksiteten i tumor mikromiljøet. MEMA-plattformen er svært tilpasningsdyktig til en rekke celletyper og endepunkter, forutsatt at gode fenotypiske biomarkører er tilgjengelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: En oversikt over hele MEMA-prosessen, inkludert estimert tid, er beskrevet i flytskjemaet som vises i figur 1. Denne protokollen detaljer fabrikasjon av MEMAs i 8-brønn plater. Protokollen kan tilpasses andre plater eller lysbilder.
1. utarbeidelse av protein, fortynningsmiddel og farge buffere
- Likevekt hetteglass med ECMs, ligander og cytokiner til romtemperatur (RT) og kort sentrifuge. Legg til riktig volum av riktig RT-buffer som angitt i produktdata arket. Følg produsentens anbefaling for lager konsentrasjoner.
Merk: En fullstendig liste over ligander og ECMs med deres lager og endelige konsentrasjoner er gitt i tabell 1 og tabell 2. Både ligander og ECMs brukes vanligvis på den høyeste konsentrasjonen av området anbefalt av produsenten som utløser en biologisk effekt i standard 2 dagers kultur analyser. Håndter proteiner forsiktig og i biosafety skap under laminær strømning for å unngå forurensning. - Ruge hetteglass med skånsom rocking ved RT for 1 time. Ikke Vortex proteiner, da dette kan føre til at de denaturere.
- Alikvot proteiner for langtidslagring, slik at alle alikvoter er engangsbruk for å unngå degradering med gjentatte fryse/tine sykluser. Oppbevar lyofilisert proteiner ved-80 ° c (med mindre annet er spesifisert) til det er nødvendig. Vær forsiktig med å samle alle metadata for fremtidig referanse, for eksempel: (i) protein navn, (II) dato forberedt, (III) partinummer, (IV) leverandør, (v) katalognummer, (vi) konsentrasjon, (VII) volum, og (VIII) klargjøreren.
- Klargjør fortynnings buffer som inneholder 20% (v/v) glyserol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2, og filter sterilisering. Hold denne bufferen sterilt og oppbevar på RT.
- Klargjør farge buffer som inneholder 2% (w/v) BSA, 1 mM MgCl2og 0,02% Nan3 i fosfat-BUFRET saltvann (PBS). Filtrer og oppbevar ved 4 ° c.
2. utarbeidelse av en ECM kilde plate
- Fjern aliquoted bestander av ECM proteiner som skal trykkes og tine på is. Registrer alle partinumre for sporing av metadata.
- Flick rør av tint proteiner forsiktig for å sikre riktig blanding og spinne ned i en sentrifuge.
-
Gjør ECM print blandinger (EPMs) og et fluorescerende fiducial som skal brukes av en flytende håndtering robot som vil skape randomiserte 384-brønn kilde plater.
Merk: 384 kilde platene vil bli brukt av en touch PIN array skriver for å lage den trykte arrays i 8 brønn plater.- Label 1,5 mL mikrosentrifugen rør for hver EPM og fiducial.
- Forbered hver EPM ved å kombinere 125 μL av fortynnings buffer (se trinn 1,4) med riktig volum av ECM-lager og Bring blandingen opp til et total volum på 250 μL med PBS. De endelige konsentrasjonene i hvert EPM-rør vil være 1x ECM-protein, 5 mM EDTA, 10% glyserol og 100 mM Tris.
- Klargjør et fluorescerende fiducial ved å oppløse det i riktig buffer som er spesifisert av produsenten, og Overfør 250 μL til et merket fiducial rør.
3. opprettelse av kildeplaten ved hjelp av en flytende handler
- Design en 384-brønn plate layout som randomizes opprettingstidspunkt posisjonene til ECMs og er optimalisert for array skriveren PIN hodet som brukes. Utform plasseringen av fiducial slik at den blir skrevet ut i rad 1, kolonne 1-posisjonen for hver brønn for å bistå i array orientering.
Merk: Totalt 14 − 15 replikerer av hver ECM brukes for å sikre robuste data. Inkluder ytterligere replikerer av kollagen eller en annen ECM som gir robust vedlegg for vurdering av enhetlig binding. Oppsettet må kanskje bruke flere 384-brønn plater avhengig av antall ECMs av interesse. - Overfør EPM-rør til en flytende handler, og hold rørene ved 4 ° c enten med et avkjølt slange stativ eller ved å bruke en væske håndterings robot som befinner seg i et kaldt rom.
- Bruk programvaren for flytende handler til å kjøre et program for å overføre 15 μL av hver EPM og fiducial til de forhåndsbestemt brønnene i 384 kildeplaten (e).
- Pipet PBS i alle ubrukte brønner for å øke luftfuktigheten og beskytte mot uttørking under utskriftsprosessen.
Merk: Se figur 2 for et eksempel på en 384-brønn kilde plate sett som er optimalisert for en 4 x 7 PIN hodet og inkluderer et kollagen jeg BLOKKERE og PBS. - Tetningsplate (r) og oppbevares ved 4 ° c til den er klar til utskrift.
4. utskrift MEMAs bruke en array utskrift robot
Merk: Følgende del av protokollen beskriver spesielt utarbeidelse og bruk av MEMA å undersøke virkningen av ulike mikromiljøet proteiner på vekst og spredning av MCF7 celler. Protokollen kan imidlertid enkelt tilpasses til å bruke forskjellige ligander, ECMs og celler til å studere andre cellelinjer og endepunkter av interesse.
-
Ved hjelp av en touch PIN skriver, skrive EPMs og fiducial flekker i 8 brønn plater. Skriv ut flere replikerer av hver ECM-betingelse for å sikre reproduserbarhet.
Merk: andre plateformater eller lysbilder kan brukes for utskrift, men buffer optimalisering kan være nødvendig for å oppnå optimal flekk dannelse.- Skriv ut ECMs for MEMA med 350 μm diameter pinner arrangert i en 4 x 7 skrivehodet konfigurasjon. Skriv ut arrays i 8-brønn plater som 20 kolonner med 35 rader, for totalt ~ 700 flekker. Større matriser er mulig i disse platene, men kommer med en trade-off av økt kanteffekter i både celle binding og farging.
- Etter utskrift lagres platene i en desikator i minst 3 dager før bruk.
5. opprettelse av ligand Treatment plater
- Design en 96-brønn plate layout inkludert ligander av interesse. For å lette behandlingen av mange MEMA plater på en gang, designe denne platen med mellomrom som gjør det mulig for bruk av en multi-kanals Pipet med 4 linjeavstand tips for å overføre væsker mellom brønnene av 8-brønn MEMAs og en 96-brønn plate.
Merk: I denne protokollen benyttes hele settet med ligander som er oppført i tabell 2 . - Tin ligander på is. Knips kort og snurr ned hvert rør.
- Fortynne ligander å en 200x arbeider lager benytter fabrikanten ' anbefalt buffer (karakteristisk PBS).
- Pipet 10 μL av hver 200x ligand lager i tilsvarende brønn innenfor 96-brønn platen.
- Tetnings-og lager plater ved-20 ° c.
Merk: Lag ligand behandling plater i grupper, fange alle metadata for nedstrøms analyse.
6. dyrking celler på MEMAs
- Blokker MEMAs i 20 minutter med 2 mL per brønn for blokkering av ikke-forurensning buffer som inneholder 1% ikke-smuss blokkerings middel (tabell av materialer) i dobbelt destillert vann (ddH2O).
- Aspirer blokkerende buffer og trippel skylle brønner med PBS. For å unngå uttørking, la endelig volum av PBS i brønner til klar for celle plating.
Merk: Det er svært nyttig å ha to benk arbeidere for cellekultur trinn på MEMAs. En benk arbeideren kan utføre aspirasjon trinn, mens den andre utfører tillegg trinn. Det anbefales å bruke en 1 mL flerkanals Pipet med tips linjeavstand for å matche 8-brønn platen for pipettering og en Y-splitter med to Pasteur-Pipetter for å aspirer flere brønner samtidig. - Seed 2 x 105 MCF7 celler per brønn i 2 ml Dulbecco er modifisert Eagle ' s medium (DMEM) medium som inneholder 10% fosterets storfe serum (FBS).
Merk: Før en full MEMA eksperiment, utføre et celle titrering eksperiment for å optimalisere celle tall slik at MEMA flekker har høye celle tall (men er ikke confluent) på slutten av ønsket eksperimentell varighet. - Etter 2-18 t av vedheft, aspirer medium og erstatte med 2 mL redusert vekstmedium (DMEM med 0,1% FBS).
Merk: Redusert serum (f. eks 0,1% FBS) eller vekstfaktor-utarmet forhold kan brukes på dette tidspunktet for å isolere den stimulerende virkningen av spesifikke ligander. - Tin en ligand behandlings plate på is. Sentrifuger tint plate ved 200 x g i 1 min.
- Overfør 200 μL av medium fra hver brønn i kultur platen til riktig brønn i behandlings platen. Pipet opp og ned for å blande ligand volum med medium og overføre denne blandingen tilbake til riktig brønn i MEMA plate.
- Lett rock for hånd og returnere MEMA plater til inkubator. Kultur for varigheten av eksperimentet i nærvær av ligand/ECM kombinasjon ved 37 ° c og 5% CO2.
Merk: En typisk MEMA eksperimentet går for 72 h; Eksperimenter med lengre varighet kan kreve utskifting av medium og re-behandling med ligand. - Puls MEMA brønner ved 71 h med 100 ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) for en endelig konsentrasjon på 10 μM. ruge i eksperimentelle forhold med EdU for 1 time ved 37 ° c og 5% CO2.
Merk: Andre levende celle behandlinger kan også brukes på dette tidspunktet.
7. festing og farging MEMAs
- Etter 72 h og eventuelle levende celle behandlinger, aspirer brønner. Fix MEMAs i 2 mL per brønn på 2% paraformaldehyde (PFA) for 15 min ved RT.
- Aspirer PFA. Permeabilize med 2 mL per brønn på 0,1% ioniske overflateaktivt middel i 15 min.
- Aspirer ioniske overflateaktivt middel og vask med 2 mL per brønn av PBS. Aspirer PBS. Vask med 2 mL PBS med 0,05% polysorbat 20 (PBS-T).
Merk: MEMA overflate er hydrofobe, og unnlatelse av å vaske med PBS-T før flekken og antistoff inkubasjons vil resultere i dannelse av hulrom i brønner under inkubasjons trinn og gi opphav til farging gjenstander. - Aspirer PBS-T. Søk etter reaksjons reagenser til EdU. Ruge for 1 time ved RT, rocking og beskyttet mot lys. Etter 1 h inkubasjons, slukke reaksjon med den med følgende kommersielle slukke buffer.
Merk: EdU deteksjon og farging/antistoff trinn kan utføres i 1,5 mL per brønn for å redusere kostnadene. - Aspirer slukke bufferen og vask med PBS-T før incubating med flekker eller antistoffer.
- Ruge MEMA brønner med antistoffer mot histone H3K9me3 (1:1000) og fibrillarin (1:400) i farge buffer som inneholder 2% (w/v) storfe serum albumin (BSA), 1 mM MgCl2 og 0,02% Nan3 over natten ved 4 ° c.
Merk: Utfør antistoff titreringer for å bestemme optimale konsentrasjoner før du bruker dem på et fullt MEMA-sett. - Etter primær antistoff eller beis inkubasjons, vask brønner 2x med PBS og en gang med PBS-T.
- Tilsett sekundære antistoffer (esel anti-mus IgG og esel anti-kanin IgG, både 1:300) og 0,5 μg/mL 4 ' 6 ‐ diamidino ‐ phenylindole (DAPI). Ruge for 1 time ved RT i mørket.
- Vask brønner 2x med 2 mL per brønn av PBS, slik at de i siste 2 mL PBS.
- Fortsett til Imaging eller lagre beiset MEMAs for senere Imaging i PBS ved 4 ° c beskyttet mot lys.
8. avbildning av MEMAs
- Image MEMA på en automatisert Imaging system med passende fluorescerende deteksjon kanaler.
- Utdata resulterende bildedata til et bildebehandlingssystem. Segmentere celler og beregne intensitet nivåer ved hjelp CellProfiler8.
9. data analyse
Merk: Dataanalyse består av normalisering, variasjon korreksjon og oppsummering av rå CellProfiler avledet data. I dette tilfellet brukes R-miljøet med egendefinert kode til å utføre alle trinnene. Imidlertid, alle statistisk omgivelsene eller programvareprogram kan anvende å utføre det tilsvarende aksjonene. Et eksempel på den egendefinerte koden for åpen kildekode for R-miljøet for analyse er tilgjengelig på: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
- Forhåndsbehandle og normalisere de segmentert bildedataene.
- Bestem antall spot celler ved hjelp av DAPI fargede kjerner.
- Automatisk port EdU-intensitet for å merke celler som EdU+. Mål spredning ved hjelp av andelen EdU+ celler på hvert sted.
- Median oppsummerer cytoplasmatiske flekker og kjernefysiske morfologi målinger på spot nivå.
- Utføre fjerning av uønsket variasjon (RUV) normalisering på dataene for å forbedre datakvaliteten9.
Merk: Denne tilnærmingen er brukt på hver intensitet og morfologi signal uavhengig som en matrise med matriser ved hjelp av rader og flekker som kolonnene som er beskrevet tidligere9. - Påfør bivariate loess normalisering til RUV normalisert rester bruker array rad og array kolonne som de uavhengige variablene å korrigere for romlig eller intensitet relaterte effekter.
- Når normalisering er fullført, kan median oppsummere de replikerer for hver mikromiljøet betingelse for rapportering og videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å forenkle microenvironmental virkninger på cellevekst og spredning, og for å identifisere forhold som fremmet eller hemmet cellevekst og spredning, brystkreft cellelinjen MCF7 ble sådd på et sett av åtte 8-brønn MEMAs som beskrevet i protokollen. Denne analysen eksponert cellene til 48 forskjellige ECMs og 57 forskjellige ligander, for totalt 2736 Kombinatorisk microenvironmental forhold. Etter 71 i kultur var celler pulserende med EdU, fast, permeablized og farget med DAPI, reaksjonen for EdU-deteksjon, et anti-fibrillin antistoff og et anti-H3K9me3-antistoff. Celler ble avbildet på et mikroskop med høyt innhold. Bildene ble lastet opp til en Omero Server10, segmentert med CellProfiler8, og normalisert og analysert i R9. Resultatene som er beskrevet under fokuserer på DAPI-og EdU-signalene.
Bildet analyse plattformen av MEMAs gir noen resultater som ligner de som er tilgjengelige fra flyt flowcytometri tilnærminger, for eksempel DNA-innhold tomter viser 2N og 4N fraksjoner for celler behandlet med en gitt ligand (Figur 3a), basert på DAPI intensitet og areal. Disse plott gi bevis for forhold som fremmer aktiv celle sykling versus som indikert av klare bimodal topper tilsvarende celler i G1 eller G2 faser kontra vekst arrestert celler, som ville vise endringer i toppene i forhold til kontroll forhold. Vi bruker celle nummer og farging intensitet data for å oppsummere data, der virkningen av mikromiljøet (ligander på én akse, ECM på den andre aksen) på både celle nummer (Figur 3B) og EdU innlemmelse (Figur 3C) kan lettere oppfattes som endringer i heatmap farge og intensitet. Som sett fra disse tomter, mange av effektene er ligand-drevet, som ECM tilstand ikke sterkt påvirke celle nummer eller EdU positivitet. Nidogen-1 er et klart unntak, som tilstedeværelsen av dette ECM-molekylet hemmer celle binding og vekst av MCF7. Ligander som FGF6 og NRG1α (NRG 1,1 på tomter) forbedre celle nummer og har høy forekomst av EdU innlemmelse, mens ligander som AREG og NRG1-smdf (NRG 1.10 på tomter) hemme celle binding og/eller vekst av celler. Disse funnene er støttet av bilder av cellene vokser på flekkene, der en klar forskjell i celle nummer og EdU positivitet er tydelig (se eksempel i Figur 3D).
Siden MEMA-plattformen er en nyere teknologi, ble resultatene validert i separate analyser. MCF7 celler ble sådd i 24-brønn plater belagt med kollagen jeg i DMEM medium med 10% FBS. Etter 18 timer ble mediene utvekslet med redusert vekstmedium (DMEM med 0,1% FBS) og celler ble behandlet med NRG1α, FGF6 eller AREG og kultivert for 72 h. EdU ble lagt til 1 time før fiksering. Celler ble farget med DAPI og for EdU innlemmelse, avbildet, segmentert, og analysert. I likhet med resultatene innhentet fra MEMA plattformen, FGF6 og NRG1α begge ga opphav til høyere celle tall (Figur 4A) og EdU innlemmelse priser (Figur 4B) sammenlignet med AREG behandlede celler, validere våre observasjoner i de originale MEMA-eksperimentene.
Figur 1 : Flytskjema som viser arbeidsflyten og tidslinjen for de ulike fasene i et typisk MEMA-eksperiment. Når MEMAs er trykt, kan de lagres ved romtemperatur desiccated i flere måneder før bruk. Vanligvis varer den eksperimentelle fasen 3 − 4 dager, men noen sakte voksende primær celler har blitt kultivert på MEMAs i opptil 2 uker. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : ECM kilde plate layout for array utskrift. Kollagen blokken er trykt på MEMA som et rutenett, som gir en svært repeterende sett av forhold som gir mulighet for mer robust normalisering mellom brønnene. PBS-fylte brønner gir fuktighet til hjelp i forebygging av fordampning under utskriftsprosessen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Eksempler på data generert fra et typisk MEMA-eksperiment. (A) celle syklus profiler av binned DAPI intensitet verdier versus celle teller fra en 8-brønn plate behandlet med ulike ligander, viser bifasisk DAPI intensitet farging indikerer celler i G1 versus G2 celle syklus fase. (B) heatmap som viser normalisert spot celle tellinger gruppert etter likhet ved hjelp av hierarkisk gruppering. Rødt angir høyere celle tall, og blått er lavere celle tall. Ligander er på x-aksen, ECMs er på y-aksen. (C) heatmap viser normalisert edu-innlemmelse, med rødt som indikerer høyere og blått, noe som indikerer lavere EdU-innlemmelse. Ligander er på x-aksen, ECMs er på y-aksen. (D) eksempel på MCF7-celler som vokser på et MEMA-punkt behandlet med NRG1-α, som viser høy forekomst av EdU-innlemmelse (rosa kjerner). Grønn flekk er celle maske og blå er DAPI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Validering av MEMA-resultater i cellekultur. (A) kvantifisering av celle tall som følge av behandling av MCF7 med ulike ligander. Tilsvarende antall MCF7 celler ble belagt i multiwall plater deretter behandlet med enten AREG, FGF6 eller NRG1α. Wells behandlet med AREG hadde signifikant færre celler enn de som ble behandlet med FGF6 (* * indikerer studentens t-test p-verdier mindre enn 0,01) eller NRG1α (* indikerer en p-verdi på 0,05) ved 72 h post ligand behandling. (B) kvantifisering av nivået av EdU-INNLEMMELSE i MCF7 på grunn av behandling med forskjellige ligander, som i panel A. AREG behandling resulterer i en signifikant lavere andel av celler som innlemmer EdU enn celler behandlet med FGF6 (* *, p < 0,01) eller NRG1α (* * *, p = 0,01). Feilfelt representerer standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Protein navn | Uniprot-ID | Lager Konsentrasjon (μg/mL) |
Endelige Konsentrasjon (μg/mL) |
| ANGPT1 | 1 | Q15389 | 1 | 100 | 0,04 |
| ANGPT2 | 1 | O15123 | 1 | 100 | 0,2 |
| Areg | P15514 | 100 | 0,02 |
| BMP2 | P12643 | 100 | 0,1 |
| BMP3 | P12645 | 1000 | 0,1 |
| BMP4 | P12644 | 100 | 0,1 |
| BMP5 | 1 | P22003 | 1 | 100 | 0,1 |
| BMP6 | P22004 | 100 | 0,1 |
| BMP7 | P18075 | 100 | 0,1 |
| CSF2 | P04141 | 100 | 0,02 |
| CTGF | 1 | P29279 | 1 | 100 | 0,05 |
| CXCL12 | Alpha | P48061 | 2 | 100 | 0,01 |
| CXCL12 | Beta | P48061 | 1 | 100 | 0,03 |
| CXCL1 | P09341 | 100 | 0,004 |
| CXCL8 | 1 | P10145 | 1 | 100 | 0,3 |
| DLL1 | 1 | O00548 | 1 | 500 | 0,5 |
| DLL4 | Q9NR61 | 200 | 0,6 |
| EGF | 1 | P01133 | 1 | 500 | 0,01 |
| FASLG | 1 | P48023 | 1 | 10 | 0,02 |
| FGF2 | 3 | P09038 | 2 | 100 | 0,01 |
| FGF6 | P10767 | 100 | 0,01 |
| FLT3LG | 1 | P49771 | 1 | 50 | 0,001 |
| GPNMB | 1 | Q14956 | 1 | 100 | 0,5 |
| HGF | 1 | P14210 | 1 | 50 | 0,04 |
| IGF1 | 1 | P05019 | 1 | 200 | 0,01 |
| IGFBP2 | P18065 | 100 | 0,05 |
| IGFBP3 | 1 | P17936 | 1 | 100 | 0,1 |
| IL13 | P35225 | 100 | 0,01 |
| IL15 | IL15S48AA | P40933 | 1 | 50 | 0,01 |
| IL1B | P01584 | 25 | 0,001 |
| IL6 | P05231 | 100 | 0,01 |
| IL7 | 1 | P13232 | 1 | 100 | 0,01 |
| JAG1 | 1 | P78504 | 1 | 200 | 0,5 |
| JAG2 | Lang | Q9Y219 | 1 | 100 | 0,5 |
| KITLG | 1 | P21583 | 1 | 100 | 0,005 |
| KNG1 | HMW | P01042 | 1 | 100 | 0,2 |
| LEP | P41159 | 1000 | 0,002 |
| LYVE1 | Q9Y5Y7 | 100 | 0,05 |
| NRG1 | 10 | Q02297 | 10 | 100 | 0,01 |
| NRG1 | 1 | Q02297 | 1 | 100 | 0,05 |
| NRG1 | 6 | Q02297 | 6 | 100 | 0,01 |
| PDGFAB | go1990265 | 100 | 0,05 |
| PDGFB | 1 | P01127 | 1 | 100 | 0,05 |
| Ptn | P21246 | 100 | 0,5 |
| Hysj | Q15465 | 100 | 0,5 |
| TGFB1 | | Cterminus | P01137 | Cterminus | 20 | 0,01 |
| TGFB1 | | Fanget | P01137 | Fanget | 100 | 0,15 |
| TGFB2 | A | P61812 | 1 | 20 | 0,01 |
| THPO | 1 | P40225 | 1 | 50 | 0,002 |
| TNFRSF11B | O00300 | 100 | 0,02 |
| TNFSF11 | 1 | O14788 | 1 | 100 | 0,01 |
| Tnf | P01375 | 100 | 0,01 |
| VEGFA | VEGF206 | P15692 | 1 | 100 | 0,01 |
| WNT10A | Q9GZT5 | 100 | 0,1 |
| WNT3A | 1 | P56704 | 1 | 200 | 0,1 |
| Wnt5a | 1 | P22725 | 1 | 100 | 0,1 |
Tabell 1: den fullstendige listen over ligander som brukes for MEMA-eksperimenter. Uniprot-ID, lager konsentrasjoner og endelige arbeids konsentrasjoner er gitt.
| ECM protein | UniprotID | Stock konsentrasjon (μg/mL) |
Endelige Konsentrasjon (μg/mL) |
Notater |
| ALCAM | 1 | Q13740 | 1 | 100 | 30 | |
| CDH20 | Q9HBT6 | 300 | 80 | |
| CDH6 | 1 | P55285 | 1 | 100 | 40 | |
| CDH8 | P55286 | 100 | 20 | |
| CD44 | 1 | P16070 | 1 | 100 | 30 | |
| CEACAM6 | P40199 | 100 | 30 | |
| COL1A1 | P02453 | 5000 | 200 | flere under enheter med flere uniprot IDer |
| COL2A1 | 2 | P02458 | 2 | 1000 | 200 | |
| COL3A1 | 1 | P02461 | 1 | 1000 | 200 | |
| COL4A1 | 1 | P02462 | 1 | 1000 | 200 | flere under enheter med flere uniprot IDer |
| COL5A1 | P20908 | 1000 | 200 | |
| COL23A1 | 1 | Q86Y22 | 1 | 200 | 80 | |
| DSG2 | Q14126 | 100 | 30 | |
| CDH1 | 1 | P12830 | 1 | 100 | 40 | |
| ECM1 | 1 | Q16610 | 1 | 100 | 40 | |
| FN1 | 1 | P02751 | 1 | 1000 | 200 | |
| GAP43 | 1 | P17677 | 1 | 158 | 40 | |
| HyA-500K | 1000 | 200 | LOR-0005 | |
| HyA-50K | 1000 | 200 | LOR-0007 | |
| ICAM1 | P05362 | 400 | 80 | |
| ALCAM | 1 | Q13740 | 1 | 100 | 30 | |
| CDH20 | Q9HBT6 | 300 | 80 | |
| CDH8 | P55286 | 100 | 20 | |
| CD44 | 1 | P16070 | 1 | 100 | 30 | |
| CEACAM6 | P40199 | 100 | 30 | |
| DSG2 | Q14126 | 100 | 30 | |
| CDH15 | P55291 | 100 | 20 | |
| VCAM1 | 1 | P19320 | 1 | 1000 | 200 | |
| LAMA1 | P25391 | 500 | 200 | flere under enheter med flere uniprot IDer |
| LAMA3 | 2 | Q16787 | 2 | 130 | 40 | |
| Lum | P51884 | 200 | 80 | |
| CDH15 | P55291 | 100 | 20 | |
| NID1 | 1 | P14543 | 1 | 100 | 9,3 μg/mL nid, 130 μg/mL lam, 46,5 μg/mL KOL4 | + KOL4 og laminin |
| OMD | Q99983 | 100 | 40 | |
| SPP1 | A | P10451 | 1 | 100 | 40 | |
| CDH3 | 1 | P22223 | 1 | 100 | 40 | |
| PECAM1 | Lang | P16284 | 1 | 150 | 40 | |
| TNC | 1 | P24821 | 1 | 500 | 200 | |
| VCAM1 | 1 | P19320 | 1 | 1000 | 200 | |
| VTN | P04004 | 100 | 40 | |
| Bgn | P21810 | 100 | 40 | |
| DCN | A | P07585 | 1 | 300 | 80 | |
| POSTN | 1 | Q15063 | 1 | 100 | 40 | |
| Sparc | P09486 | 100 | 40 | |
| THBS1 | 1 | P07996 | 1 | 100 | 40 | |
| BKAN | 1 | Q96GW7 | 1 | 100 | 40 | |
| ELN | 3 | P15502 | 3 | 1000 | 200 | |
| FBN1 | P35555 | 254 | 80 |
Tabell 2: den fullstendige listen over ECM-proteiner og-tilstander som brukes i MEMA-eksperimentene. Uniprot-ID, lager konsentrasjoner og endelige arbeids konsentrasjoner er gitt. I noen tilfeller representerer den utskrevne betingelsen et protein kompleks eller en kombinasjon av flere proteiner, som er angitt i Notes-kolonnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydningen av "dimensionality" og kontekst har vært en motiverende faktor i utviklingen av in vitro kultur systemer som verktøy i karakterisering av kreftceller gjennom deres interaksjon med mikromiljøet11, og evnen til in vitro kultur systemer for å etterligne in vivo-miljøet er en drivkraft bak jakten på å forbedre disse kultur systemene. In vitro-systemer, derimot, er fortsatt betydelige verktøy for kreftforskning nettopp på grunn av deres evne til å brenne den komplekse in vivo situasjonen ned til en forenklet modell12.
Selv om 2D-systemer kan inkludere ECMs og ligander, har de tradisjonelt manglet gjennomstrømningen kapasitet til å forhøre et bredt panel av Kombinatorisk pertubagens. Populære kommersielle kjeller membran ekstrakter tillate dyrking i 3D, men mangler proveniens av en nøye definert panel av proteiner. De kommersielle ekstrakter vanligvis lider av ufullstendig definert sammensetning, som kan forvirre analyse og resultere i betydelige batch-til-batch variasjon3,13. Den MEMA plattformen overvinner disse barrierene, slik at for studiet av endringer i mobilnettet fenotyper, metabolsk aktivitet, differensiering status, og variasjoner i cellevekst og spredning som de er modulert av spesifikke og definerte endogene Faktorer.
MEMA-plattformen er en kraftig, middels til høykapasitets tilnærming for å vurdere virkningen av mikromiljøet (både ECM-og oppløselige faktorer) på fenotype av celler. Plattformen viser stor fleksibilitet for typene av analyser og celler som den kan utnyttes. Vi kan observere effekter fra både løselig ligander og ECM-proteiner som cellene utsettes for. Faktisk har vi nylig funnet ut at ligander var en viktig pådriver for resistens mot HER2-målrettede hemmere, men at disse effektene kan bli modulert av ECM5. En rekke celler, inkludert primær celler og cellelinjer avledet fra ulike celletyper, inkludert lunge, blære, prostata, bryst og bukspyttkjertel, samt indusert pluripotent stilk (iPS) celler, har blitt kultivert på MEMA plattformen (se eksempler i referanse5,7,14). Bruk av ulike flekker gir mulighet for avlesning av flere cellulære endepunkter, inkludert cellevekst, differensiering, og metabolisme. Andre forskere har utvidet plattformen til å forhøre virkningen av stivhet eller elastisk modul, og legger til en ekstra dimensjon til MEMA plattform15. Endelig er plattformen mottagelig for å utføre stoffet skjermer for identifisering av mikromiljøet forhold som enten forsterke eller hemme narkotika effekt, som vi og andre har nylig rapportert5,14,15 .
Kanskje det mest kritiske steget til suksessen til et MEMA eksperiment er å optimalisere celle plating tetthet. Optimalisere tettheten av cellene sikrer at nok celler er til stede for å gi robuste data, men ikke så mange at stedet blir altfor confluent. Confluent flekker kan signifikant forvirre resultater, spesielt hvis spredning brukes som et endepunkt, noe som gjør det umulig å fastslå om lave sprednings rater er et resultat av interaksjoner med microenvironmental faktorer eller på grunn av kontakt hemming fra høy cellulær tetthet. Eksperimenter med celle titrering kan avdekke disse problemene, da gjennomsnittlig celle tall per punkt vil demonstrere en lineær økning med økende antall celler belagt, men til slutt vil platå. Det optimale celle tallet bør velges i det lineære området av kurven.
Som nevnt ovenfor, er MEMA-plattformen fleksibel og kan tilberedes på en rekke underlag med forskjellige overflater. Disse inkluderer glass lysbilder og multiwall plateformater. I vår erfaring, ikke alle overflate kjemikalier er mottagelig for MEMA utskrift, som vi har observert flekk avløsning på noen flater på grunn av dårlig vedheft egenskaper og manglende evne til å blokkere celle vedheft på andre høy vedheft overflater. Videre kan endring mellom ulike underlag nødvendiggjør optimalisering av buffer forhold, ettersom ytelsen til utskriften med samme utskrifts buffer varierer avhengig av overflatekjemi.
Diameteren på de trykte ECM-plassene spiller en viktig rolle i kvaliteten på dataene. Generelt, anbefaler vi å bruke de største diameter print pins tilgjengelig for arrayer i bruk (vi bruker for tiden 350 μm diameter pins). Større diameter gjør at et større antall celler kan oppta et sted, noe som har en tendens til å resultere i mer robuste data enn det som genereres med pins med mindre diameter. Siden binding av cellene er en Stokastisk prosess, det har en tendens til å være en høy grad av variasjon i data som er relatert til antall celler opprinnelig festet til hvert sted. Derfor anbefaler vi at du skriver ut et stort antall replikeres for hver ECM-betingelse. Vi skriver ut 10 − 15 ECM-er replikerer i hver brønn med våre nåværende utskriftsforhold for å sikre robust statistikk.
Vi har bemerket i våre tidligere eksperimenter som for det meste, ligand effekter har en tendens til å dominere over ECM effekter. Dette kan være delvis på grunn av vår beslutning om å legge kollagen jeg til alle ECM flekker, noe som sikrer robust celle binding. Vi tror imidlertid at dette også kan homogenisere ECM-effektene, som de fleste steder har en tendens til å oppføre seg på en måte som er svært lik kollagen i. endring av spot sammensetningen for å utelukke kollagen jeg kan føre til differensial celle atferd som følge av samspillet med ECM, men også betydelig innvirkning celle binding, noe som resulterer i mange flere ledige plasser. Brukere bør skreddersy sin ECM sammensetning holde disse forskjellene i tankene, spesielt de som er interessert i stilk og stamceller og differensiering, hvor matrisen kan ha en betydelig innvirkning16.
Vi utfører vanligvis MEMA-analysene i relativt korte tidsperioder (for eksempel 72 h maksimum). Dette er fordi cellene er begrenset til flekker (den blokkerende buffer tillater ikke for vekst utenfor stedene i vår erfaring). Med raskt dele celler, vekst lengre enn 72 h vil føre til overvekst av stedet, som igjen kompliserer bilde segmentering som celler blir overfylt og hoper seg opp på hverandre, og kan også påvirke data som vekst arrestasjon kan oppstå med kontakt hemming. Vi har utført lengre behandlinger med svært trege voksende primær celler (10 − 14 dager), men det må utvises forsiktighet i disse analysene for å endre mediene og etterfylle ligander hver 3 − 4 dager.
Fortsetter arbeidet med å utvikle MEMA plattformen er fokusert på to områder av interesse, maksimering av den optiske kvaliteten for bildebehandling og optimalisering innen mindre kultur fartøy. Optisk kvalitet blir en avgjørende faktor når forskerne krever høyere oppløsning mikroskopi å identifisere subcellulære lokalisering av sine markører av interesse. Startskjermene kan utføres ved lavere oppløsning på høy gjennomstrømming mikroskop etterfulgt av Imaging av bestemte steder av interesse på høyere oppløsning instrumenter, men bildekvaliteten kan bli kompromittert hvis de optiske egenskapene til underlaget er dårlig. Forbedring av de optiske egenskapene til underlaget ville tillate forskere å utføre de første skjermene på høyoppløselige Imaging systemer uten behov for å gjenanskaffe valgte bilder ved høyere oppløsning. Til slutt, evnen til å utføre MEMAs i mindre kultur fartøy, for eksempel 96-brønn plater, ville tillate en reduksjon i behandlings volum og en utvidelse av avhørt ligander og replikerer. Denne overgangen krever optimalisering av substrat-buffer-protein interaksjoner og array utskrift innen nye kultur fartøy. En slik pågående innsats vil forbedre MEMA-plattformen og utvide sine kraftige evner for å identifisere relevante microenvironmental proteiner som endrer cellulære fenotyper for en rekke celletyper, som deretter kan undersøkes i bekreftende analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH Fellesfondet bibliotek av nettverk Cellular signaturer (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H., og J. K).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| Vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
- Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
- Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
- Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , Report No. 820 (2013).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
- Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
- Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
- Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
