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Cancer Research

कैंसर में सेलुलर Phenotypes पर Microenvironmental प्रभाव पूछताछ करने के लिए Microarrays का उपयोग

Published: May 21, 2019 doi: 10.3791/58957
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 2Quantitative Imaging Systems LLC

Summary

यहाँ प्रस्तुत विधि का उद्देश्य यह दिखाने के लिए है कि कैसे microenvironment microarrays (MEMA) गढ़ा जा सकता है और सुसंस्कृत कोशिकाओं के phenotype पर सरल combinatorial microenvironments के हजारों के प्रभाव से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया.

Abstract

कोशिकाओं के फीनोटाइप पर सूक्ष्म पर्यावरण के प्रभाव को समझना एक कठिन समस्या है क्योंकि विवो में सूक्ष्म पर्यावरण में घुलनशील विकास कारकों और मैट्रिक्स-संबद्ध प्रोटीन दोनों के जटिल मिश्रण के कारण एक कठिन समस्या है। इसके अलावा, इन विट्रो में microenvironments के मॉडलिंग के लिए आसानी से उपलब्ध अभिकर्मकों आम तौर पर प्रोटीन है कि अधूरी परिभाषित कर रहे हैं और बैच से बैच परिवर्तनशीलता से पीड़ित जटिल मिश्रण का उपयोग. microenvironment microarray (MEMA) मंच एक परख में सेलुलर phenotypes पर उनके प्रभाव के लिए microenvironment प्रोटीन के सरल संयोजन के हजारों के आकलन के लिए अनुमति देता है. MEMAs अच्छी तरह से प्लेटों में तैयार कर रहे हैं, जो व्यक्तिगत ligands के अलावा सरणी extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन युक्त कुओं को अलग करने के लिए अनुमति देता है. प्रत्येक मुद्रित ECM के साथ घुलनशील लिगंड का संयोजन एक अद्वितीय संयोजन रूपों. एक ठेठ MEMA परख से अधिक शामिल 2,500 अद्वितीय combinatorial microenvironments कि कोशिकाओं को एक परख में उजागर कर रहे हैं. एक परीक्षण के मामले के रूप में, स्तन कैंसर सेल लाइन MCF7 MEMA मंच पर चढ़ाया गया था. इस परख के विश्लेषण कारकों की पहचान की है कि दोनों को बढ़ाने और वृद्धि और इन कोशिकाओं के प्रसार को बाधित. MEMA मंच अत्यधिक लचीला है और कैंसर अनुसंधान से परे अन्य जैविक सवालों के साथ उपयोग के लिए बढ़ाया जा सकता है.

Introduction

दो आयामी (2 डी) monolayers में प्लास्टिक पर कैंसर सेल लाइनों की Culturing कैंसर शोधकर्ताओं के लिए प्रमुख workhorses में से एक बनी हुई है. हालांकि, microenvironment तेजी से सेलुलर phenotypes को प्रभावित करने की क्षमता के लिए मान्यता प्राप्त किया जा रहा है. कैंसर में, ट्यूमर microenvironment कई सेलुलर व्यवहार को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, विकास सहित, अस्तित्व, आक्रमण, और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया1,2. पारंपरिक monolayer सेल संस्कृतियों आम तौर पर microenvironment प्रभावों की कमी है, जो अधिक जटिल तीन आयामी (3 डी) assays के विकास के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए नेतृत्व किया है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्ध तहखाने झिल्ली अर्क सहित. हालांकि, इन शुद्ध matrices आम तौर पर उपयोग करने के लिए जटिल हैं और बैच परिवर्तनशीलता3 और जटिल रचनाओं3के रूप में तकनीकी समस्याओं से ग्रस्त हैं. परिणामस्वरूप, विशिष्ट प्रोटीनों को फ़ंक्शन असाइन करना कठिन हो सकता है जो कोशिकीय फीनोटाइप्स3को प्रभावित कर सकता है।

इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हमने माइक्रोएमेंटेरेन माइक्रोरेरे (एमईएमए) तकनीक विकसित की है, जोमाइक्रोएमेंटेंस को अपचारी मैट्रिक्स (ईसीएम) और घुलनशील वृद्धि कारक प्रोटीन 4, 5 के सरल संयोजन ों तक कम कर देता है। . MEMA मंच प्रमुख microenvironmental कारकों है कि कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित की पहचान सक्षम बनाता है. एक सरणी प्रारूप का उपयोग करके, microenvironment कारकों के संयोजन के हजारों एक ही प्रयोग में परख किया जा सकता है. यहाँ वर्णित MEMA 2,500 विभिन्न अद्वितीय microenvironment शर्तों पूछताछ. ईसीएम प्रोटीन अच्छी तरह से प्लेटों में मुद्रित विकास पैड जिस पर कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया जा सकता है फार्म. घुलनशील ligands व्यक्तिगत कुओं में जोड़ रहे हैं, प्रत्येक अलग जगह है जो कोशिकाओं को उजागर कर रहे हैं पर अद्वितीय combinatorial microenvironments (ECM + ligand) बनाने. कोशिकाओं को कई दिनों के लिए सुसंस्कृत कर रहे हैं, तो तय, दाग, और इन विशिष्ट microenvironment संयोजन के लिए जोखिम का एक परिणाम के रूप में सेलुलर phenotypes का आकलन करने के लिए छवि. चूंकि microenvironments सरल संयोजन कर रहे हैं, यह प्रोटीन है कि कोशिकाओं में प्रमुख phenotypic परिवर्तन ड्राइव की पहचान करने के लिए सीधा है. MEMAs सफलतापूर्वक कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि कई सेलुलर phenotypes को प्रभावित, उन है कि सेल भाग्य निर्णय ड्राइव और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया सहित4,5,6,7. इन प्रतिक्रियाओं को सरल 2 D प्रयोगों में मान्य किया जा सकता है और फिर उन परिस्थितियों में मूल्यांकन किया जा सकता है जो ट्यूमर माइक्रोएमेंम्पवायरन की जटिलता को फिर से दोहराते हैं। MEMA मंच अत्यधिक सेल प्रकार और समापन बिंदु की एक किस्म के लिए अनुकूल है, बशर्ते कि अच्छा phenotypic biomarkers उपलब्ध हैं.

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Protocol

नोट: अनुमानित समय सहित संपूर्ण MEMA प्रक्रिया का ओवरव्यू चित्र 1में दर्शाए गए प्रवाह आरेख में रेखांकित किया गया है। इस प्रोटोकॉल 8 अच्छी प्लेटों में MEMAs के निर्माण का विवरण. प्रोटोकॉल अन्य प्लेट्स या स्लाइड के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

1. प्रोटीन, Diluent, और दाग बफ़र्स की तैयारी

  1. कमरे के तापमान (आरटी) और संक्षेप में अपकेंद्रण के लिए ईकम, लिगन्ड, और साइटोकिन्स की समान शीशियों। उत्पाद डेटा पत्रक पर इंगित के रूप में उपयुक्त RT बफ़र का उपयुक्त वॉल्यूम जोड़ें। स्टॉक सांद्रता के लिए निर्माता की सिफारिश का पालन करें।
    नोट: अपने स्टॉक और अंतिम सांद्रता के साथ लिगन्ड्स और ईकम की एक पूरी सूची तालिका 1 और तालिका 2में प्रदान की गई है। दोनों ligands और ईकाम आम तौर पर मानक 2 दिन संस्कृति assays में एक जैविक प्रभाव प्राप्त करता है कि निर्माता द्वारा सिफारिश की सीमा के उच्चतम एकाग्रता पर उपयोग किया जाता है. संदूषण से बचने के लिए प्रोटीन को धीरे-धीरे और जैव सुरक्षा अलमारियाँ में लेमिनेटर प्रवाह के तहत संभालें।
  2. 1 एच के लिए आरटी पर कोमल रॉकिंग के साथ इनक्यूबेट शीशियों। भंवर प्रोटीन मत के रूप में यह उन्हें विकृत करने के लिए पैदा कर सकता है.
  3. लंबी अवधि के भंडारण के लिए अलीकोट प्रोटीन इतना है कि सभी alicots केवल दोहराया फ्रीज के साथ गिरावट से बचने के लिए एकल उपयोग कर रहे हैं / -80 डिग्री सेल्सियस पर lyophilized प्रोटीन स्टोर (जब तक अन्यथा निर्दिष्ट) जब तक की जरूरत है. भविष्य के संदर्भ के लिए सभी मेटाडेटा एकत्र करने का ध्यान रखें, जैसे: (i) प्रोटीन का नाम, (ii) तैयार की गई तारीख, (iii) बहुत/बैच संख्या, (iv) आपूर्तिकर्ता, (v) कैटलॉग संख्या, (vi) एकाग्रता, (vii) मात्रा, और (viii) तैयार करने वाला।
  4. 20% (v/v) ग्लिसरॉल, 10 एमएम एड्टा, 200 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 7.2, और फिल्टर स्टरलाइज़ युक्त डिलुएंट बफर तैयार करें। इस बफर बाँझ रखें और आरटी पर स्टोर करें।
  5. 2% (w/v) बीएसए, 1 एमएम एमजीसीएल2,और फॉस्फेट-बफर ेड नमकीन (पीबीएस) में 0.02% NaN3 युक्त धुंधला बफर तैयार करें। फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. एक ईसीएम स्रोत प्लेट की तैयारी

  1. ईसीएम प्रोटीन के अप्राप्त स्टॉक को हटा दें, जो बर्फ पर मुद्रित और थपने के लिए हैं। मेटाडेटा ट्रैकिंग के लिए सभी बहुत संख्याएँ रिकॉर्ड करें.
  2. थोड प्रोटीन की झाड़ ट्यूबों को धीरे से उचित resuspension सुनिश्चित करने के लिए और एक centrifuge में नीचे स्पिन.
  3. ECM प्रिंट मिश्रण (ईपीएम) और एक फ्लोरोसेंट fiducial एक तरल हैंडलिंग रोबोट है कि यादृच्छिक 384 अच्छी तरह से स्रोत प्लेटें पैदा करेगा द्वारा इस्तेमाल किया जा करने के लिए बनाओ.
    नोट:     384-वेल स्रोत प्लेट्स 8 अच्छी तरह से प्लेटों में मुद्रित सरणियों बनाने के लिए एक स्पर्श पिन सरणी प्रिंटर द्वारा इस्तेमाल किया जाएगा।
    1. प्रत्येक ईपीएम और परिद्युति के लिए लेबल 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब।
    2. प्रत्येक EPM को 125 डिग्री सेल्सियस के डिमूट बफर (ईसीएम स्टॉक की उचित मात्रा के साथ चरण 1-4) के संयोजन से तैयार करें और मिश्रण को PBS के साथ 250 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा तक लाएं। प्रत्येक EPM ट्यूब में अंतिम सांद्रता 1x ECM प्रोटीन, 5 एमएम EDTA, 10% ग्लिसरॉल, और 100 एमएम Tris होगा.
    3. निर्माता द्वारा निर्दिष्ट उपयुक्त बफर में भंग करके एक फ्लोरोसेंट विश्व्य तैयार करें और 250 डिग्री सेल्सियस को लेबल किए गए परिद्युद्युज्य नली में स्थानांतरित करें।

3. एक तरल हैंडलर का उपयोग स्रोत प्लेट का निर्माण

  1. एक 384-वेल प्लेट लेआउट डिज़ाइन करें जो ईकम के पदों को यादृच्छिक करता है और सरणी प्रिंटर पिन हेड के लिए ऑप्टिमाइज़ किया जाता है। यह सरणी अभिविन्यास में सहायता करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से की पंक्ति 1, स्तंभ 1 स्थिति में मुद्रित किया जाएगा ताकि fiducial की नियुक्ति डिजाइन.
    नोट: मजबूत डेटा सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक ECM की कुल 14 डिग्री 15 प्रतिकृतियां उपयोग की जाती हैं। कोलेजन या किसी अन्य ECM की अतिरिक्त प्रतिकृतियां शामिल करें जो बाध्यकारी की एकरूपता के आकलन के लिए मजबूत लगाव पैदावार करता है। लेआउट ब्याज की ईकम की संख्या के आधार पर कई 384 अच्छी प्लेटों का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है.
  2. एक तरल हैंडलर के लिए ईपीएम ट्यूब स्थानांतरण, या तो एक ठंडा ट्यूब रैक के साथ या एक ठंडे कमरे में स्थित एक तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब रखने।
  3. तरल हैंडलर सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, एक कार्यक्रम चलाने के लिए प्रत्येक EPM के 15 $L और 384-वेल स्रोत प्लेट (ओं) के भीतर predesignated कुओं के लिए fiducial हस्तांतरण.
  4. मुद्रण प्रक्रिया के दौरान नमी बढ़ाने और शुष्कता के खिलाफ गार्ड के लिए किसी भी अप्रयुक्त कुओं में पीबीएस पाइप।
    नोट: एक 4 x 7 पिन सिर के लिए अनुकूलित है और एक कोलेजन मैं ब्लॉक और PBS शामिल है एक 384-वेल स्रोत प्लेट सेट का एक उदाहरण के लिए चित्र 2 देखें।
  5. सील प्लेट (ओं) और मुद्रित करने के लिए तैयार जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

4. मुद्रण MEMAs एक सरणी मुद्रण रोबोट का उपयोग

नोट: प्रोटोकॉल के निम्नलिखित भाग विशेष रूप से तैयारी और MEMA के उपयोग के विकास और MCF7 कोशिकाओं के प्रसार पर विभिन्न microenvironment प्रोटीन के प्रभाव की जांच करने के लिए वर्णन करता है. हालांकि, प्रोटोकॉल आसानी से विभिन्न ligands, ईकामक, और कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए अन्य सेल लाइनों और ब्याज के समापन बिंदु का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. एक स्पर्श पिन प्रिंटर का उपयोग करना, 8 अच्छी तरह से प्लेटों में EPMs और fiducial स्पॉट प्रिंट. पुनरुत्पाद्यता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक ECM शर्त की एकाधिक प्रतिकृतियां मुद्रित करें।
    नोट:     अन्य प्लेट प्रारूपों या स्लाइड मुद्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन बफर अनुकूलन इष्टतम स्थान गठन प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
    1. एक 4 x 7 प्रिंट सिर विन्यास में व्यवस्थित 350 डिग्री व्यास पिन का उपयोग कर MEMA के लिए ECMs मुद्रित करें। 8-वेल प्लेट्स में 35 पंक्तियों द्वारा 20 कॉलम के रूप में सरणियों को मुद्रित करें, कुल $ 700 स्थानों के लिए. बड़ी सरणियां इन प्लेटों में संभव हैं, लेकिन दोनों सेल बाइंडिंग और धुंधला में वृद्धि हुई बढ़त प्रभाव के एक व्यापार बंद के साथ आते हैं.
  2. मुद्रण के बाद, उपयोग करने से पहले कम से कम 3 दिनों के लिए एक desicator में प्लेटें स्टोर.

5. लिगेन्ड उपचार प्लेट्स का निर्माण

  1. ब्याज के ligands सहित एक 96 अच्छी तरह से प्लेट लेआउट डिजाइन. एक बार में कई MEMA प्लेटों के उपचार की सुविधा के लिए, रिक्ति है कि 4 स्थान युक्तियाँ 8 अच्छी तरह से MEMAs और एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं के बीच तरल पदार्थ हस्तांतरण करने के लिए युक्तियों के साथ एक मल्टी चैनल पाइप के उपयोग के लिए अनुमति देता है के साथ इस प्लेट डिजाइन.
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, तालिका 2 में सूचीबद्ध ligands का पूरा सेट उपयोग कर रहे हैं.
  2. बर्फ पर थाव लिगन्ड। संक्षेप में झटका और प्रत्येक ट्यूब नीचे स्पिन.
  3. निर्माता की सिफारिश की बफ़र (आमतौर पर पीबीएस) का उपयोग कर एक 200x काम कर रहे शेयर करने के लिए लिगन्ड्स विलेय।
  4. 96-वेल प्लेट के भीतर संगत अच्छी तरह से में प्रत्येक 200x लिगन्ड स्टॉक के 10 डिग्री एल पाइप्ट।
  5. -20 डिग्री सेल्सियस पर सील और स्टोर प्लेटें।
    नोट: बैचेस में लिगन्ड ट्रीटमेंट प्लेट्स बनाएं, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए सभी मेटाडेटा कैप्चर कर लें.

6. एमईएम पर सेल की गणना

  1. 20 मिनट के लिए ब्लॉक MEMAs के साथ 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से गैर-fouling अवरुद्ध बफर युक्त 1% गैर-fouling अवरुद्ध एजेंट (सामग्री की तालिका) डबल-डिस्टिल्ड पानी में (ddH2O).
  2. पीबीएस के साथ बफर और ट्रिपल कुल्ला कुओं को अवरुद्ध करने वाले Aspirate. शुष्कता को रोकने के लिए, सेल चढ़ाना के लिए तैयार जब तक कुओं में पीबीएस के अंतिम मात्रा छोड़ दें।
    नोट: एमईएम पर सेल कल्चर स्टेप्स के लिए दो बेंच वर्कर्स होना बेहद मददगार है। एक बेंच कार्यकर्ता आकांक्षा कदम प्रदर्शन कर सकते हैं, जबकि दूसरा अतिरिक्त कदम करता है. यह एक बार में कई कुओं aspirate करने के लिए दो Pasteur pipettes के साथ एक वाई-स्प्लिटर के लिए 8 अच्छी तरह से प्लेट मैच के लिए स्थान युक्तियों के साथ एक 1 एमएल मल्टीचैनल पाइप्ट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है।
  3. बीज 2 x 105 MCF7 कोशिकाओं Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त 2 एमएल में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं.
    नोट: पूर्ण MEMA प्रयोग करने से पहले, सेल संख्याओं को अनुकूलित करने के लिए एक सेल अनुमापन प्रयोग करें ताकि एमईएमए स्पॉट में उच्च सेल संख्याएं हों (लेकिन वांछित प्रयोगात्मक अवधि के अंत में नहीं हैं)।
  4. आसंजन के 2 डिग्री 18 एच के बाद, aspirate मध्यम और कम विकास माध्यम के 2 एमएल के साथ की जगह (DMEM 0.1% FBS के साथ).
    नोट: कम सीरम (उदा., 0.1% FBS) या विकास कारक-depleted शर्तों इस समय विशिष्ट ligands के stimulatory प्रभाव को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. बर्फ पर एक लिगन्ड उपचार प्लेट थाव. 1 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज thawed प्लेट।
  6. संस्कृति की थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम से 200 डिग्री सेल्सियस को उपचार प्लेट में अच्छी तरह से उचित करने के लिए स्थानांतरित करें। मध्यम के साथ लिगंड मात्रा मिश्रण और MEMA प्लेट में अच्छी तरह से उचित अच्छी तरह से करने के लिए वापस इस मिश्रण हस्तांतरण करने के लिए ऊपर और नीचे पाइप.
  7. हाथ से हल्के रॉक और इनक्यूबेटर के लिए MEMA प्लेटें वापस. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2पर लिगन्ड/ईसीएम संयोजन की उपस्थिति में प्रयोग की अवधि के लिए संस्कृति।
    नोट: एक ठेठ MEMA प्रयोग 72 ज के लिए चलाता है; लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए लिगंड के साथ मध्यम और पुन: उपचार के प्रतिस्थापन की आवश्यकता हो सकती है।
  8. पल्स MEMA कुओं पर 71 एच के साथ 100x 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 $M. इनक्यूबेट के साथ प्रयोगात्मक स्थितियों में 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2.
    नोट: अन्य जीवित सेल उपचार भी इस समय इस्तेमाल किया जा सकता है.

7. फिक्सिंग और दाग MEMAs

  1. 72 ज और किसी भी जीवित सेल उपचार के बाद, aspirate कुओं. आरटी में 15 मिनट के लिए 2% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के प्रति 2 एमएल में एमईए को ठीक करें।
  2. Aspirate पीएफए. 15 मिनट के लिए 0.1% nonionic सर्फेक्टेंट की अच्छी तरह से प्रति 2 एमएल के साथ permebilize.
  3. nonionic सर्फैक्टेंट aspirate और पीबीएस के प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल के साथ धो लें. एश्पिरेट पीबीएस। 0.05% पॉलीसोर्बेट 20 (पीबीएस-टी) के साथ पीबीएस के 2 एमएल के साथ धोएं।
    नोट: MEMA सतह हाइड्रोफोबिक है, और दाग और एंटीबॉडी ऊष्मायन से पहले पीबीएस-टी के साथ धोने के लिए विफलता ऊष्मायन चरणों के दौरान कुओं में रिक्तियों के गठन में परिणाम होगा और धुंधला कलाकृतियों को जन्म देते हैं।
  4. Aspirate पीबीएस-टी. EdU का पता लगाने प्रतिक्रिया अभिकर्मकों जोड़ें. आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट, रॉकिंग और प्रकाश से संरक्षित। 1 ज ऊष्मायन के बाद, प्रदान की वाणिज्यिक शमन बफर के साथ कश प्रतिक्रिया.
    नोट: EdU का पता लगाने और धुंधला / एंटीबॉडी कदम 1.5 एमएल प्रति अच्छी तरह से प्रदर्शन किया जा सकता है लागत को कम करने के लिए.
  5. शमन बफर को प्रेरित करें और दाग या एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करने से पहले पीबीएस-टी के साथ धोएं।
  6. हिस्टोन H3K9me3 (1:1,000) और फाइब्रिलरिन (1:400) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट मेमा कुओं 2% युक्त बफर धुंधला में (w/v) गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA), 1 एमएम MgCl2 और 0.02% NaN3 रात 4 डिग्री सेल्सियस पर.
    नोट: एक पूर्ण MEMA सेट पर उन्हें का उपयोग करने से पहले इष्टतम सांद्रता निर्धारित करने के लिए एंटीबॉडी titrations प्रदर्शन.
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी या दाग ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के साथ 2x कुओं धोने और एक बार पीबीएस-टी के साथ।
  8. माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें (डंकी विरोधी माउस IgG और गधा विरोधी rabbit IgG, दोनों 1:300) और 0.5 [g/mL 4] 6]diamidino]2-phenylindole (DAPI). अंधेरे में आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
  9. PBS के अच्छी तरह से प्रति 2 एमएल के साथ कुओं धो 2x, उन्हें अंतिम 2 एमएल पीबीएस में छोड़.
  10. प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में बाद में इमेजिंग के लिए दाग MEMAs इमेजिंग या स्टोर करने के लिए आगे बढ़ें।

8. एमईएम की इमेजिंग

  1. उचित फ्लोरोसेंट का पता लगाने चैनलों के साथ एक स्वचालित इमेजिंग प्रणाली पर छवि MEMA.
  2. आउटपुट जिसके परिणामस्वरूप छवि डेटा एक छवि प्रबंधन प्रणाली के लिए. खंड कोशिकाओं और CellProfiler8का उपयोग कर तीव्रता के स्तर की गणना।

9. डेटा विश्लेषण

नोट: डेटा विश्लेषण सामान्यीकरण के होते हैं, भिन्नता सुधार, और कच्चे CellProfiler व्युत्पन्न डेटा के सारांश. इस उदाहरण में, कस्टम कोड के साथ R-पर्यावरण सभी चरणों को पूरा करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, किसी भी सांख्यिकीय पर्यावरण या सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के बराबर कार्रवाई करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. विश्लेषण के लिए R वातावरण के लिए खुला स्रोत कस्टम कोड का एक उदाहरण पर उपलब्ध है: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

  1. विभाजित छवि डेटा को पूर्वप्रक्रिया और सामान्यीकृत करें.
  2. DAPI दाग नाभिक का उपयोग कर स्थान सेल गिनती निर्धारित करते हैं।
  3. स्वचालित-गेट EdU तीव्रता EdU+के रूप में कोशिकाओं को लेबल करने के लिए | प्रत्येक स्थान में EdU+ कोशिकाओं के अनुपात का उपयोग कर प्रसार को मापने.
  4. मध्य स्थान स्तर पर साइटोप्लाज्मिक दाग और परमाणु आकृति विज्ञान माप संक्षेप.
  5. डेटा की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए डेटा पर अवांछित भिन्नता (RUV) सामान्यीकरण को हटानेकाकार्य 9.
    नोट: यह प्रकिया प्रत्येक तीव्रता और आकृति विज्ञान संकेत पर स्वतंत्र रूप से एक मैट्रिक्स के रूप में लागू किया जाता है जिसमें पंक्तियों और धब्बों का उपयोग करते हुए पहले9स्तंभों के रूप में कहा गया था.
  6. सरणी पंक्ति और सरणी कॉलम का उपयोग करके सरणी पंक्ति और सरणी कॉलम का उपयोग करते हुए स्थानिक या तीव्रता से संबंधित प्रभावों को सही करने के लिए स्वतंत्र चर के रूप में RUV सामान्यीकृत अवशिष्टों के लिए द्विचर लोस सामान्यीकरण लागू करें।
  7. एक बार सामान्यीकरण पूरा हो गया है, औसत रिपोर्टिंग और आगे के विश्लेषण के लिए प्रत्येक microenvironment स्थिति के लिए प्रतिकृतिसंक्षेप संक्षेप.

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Representative Results

सेल विकास और प्रसार पर microenvironmental प्रभावों को सरल बनाने के लिए और शर्तों है कि बढ़ावा दिया या सेल विकास और प्रसार को बाधित की पहचान करने के लिए, स्तन कैंसर सेल लाइन MCF7 आठ 8 अच्छी तरह से MEMAs के एक सेट पर बीज के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया था. इस परख 48 विभिन्न ईकम और 57 विभिन्न ligands के लिए कोशिकाओं को उजागर, कुल के लिए 2736 combinatorial सूक्ष्म पर्यावरण की स्थिति. संस्कृति में 71 एच के बाद, कोशिकाओं EdU के साथ स्पंदित थे, तय, permeablized, और DAPI के साथ दाग, EdU का पता लगाने के लिए प्रतिक्रिया, एक विरोधी फाइब्रिलिन एंटीबॉडी, और एक विरोधी H3K9me3 एंटीबॉडी. कोशिकाओं को एक उच्च सामग्री माइक्रोस्कोप पर छवि थे. इन छवियों को एक Omero सर्वर10पर अपलोड किया गया था , जो CellProfiler8का उपयोग करके विभाजित किया गया था , और सामान्यीकृत और R9में विश्लेषण किया गया था . नीचे वर्णित परिणाम DAPI और EdU संकेतों पर ध्यान केंद्रित करते हैं.

MEMAs की छवि विश्लेषण मंच कुछ प्रवाह साइटोमेट्री दृष्टिकोण से उपलब्ध उन लोगों के समान परिणाम देता है, जैसे डीएनए सामग्री भूखंडों दिखा 2N और 4N अंश किसी दिए गए लिगंड के साथ इलाज कोशिकाओं के लिए (चित्र 3ए),DAPI पर आधारित तीव्रता और क्षेत्र. इन भूखंडों की स्थिति है कि सक्रिय सेल साइकिल चालन बनाम को बढ़ावा देने के रूप में स्पष्ट bimodal चोटियों G1 या G2 चरणों बनाम विकास गिरफ्तार कोशिकाओं, जो चोटियों में परिवर्तन दिखाने के लिए नियंत्रण की स्थिति की तुलना में होगा में कोशिकाओं के लिए इसी द्वारा संकेत के लिए सबूत प्रदान करते हैं. हम डेटा को सारांशित करने के लिए सेल संख्या और अभिरंजन तीव्रता डेटा का उपयोग करते हैं, जहाँ सूक्ष्म पर्यावरण का प्रभाव (एक अक्ष पर लिगंड, दूसरे अक्ष पर ECM) दोनों कोशिका संख्या (चित्र 3ठ) और EdU निगमन ( चित्र3ब्) पर और अधिक आसानी से heatmap रंग और तीव्रता में परिवर्तन के रूप में देखा जा सकता है. जैसा कि इन भूखंडों से देखा गया है, कई प्रभाव लिगन्ड-चालित हैं, क्योंकि ईसीएम की स्थिति ने सेल नंबर या ईयू सकारात्मकता को दृढ़ता से प्रभावित नहीं किया। Nidogen-1 एक स्पष्ट अपवाद है, के रूप में इस ECM अणु की उपस्थिति सेल बंधन और MCF7 के विकास को रोकता है. Ligands जैसे FGF6 और NRG1] (भूखंडों पर NRG1.1) सेल संख्या में वृद्धि और EdU निगमन की उच्च दर है, जबकि ऐसे AREG और NRG1-smdf के रूप में ligands (एनआरजी 1.10 भूखंडों पर) सेल बाध्यकारी और / इन निष्कर्षों को स्थानों पर बढ़ रही कोशिकाओं की छवियों द्वारा समर्थित किया जाता है, जहां कोशिका संख्या और EdU सकारात्मकता में स्पष्ट अंतर स्पष्ट होता है (चित्र 3Dमें उदाहरण देखें)।

चूंकि MEMA मंच एक नई तकनीक है, परिणाम अलग assays में मान्य किया गया. MCF7 कोशिकाओं को 24-वेल प्लेटों में 10% FBS के साथ DMEM माध्यम में कोलेजन मैं के साथ लेपित थे. 18 ज के बाद, मीडिया कम विकास माध्यम के लिए विमर्श किया गया (DMEM 0.1% FBS के साथ) और कोशिकाओं NRG1 के साथ इलाज किया गया, FGF6, या AREG और 72 ज के लिए सुसंस्कृत EdU जोड़ा गया था 1 ज निर्धारण करने से पहले. कोशिकाओं DAPI के साथ दाग और EdU निगमन के लिए, छवि, खंडित, और विश्लेषण किया गया. एमईएमए मंच से प्राप्त परिणामों के समान, FGF6 और NRG1 ] दोनों ने उच्च कोशिका संख्याको वृद्धि की (चित्र 4क) और ईयू निगमन दर (चित्र 4ठ) की तुलना में आरईजी उपचारित कोशिकाओं की तुलना में, हमारी टिप्पणियों को मान्य किया मूल MEMA प्रयोगों.

Figure 1
चित्र 1 : प्रवाह चार्ट एक विशिष्ट MEMA प्रयोग के विभिन्न चरणों के लिए कार्यप्रवाह और समयरेखा दिखा. एक बार MEMAs मुद्रित कर रहे हैं, वे कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है कई महीनों के लिए उपयोग करने से पहले desicated. आमतौर पर, प्रयोगात्मक चरण 3 "4 दिन तक रहता है, लेकिन कुछ धीमी गति से बढ़ रही प्राथमिक कोशिकाओं को 2 सप्ताह तक MEMAs पर सुसंस्कृत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : सरणी मुद्रण के लिए ECM स्रोत प्लेट लेआउट। कोलेजन ब्लॉक एक ग्रिड है, जो शर्तों है कि कुओं के बीच और अधिक मजबूत सामान्यीकरण के लिए अनुमति का एक अत्यधिक दोहराव सेट प्रदान करता है के रूप में MEMA पर मुद्रित किया जाता है. पीबीएस से भरे कुओं मुद्रण प्रक्रिया के दौरान वाष्पीकरण की रोकथाम में सहायता करने के लिए नमी प्रदान करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : एक ठेठ MEMA प्रयोग से उत्पन्न डेटा के उदाहरण. (क) बिन्ड डीएपीआई तीव्रता मूल्यों बनाम सेल गणना ओंकार की कोशिका चक्र प्रोफाइल अलग-अलग लिगन्डों के साथ इलाज की गई एक 8-वेल प्लेट से, जिसमें जी 1 बनाम जी 2 सेल चक्र चरण में कोशिकाओं को इंगित करने वाली द्वि-फासी डीएपीआई तीव्रता धुंधला दिखाई देती है। (बी) हीटमैप जिसमें सामान्यीकृत स्पॉट सेल गणनाओं को पदानुक्रमिक गुच्छन का उपयोग करके समानता के साथ संकुलित किया गया है। लाल उच्च कक्ष संख्या इंगित करता है, और नीला कम कक्ष संख्या है। Ligands x-अक्ष पर हैं, ECMs y-अक्ष पर हैं। (ग) हीटमैप जिसमें सामान्यीकृत EdU निगमन दिखाया गया है, जिसमें लाल रंग का यह संकेत है कि निम्न EdU निगमन का संकेत है। Ligands x-अक्ष पर हैं, ECMs y-अक्ष पर हैं। (छ) एम ई एम ए स्थान पर बढ़ रही एम ई सी एफ 7 कोशिकाओं का उदाहरण, जिसका उपचार एनआरजी1- के साथ किया जाता है जिसमें ईयू निगमन (गुलाबी नाभिक) की उच्च दरों को दिखाया गया है। हरा दाग सेल मुखौटा है और नीला DAPI है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : सेल संस्कृति में MEMA परिणाम का सत्यापन. (क) विभिन्न लिगन्डों के साथ एमसीएफ 7 के उपचार से उत्पन्न सेल संख्या का परिमाणीकरण। MCF7 कोशिकाओं के समतुल्य संख्या multiwall प्लेटों में चढ़ाया गया तो या तो AREG, FGF6, या NRG1 के साथ इलाज किया गया. AREG के साथ इलाज किया कुओं FGF6 के साथ इलाज किया उन लोगों की तुलना में काफी कम कोशिकाओं था (* छात्र के टी-परीक्षण पी-मान 0.01 से कम का संकेत) या NRG1 $ (* 72 एच पोस्ट ligand उपचार पर एक पी मूल्य इंगित करता है) . (ख) विभिन्न लिगन्डों के साथ उपचार के कारण एम सी एफ 7 में ईयू निगमन के स्तर का परिमाणीकरण, जैसा कि पैनल एमें है . AREG उपचार FGF6 के साथ इलाज कोशिकाओं की तुलना मेंEdU शामिल कोशिकाओं का एक काफी कम अनुपात में परिणाम (* p और lt; 0.01) या NRG1 ] (* *, p $ 0.01). त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रोटीन नाम यूनिप्रोट आईडी भंडार
एकाग्रता
(जेडजी/एमएल)		 अंतिम
एकाग्रता
(जेडजी/एमएल)
ANGPT1 ]1 Q15389 ]1 100 0.04
ANGPT2 ]1 O15123 ]1 100 0.2
Areg P15514 100 0.02
बीएमपी 2 पी 12643 100 0.1
बीएमपी 3 पी 12645 1000 0.1
BMP4 पी 12644 100 0.1
BMP5 ]1 P22003 ]1 100 0.1
BMP6 P22004 100 0.1
बीएमपी 7 पी 18075 100 0.1
सीएसएफ2 पी04141 100 0.02
सीटीजीएफ जेड 1 P29279 ]1 100 0.05
CXCL12] अल्फा P48061 ]2 100 0.01
CXCL12] बीटा P48061 ]1 100 0.03
CXCL1 पी09341 100 0.004
CXCL8 ] 1 P10145 ]1 100 0.3
DLL1 ] 1 O00548 ]1 500 0.5
DLL4 Q9NR61 200 0.6
EGF $1 P01133 ]1 500 0.01
FASLG ]1 P48023 ]1 10 0.02
FGF2]3 पी09038 ]2 100 0.01
FGF6 P10767 100 0.01
FLT3LG $1 P49771 ]1 50 0.001
जीपीएनबी जेड 1 Q14956 ]1 100 0.5
एचजीएफ जेड 1 P14210 ] 1 50 0.04
IGF1 ]1 P05019 ]1 200 0.01
IGFBP2 पी 18065 100 0.05
IGFBP3 ]1 P17936 ]1 100 0.1
आईएल13 P35225 100 0.01
आईएल15] आईएल15एस48एए P40933 ]1 50 0.01
आईएल1बी पी01584 25 0.001
आईएल6 पी05231 100 0.01
आईएल7 जेड 1 P13232 ]1 100 0.01
JAG1 ]1 P78504 ]1 200 0.5
JAG2] लंबी Q9Y219 ]1 100 0.5
KITLG ]1 P21583 ]1 100 0.005
KNG1] एचएमडब्ल्यू P01042 ]1 100 0.2
एलईपी P41159 1000 0.002
LYVE1 Q9Y5Y7 100 0.05
NRG1 $ 10 Q02297 $10 100 0.01
NRG1 ]1 Q02297 ]1 100 0.05
NRG1 ]6 Q02297 ]6 100 0.01
पीडीजीएफएबी गो1990265 100 0.05
पीडीजीएफबी जेड 1 P01127 ]1 100 0.05
Ptn P21246 100 0.5
श Q15465 100 0.5
TGFB1] Cterminus P01137] Cterminus 20 0.01
TGFB1] गोद P01137] गोद 100 0.15
TGFB2] ए P61812 ]1 20 0.01
टीएचपीओ ]1 P40225 ]1 50 0.002
TNFRSF11B O00300 100 0.02
TNFSF11 ]1 O14788 ]1 100 0.01
Tnf पी01375 100 0.01
VEGFA] VEGF206 P15692 ]1 100 0.01
WNT10A Q9G$T5 100 0.1
WNT3A $1 P56704 ]1 200 0.1
Wnt5a ]1 P22725 ]1 100 0.1

तालिका 1: MEMA प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया ligands की पूरी सूची. यूनिप्रोट आईडी, स्टॉक सांद्रता, और अंतिम कार्य सांद्रता प्रदान की जाती है।

ईसीएम प्रोटीन यूनिप्रोटीआईडी स्टॉक एकाग्रता
(जेडजी/एमएल)		 अंतिम
एकाग्रता
(जेडजी/एमएल)		 नोट्स
ALCAM ]1 Q13740 ]1 100 30
सीडीएच20 Q9HBT6 300 80
सीडीएच6 ]1 P55285 ]1 100 40
सीडीएच 8 P55286 100 20
CD44 $1 P16070 $1 100 30
CEACAM6 P40199 100 30
COL1A1 पी02453 5000 200 कई यूनिप्रोट आईडी के साथ कई उपइकाइयें
COL2A1 ]2 पी02458 ]2 1000 200
COL3A1 ]1 P02461 ]1 1000 200
COL4A1 ]1 P02462 ]1 1000 200 कई यूनिप्रोट आईडी के साथ कई उपइकाइयें
COL5A1 P20908 1000 200
COL23A1 ]1 Q86Y22 ]1 200 80
डी एस जी 2 Q14126 100 30
सीडीएच 1 ]1 P12830 $1 100 40
ईसीएम1 $1 Q16610 $1 100 40
FN1 ]1 P02751 ]1 1000 200
GAP43 ]1 P17677 ]1 158 40
HyA-500K 1000 200 LOR-0005
HyA-50K 1000 200 LOR-0007
आईसीएएम1 पी05362 400 80
ALCAM ]1 Q13740 ]1 100 30
सीडीएच20 Q9HBT6 300 80
सीडीएच 8 P55286 100 20
CD44 $1 P16070 $1 100 30
CEACAM6 P40199 100 30
डी एस जी 2 Q14126 100 30
सीडीएच 15 P55291 100 20
VCAM1 ] 1 P19320 $1 1000 200
लामा1 P25391 500 200 कई यूनिप्रोट आईडी के साथ कई उपइकाइयें
LAMA3 ]2 Q16787 ]2 130 40
Lum P51884 200 80
सीडीएच 15 P55291 100 20
NID1 ] 1 P14543 ]1 100 9.3 ग्राम/एमएल निड, 130 डिग्री/एमएल लाम, 46.5 ग्राम/ +COL4 और लेमिन
ओएमडी Q99983 100 40
SPP1] ए P10451 ]1 100 40
सीडीएच3 ]1 P22223 ]1 100 40
पीईकेएएम1] लंबी P16284 ]1 150 40
टीएनसी जेड 1 P24821 ]1 500 200
VCAM1 ] 1 P19320 $1 1000 200
वीटीएन पी04004 100 40
बीजीएच P21810 100 40
डीसीएन] ए पी07585 ]1 300 80
POSTN ]1 Q15063 ]1 100 40
Sparc पी09486 100 40
THBS1 ]1 पी07996 ]1 100 40
बीकेएन जेड 1 Q96GW7 ]1 100 40
ईएलएन जेड 3 P15502 ]3 1000 200
एफबीएन1 P35555 254 80

तालिका 2: ईसीएम प्रोटीन और शर्तों है कि MEMA प्रयोगों में उपयोग किया जाता है की पूरी सूची. यूनिप्रोट आईडी, स्टॉक सांद्रता, और अंतिम कार्य सांद्रता प्रदान की जाती है। कुछ उदाहरणों में, मुद्रित हालत एक प्रोटीन जटिल या एकाधिक प्रोटीन का एक संयोजन है, जो नोट्स कॉलम में संकेत दिया है का प्रतिनिधित्व करता है.

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Discussion

"आयामीता" और संदर्भ के महत्व microenvironment11के साथ उनकी बातचीत के माध्यम से कैंसर की कोशिकाओं की विशेषता में उपकरण के रूप में इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों के विकास में एक प्रेरित कारक रहा है , और इन विट्रो की क्षमता संस्कृति प्रणालियों में vivo वातावरण की नकल करने के लिए खोज के पीछे एक प्रेरणा शक्ति है उन संस्कृति प्रणालियों में सुधार. इन विट्रो प्रणालियों में, तथापि, कैंसर अनुसंधान के महत्वपूर्ण उपकरण रहते हैं ठीक क्योंकि उनकी क्षमता के लिए एक सरलीकृत मॉडल12के लिए नीचे vivo स्थिति में जटिल आसवन .

हालांकि 2 डी सिस्टम ECMs और ligands शामिल कर सकते हैं, वे पारंपरिक रूप से combinatorial pertubagens की एक विस्तृत पैनल पूछताछ करने के लिए थ्रूपुट क्षमताओं का अभाव है. लोकप्रिय वाणिज्यिक तहखाने झिल्ली अर्क 3 डी में culturing के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन प्रोटीन की एक सावधानी से परिभाषित पैनल की सिद्धता की कमी है. वाणिज्यिक निष्कर्षों आम तौर पर अधूरा परिभाषित संरचना से पीड़ित हैं, जो विश्लेषण को भ्रमित कर सकते हैं और महत्वपूर्ण बैच-टू-बैच भिन्नता3,13में परिणाम कर सकते हैं। MEMA मंच इन बाधाओं पर काबू पाने, सेलुलर phenotypes में परिवर्तन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, चयापचय गतिविधि, भेदभाव की स्थिति, और सेल विकास और प्रसार में बदलाव के रूप में वे विशिष्ट और परिभाषित अंतर्जात द्वारा संग्राहक हैं कारकों.

MEMA मंच कोशिकाओं के phenotype पर microenvironment (दोनों ECM और घुलनशील कारकों) के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली, मध्यम से उच्च throughput दृष्टिकोण है. मंच परख और कोशिकाओं जिसके लिए यह उपयोग किया जा सकता है के प्रकार के लिए महान लचीलापन से पता चलता है. हम दोनों घुलनशील ligands और ECM प्रोटीन जो करने के लिए कोशिकाओं को उजागर कर रहे हैं से प्रभाव का निरीक्षण कर सकते हैं. दरअसल, हमने हाल ही में पाया है कि ligands HER2 लक्षित inhibitors के लिए प्रतिरोध का एक प्रमुख चालक थे, लेकिन है कि इन प्रभावों ECM5द्वारा संग्राहक किया जा सकता है. फेफड़ों, मूत्राशय, प्रोस्टेट, स्तन, और अग्न्याशय सहित विभिन्न सेल प्रकार से व्युत्पन्न प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों सहित कोशिकाओं की एक किस्म, साथ ही प्रेरित pluripotent स्टेम (iPS) कोशिकाओं, सफलतापूर्वक MEMA मंच पर सुसंस्कृत किया गया है (देखें संदर्भ 5,7,14में उदाहरण हैं। विभिन्न दाग का उपयोग सेल विकास, भेदभाव, और चयापचय सहित कई सेलुलर एंडपॉइंट के readout के लिए अनुमति देता है। अन्य शोधकर्ताओं ने कठोरता या लोचदार मापांक के प्रभाव से पूछताछ करने के लिए मंच का विस्तार किया है, जिससे एमईएमए प्लेटफॉर्म15में एक अतिरिक्त आयाम मिला है। अंत में, मंच microenvironment स्थितियों है कि या तो बढ़ाने या दवा प्रभावकारिता को बाधित की पहचान के लिए दवा स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए सक्षम है, के रूप में हम और दूसरों को हाल ही मेंसूचितकिया है 5,14,15 .

शायद एक MEMA प्रयोग की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम सेल चढ़ाना घनत्व का अनुकूलन है. कोशिकाओं के घनत्व को अनुकूलित करने से यह सुनिश्चित होता है कि पर्याप्त कोशिकाएं मजबूत डेटा प्रदान करने के लिए मौजूद हैं, लेकिन इतने सारे नहीं कि स्थान अति-संप्रवाही हो जाता है। अनुकूल धब्बे काफी परिणाम को भ्रमित कर सकते हैं, खासकर यदि प्रसार एक समापन बिंदु के रूप में प्रयोग किया जाता है, यह निर्धारित करने के लिए असंभव बना अगर कम प्रसार दर microenvironmental कारकों के साथ बातचीत का एक परिणाम है या से संपर्क निषेध के कारण कर रहे हैं उच्च सेलुलर घनत्व. सेल अनुमापन प्रयोगों इन समस्याओं को प्रकट कर सकते हैं, प्रति स्थान औसत सेल संख्या के रूप में चढ़ाया कोशिकाओं की बढ़ती संख्या के साथ एक रैखिक वृद्धि का प्रदर्शन करेंगे, लेकिन अंततः पठार होगा. वक्र की रेखीय श्रेणी में इष्टतम कक्ष संख्या चुनी जानी चाहिए.

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, MEMA मंच लचीला है और विभिन्न सतहों के साथ substrates की एक किस्म पर तैयार किया जा सकता है. इनमें कांच स्लाइड और मल्टीवॉल प्लेट प्रारूप शामिल हैं। हमारे अनुभव में, नहीं सभी सतह chemistries MEMA मुद्रण के लिए अनुकूल हैं, के रूप में हम गरीब आसंजन गुणों और अन्य उच्च आसंजन सतहों पर सेल आसंजन ब्लॉक करने में असमर्थता के कारण कुछ सतहों पर जगह टुकड़ी मनाया है. इसके अलावा, विभिन्न substrates के बीच बदलने बफर शर्तों के अनुकूलन की जरूरत है, एक ही प्रिंट बफर के साथ मुद्रण के प्रदर्शन के रूप में सतह रसायन विज्ञान के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.

मुद्रित ECM स्पॉट का व्यास डेटा की गुणवत्ता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. सामान्य तौर पर, हम उपयोग में arrayer के लिए उपलब्ध सबसे बड़े व्यास प्रिंट पिन का उपयोग करने की सलाह देते हैं (हम वर्तमान में 350 डिग्री मीटर व्यास पिन का उपयोग करते हैं). बड़े व्यास स्पॉट कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में एक स्थान पर कब्जा करने के लिए अनुमति देते हैं, जो छोटे व्यास पिन के साथ उत्पन्न कर रहे हैं की तुलना में अधिक मजबूत डेटा में परिणाम करने के लिए जाता है. चूंकि कोशिकाओं की बाइंडिंग एक स्टोकेस्टिक प्रक्रिया है, इसलिए डेटा में उच्च स्तर की परिवर्तनशीलता होती है जो मूल रूप से प्रत्येक स्थान से जुड़ी कोशिकाओं की संख्या से संबंधित होती है। इस प्रकार, हम प्रत्येक ECM स्थिति के लिए प्रतिकृति की एक बड़ी संख्या मुद्रण की सलाह देते हैं। हम अपने वर्तमान प्रिंट स्थितियों के साथ प्रत्येक में 10 डिग्री 15 ECM प्रतिकृति मुद्रित करने के लिए मजबूत आँकड़े सुनिश्चित करते हैं.

हम अपने पिछले प्रयोगों में उल्लेख किया है कि सबसे अधिक भाग के लिए, ligand प्रभाव ECM प्रभाव पर हावी हो जाते हैं. यह हमारे सभी ECM स्पॉट, जो मजबूत सेल बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए कोलेजन मैं जोड़ने के निर्णय के कारण भाग में हो सकता है. हालांकि, हमें विश्वास है कि यह भी ECM प्रभाव homogenize हो सकता है, के रूप में सबसे स्पॉट एक तरह से अत्यधिक कोलेजन के समान व्यवहार करते हैं I. कोलेजन को बाहर करने के लिए जगह संरचना बदलने मैं के साथ बातचीत का एक परिणाम के रूप में अंतर सेल व्यवहार में परिणाम हो सकता है ECM, लेकिन यह भी काफी सेल बाइंडिंग प्रभावों, कई और अधिक खाली स्थानों में जिसके परिणामस्वरूप. उपयोगकर्ताओं को इन मतभेदों को ध्यान में रखते हुए अपने ईसीएम संरचना को अनुकूलित करना चाहिए, विशेष रूप से स्टेम और संतति कोशिकाओं और भेदभाव में रुचि रखने वालों, जहां मैट्रिक्स एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है16.

हम आम तौर पर समय की अपेक्षाकृत कम अवधि के लिए MEMA assays प्रदर्शन (उदाहरण के लिए, 72 एच अधिकतम). इसका कारण यह है कोशिकाओं स्पॉट करने के लिए विवश कर रहे हैं (ब्लॉकिंग बफर हमारे अनुभव में स्थानों के बाहर विकास के लिए अनुमति नहीं है). तेजी से विभाजित कोशिकाओं के साथ, 72 एच से अधिक विकास स्थान के अतिवृद्धि का कारण होगा, जो बदले में छवि विभाजन को जटिल बनाता है क्योंकि कोशिकाएं भीड़ हो जाती हैं और एक दूसरे पर ढेर हो जाती हैं, और डेटा को भी प्रभावित कर सकती हैं क्योंकि विकास गिरफ्तारी संपर्क निषेध के साथ हो सकती है। हम बहुत धीमी गति से बढ़ रही प्राथमिक कोशिकाओं के साथ लंबे समय तक उपचार प्रदर्शन किया है (10 डिग्री 14 दिन), लेकिन देखभाल इन assays में लिया जाना चाहिए मीडिया को बदलने के लिए और ligands हर 3 "4 दिन की भरपाई.

MEMA मंच विकसित करने के लिए सतत प्रयासों ब्याज के दो क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, इमेजिंग और छोटे संस्कृति वाहिकाओं के भीतर अनुकूलन के लिए ऑप्टिकल गुणवत्ता के अधिकतमीकरण. ऑप्टिकल गुणवत्ता एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है जब शोधकर्ताओं को ब्याज के अपने मार्करों के subcellular स्थानीयकरण की पहचान करने के लिए उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता होती है. प्रारंभिक स्क्रीन उच्च-थ्रूपुट माइक्रोस्कोप पर कम संकल्प पर उच्च संकल्प उपकरणों पर ब्याज के विशिष्ट स्थानों की इमेजिंग के बाद किया जा सकता है, लेकिन छवि गुणवत्ता सब्सट्रेट के ऑप्टिकल गुण गरीब हैं, तो समझौता किया जा सकता है। सब्सट्रेट के ऑप्टिकल गुणों में सुधार शोधकर्ताओं उच्च संकल्प पर चयनित छवियों को पुनः प्राप्त करने की आवश्यकता के बिना उच्च संकल्प इमेजिंग सिस्टम पर प्रारंभिक स्क्रीन प्रदर्शन करने की अनुमति होगी. अंत में, इस तरह के 96 अच्छी तरह से प्लेटें के रूप में छोटे संस्कृति जहाजों में MEMAs प्रदर्शन करने की क्षमता, उपचार की मात्रा में कमी और पूछताछ ligands और प्रतिकृति के विस्तार की अनुमति होगी. इस संक्रमण के लिए नई संस्कृति के जहाजों के भीतर सब्सट्रेट-बफर-प्रोटीन इंटरैक्शन और सरणी प्रिंटिंग के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। इस तरह के चल रहे प्रयासों MEMA मंच में सुधार होगा और अपनी शक्तिशाली क्षमताओं पर विस्तार करने के लिए प्रासंगिक microenvironmental प्रोटीन है कि सेल प्रकार की एक किस्म है, जो बाद में बाद में जांच की जा सकती है के लिए सेलुलर phenotypes परिवर्तन की पहचान पुष्टित्मक परख.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम नेटवर्क सेलुलर हस्ताक्षर (LINCS) अनुदान HG008100 (J.W.G., L.M.H., और J.E.K.) के NIH आम निधि पुस्तकालय द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aushon 2470 Aushon BioSystems Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA Nikon High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler BioTek liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution Sigma T2069
EDTA Invitrogen 15575-038
Glycerol Sigma G5516
Triton X100 Sigma T9284
Tween 20 Sigma P7949
Kolliphor P338 BASF 50424591
384-well microarray plate, cylindrical well Thermo Fisher ab1055
Nunc 8 well dish Thermo Fisher 267062
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Science 15710
BSA Fisher BP-1600
Sodium Azide Sigma S2002
Cell Mask Molecular Probes H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor Molecular Probes C10357
DAPI Promo Kine PK-CA70740043
ALCAM R & D Systems 656-AL ECM
Cadherin-20 (CDH20) R & D Systems 5604-CA ECM
Cadherin-6 (CDH6) R & D Systems 2715-CA ECM
Cadherin-8 (CDH8) R & D Systems 188-C8 ECM
CD44 R & D Systems 3660-CD ECM
CEACAM6 R & D Systems 3934-CM ECM
Collagen I Cultrex 3442-050-01 ECM
Collagen Type II Millipore CC052 ECM
Collagen Type III Millipore CC054 ECM
Collagen Type IV Sigma C5533 ECM
Collagen Type V Millipore CC077 ECM
COL23A1 R & D Systems 4165-CL ECM
Desmoglein 2 R & D Systems 947-DM ECM
E-cadherin (CDH1) R & D Systems 648-EC ECM
ECM1 R & D Systems 3937-EC ECM
Fibronectin R & D Systems 1918-FN ECM
GAP43 Abcam ab114188 ECM
HyA-500K R & D Systems GLR002 ECM
HyA-50K R & D Systems GLR001 ECM
ICAM-1 R & D Systems 720-IC ECM
Laminin Sigma L6274 ECM
Laminin-5 Abcam ab42326 ECM
Lumican R & D Systems 2846-LU ECM
M-Cad (CDH15) R & D Systems 4096-MC ECM
Nidogen-1 R & D Systems 2570-ND ECM
Osteoadherin/OSAD R & D Systems 2884-AD ECM
Osteopontin (SPP) R & D Systems 1433-OP ECM
P-Cadherin (CDH3) R & D Systems 861-PC ECM
PECAM1 R & D Systems ADP6 ECM
Tenascin C R & D Systems 3358-TC ECM
VCAM1 R & D Systems ADP5 ECM
Vitronectin R & D Systems 2308-VN ECM
Biglycan R & D Systems 2667-CM ECM
Decorin R & D Systems 143-DE ECM
Periostin R & D Systems 3548-F2 ECM
SPARC/osteonectin R & D Systems 941-SP ECM
Thrombospondin-1/2 R & D Systems 3074-TH ECM
Brevican R & D Systems 4009-BC ECM
Elastin BioMatrix 5052 ECM
Fibrillin Lynn Sakai Lab OHSU N/A ECM
ANGPT2 RnD_Systems_Own 623-AN-025 Ligand
IL1B RnD_Systems_Own 201-LB-005 Ligand
CXCL8 RnD_Systems_Own 208-IL-010 Ligand
IGF1 RnD_Systems_Own 291-G1-200 Ligand
TNFRSF11B RnD_Systems_Own 185-OS Ligand
BMP6 RnD_Systems_Own 507-BP-020 Ligand
FLT3LG RnD_Systems_Own 308-FK-005 Ligand
CXCL1 RnD_Systems_Own 275-GR-010 Ligand
DLL4 RnD_Systems_Own 1506-D4-050 Ligand
HGF RnD_Systems_Own 294-HGN-005 Ligand
Wnt5a RnD_Systems_Own 645-WN-010 Ligand
CTGF Life_Technologies_Own PHG0286 Ligand
LEP RnD_Systems_Own 398-LP-01M Ligand
FGF2 Sigma_Aldrich_Own SRP4037-50UG Ligand
FGF6 RnD_Systems_Own 238-F6 Ligand
IL7 RnD_Systems_Own 207-IL-005 Ligand
TGFB1 RnD_Systems_Own 246-LP-025 Ligand
PDGFB RnD_Systems_Own 220-BB-010 Ligand
WNT10A Genemed_Own 90009 Ligand
PTN RnD_Systems_Own 252-PL-050 Ligand
BMP3 RnD_Systems_Own 113-BP-100 Ligand
BMP4 RnD_Systems_Own 314-BP-010 Ligand
TNFSF11 RnD_Systems_Own 390-TN-010 Ligand
CSF2 RnD_Systems_Own 215-GM-010 Ligand
BMP5 RnD_Systems_Own 615-BMC-020 Ligand
DLL1 RnD_Systems_Own 1818-DL-050 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 296-HR-050 Ligand
KNG1 RnD_Systems_Own 1569-PI-010 Ligand
GPNMB RnD_Systems_Own 2550-AC-050 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 350-NS-010 Ligand
IL15 RnD_Systems_Own 247-ILB-005 Ligand
TNF RnD_Systems_Own 210-TA-020 Ligand
IGFBP3 RnD_Systems_Own 675-B3-025 Ligand
WNT3A RnD_Systems_Own 5036-WNP-010 Ligand
PDGFAB RnD_Systems_Own 222-AB Ligand
AREG RnD_Systems_Own 262-AR-100 Ligand
JAG1 RnD_Systems_Own 1277-JG-050 Ligand
BMP7 RnD_Systems_Own 354-BP-010 Ligand
TGFB2 RnD_Systems_Own 302-B2-010 Ligand
VEGFA RnD_Systems_Own 293-VE-010 Ligand
IL6 RnD_Systems_Own 206-IL-010 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 351-FS-010 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 378-SM Ligand
IGFBP2 RnD_Systems_Own 674-B2-025 Ligand
SHH RnD_Systems_Own 1314-SH-025 Ligand
FASLG RnD_Systems_Own 126-FL-010 Ligand

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References

  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  3. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  4. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
  5. Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
  6. Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
  7. Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  8. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  9. Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , Report No. 820 (2013).
  10. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
  11. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  12. Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
  13. Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
  14. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
  15. Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
  16. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).

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Retraction अंक 147 microenvironment microarray MEMA स्तन कैंसर सेलुलर phenotype प्रसार
कैंसर में सेलुलर Phenotypes पर Microenvironmental प्रभाव पूछताछ करने के लिए Microarrays का उपयोग
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Smith, R., Devlin, K., Kilburn, D., Gross, S., Sudar, D., Bucher, E., Nederlof, M., Dane, M., Gray, J. W., Heiser, L., Korkola, J. E. Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer. J. Vis. Exp. (147), e58957, doi:10.3791/58957 (2019).

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