Summary
Syftet med den metod som presenteras här är att visa hur mikromiljö Microarrays (Mema) kan tillverkas och används för att förhöra effekten av tusentals enkla kombinatoriska mikromiljöer på fenotyp av odlade celler.
Abstract
Förstå effekterna av mikromiljön på fenotypen av celler är ett svårt problem på grund av den komplexa blandningen av både lösliga tillväxtfaktorer och Matrix-associerade proteiner i mikromiljön in vivo. Dessutom finns lättillgängliga reagenser för modellering av mikromiljöer in vitro vanligtvis använda komplexa blandningar av proteiner som är ofullständigt definierade och lider av batch till sats variation. Mikromiljö microarray (Mema) plattform möjliggör bedömning av tusentals enkla kombinationer av mikromiljö proteiner för deras inverkan på cellulära fenotyper i en enda analys. De Memas är beredda i bra tallrikar, som gör det möjligt att tillägg av enskilda ligander att separera brunnar som innehåller klädd extracellulära matrix (ECM) proteiner. Kombinationen av den lösliga ligand med varje tryckt ECM bildar en unik kombination. En typisk MEMA-analys innehåller mer än 2 500 unika kombinatoriska mikromiljöer som celler exponeras för i en enda analys. Som ett testfall, bröstcancer cellinjer MCF7 var pläterad på MEMA plattformen. Analys av denna analys identifierade faktorer som både förbättra och hämma tillväxten och spridningen av dessa celler. MEMA-plattformen är mycket flexibel och kan utökas för användning med andra biologiska frågor utöver cancerforskning.
Introduction
Odling av cancer cellinjer på plast i tvådimensionella (2D) enskiktslager är fortfarande en av de stora arbetshästar för cancerforskare. Emellertid, mikromiljön är alltmer erkänns för dess förmåga att påverka cellulära fenotyper. I cancer, tumören mikromiljö är kända för att påverka flera cellulära beteenden, inklusive tillväxt, överlevnad, invasion, och svar på terapi1,2. Traditionella enskiktslager cellkulturer saknar typiskt mikromiljö influenser, vilket har lett till utvecklingen av mer komplexa tredimensionella (3D) analyser för att odla celler, inklusive kommersiellt tillgängliga renade basalmembran extrakt. Men dessa renade matriser är vanligtvis komplicerade att använda och lider av tekniska problem såsom batchvariation3 och komplexa kompositioner3. Som ett resultat, det kan vara svårt att tilldela funktion till specifika proteiner som kan påverka cellulära fenotyper3.
För att hantera dessa begränsningar, har vi utvecklat mikromiljö microarray (Mema) teknik, vilket minskar mikromiljön ner till enkla kombinationer av extracellulära matrix (ECM) och lösliga tillväxtfaktor proteiner4,5 . MEMA-plattformen möjliggör identifiering av dominerande mikromiljöfaktorer som påverkar cellernas beteende. Genom att använda ett matrisformat kan tusentals kombinationer av mikromiljöfaktorer analyseras i ett enda experiment. Mema beskrivs här förhör ~ 2 500 olika unika mikromiljö villkor. ECM-proteiner tryckta i väl plåtar bildar tillväxt kuddar på vilka celler kan odlas. Lösliga ligander läggs till enskilda brunnar, skapa unika kombinatoriska mikromiljöer (ECM + ligand) på varje annan plats som cellerna exponeras. Celler odlas i flera dagar, sedan fast, färgas, och avbildas för att bedöma cellulära fenotyper som en följd av exponering för dessa specifika mikromiljö kombinationer. Eftersom mikromiljöerna är enkla kombinationer är det enkelt att identifiera proteiner som driver stora fenotypiska förändringar i cellerna. Memas har använts framgångsrikt för att identifiera faktorer som påverkar flera cellulära fenotyper, inklusive de som driver cell öde beslut och svar på terapi4,5,6,7. Dessa svar kan valideras i enkla 2D experiment och kan sedan bedömas under förhållanden som mer fullständigt recapitulate komplexiteten i tumören mikromiljö. MEMA-plattformen är mycket anpassningsbar till en mängd olika celltyper och endpoints, förutsatt att goda fenotypiska biomarkörer finns tillgängliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: En översikt över hela MEMA-processen, inklusive Beräknad tid, beskrivs i flödesdiagrammet som visas i figur 1. Detta protokoll specificerar tillverkningen av MEMAs i 8-brunn plattor. Protokollet kan anpassas för andra plattor eller diabilder.
1. beredning av protein, spädningsvätska och Färgbuffertar
- Equilibrate injektionsflaskor med ECMs, ligander och cytokiner till rumstemperatur (RT) och kort Centrifugera. Lägg till lämplig volym för lämplig RT-buffert som anges på produktdatabladet. Följ tillverkarens rekommendation för lagerkoncentrationer.
Anmärkning: En fullständig förteckning över ligander och ECMs med deras lager och slutliga koncentrationer anges i tabell 1 och tabell 2. Både ligander och ECMs används vanligtvis vid den högsta koncentrationen av det intervall som rekommenderas av tillverkaren som framkallar en biologisk effekt i standard 2 dag kultur analyser. Hantera proteiner varsamt och i biosäkerhetsskåp under laminärt flöde för att undvika kontaminering. - Inkubera injektionsflaskor med mild gunga vid RT för 1 h. Inte Vortex proteiner eftersom detta kan orsaka dem att denaturera.
- Aliquot proteiner för långtidsförvaring så att alla alikvoter är engångsanvändning endast för att undvika nedbrytning med upprepade frys/Tina cykler. Förvara frystorkat protein vid-80 ° c (om inte annat anges) tills det behövs. Var noga med att samla in alla metadata för framtida referens, såsom: (i) protein namn, (II) datum förberett, (III) parti-/batchnummer, (IV) leverantör, (v) katalognummer, (vi) koncentration, (VII) volym, och (VIII) preparer.
- Bered spädningsvätska som innehåller 20% (v/v) glycerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 och filtersterilisera. Förvara denna buffert steril och förvara på RT.
- Förbered färgbuffert som innehåller 2% (w/v) BSA, 1 mM MgCl2och 0,02% Nan3 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Filtrera och förvara vid 4 ° c.
2. beredning av en ECM-Källskylt
- Ta bort alinoterade lager av ECM-proteiner som ska tryckas och Tina på is. Registrera alla partinummer för metadataspårning.
- Snärt rör av tinade proteiner försiktigt för att säkerställa korrekt resuspension och snurra ner i en centrifug.
-
Gör ECM Print blandningar (EPMS) och en fluorescerande relaterat som ska användas av en vätskehantering robot som kommer att skapa den randomiserade 384-well käll plattor.
Obs: 384-well käll plattorna kommer att användas av en touch PIN array skrivare för att skapa de tryckta arrayer i 8 bra tallrikar.- Etikett 1,5 mL microcentrifug rör för varje EPM och fiducial.
- Förbered varje EPM genom att kombinera 125 μL spädningsvätska buffert (se steg 1,4) med lämplig volym av ECM-lager och föra blandningen upp till en total volym av 250 μL med PBS. De slutliga koncentrationerna i varje EPM-tub kommer att vara 1x ECM-protein, 5 mM EDTA, 10% glycerol och 100 mM Tris.
- Förbered en fluorescerande relaterat genom att lösa upp den i lämplig buffert som anges av tillverkaren och överföra 250 μl till en märkt relaterat röret.
3. skapande av käll plattan med hjälp av en vätske hanterare
- Designa en 384-brunn plattan layout som randomizes positionerna i ECMs och är optimerad för Array Printer PIN-kod som används. Designa placeringen av relaterat så att den kommer att skrivas ut i rad 1, kolumn 1 position för varje brunn för att bistå i mat ris orientering.
Anmärkning: Sammanlagt 14 − 15 replikat av varje ECM används för att säkerställa robusta data. Inkludera ytterligare replikat av kollagen eller annan ECM som ger robust fäste för bedömning av enhetlighet i bindningen. Layouten kan behöva använda flera 384-bra plattor beroende på antalet ECMs av intresse. - Överför EPM-rören till en vätske hanterare och håll rören vid 4 ° c, antingen med ett kylt rör rack eller genom att använda en vätskehanterings robot i ett kallt rum.
- Med hjälp av vätske hanterarens programvara, kör ett program för att överföra 15 μl av varje EPM och relaterat till de förutbestämda brunnarna inom 384-brunnen källa plattan (s).
- Pipet PBS i alla oanvända brunnar för att öka luftfuktigheten och skydda mot uttorkning under tryckprocessen.
Anmärkning: Se figur 2 för ett exempel på en 384-brunn Källa plattan som är optimerad för en 4 x 7 stift huvudet och innehåller ett kollagen I block och PBS. - Tätnings plattan (s) och håll vid 4 ° c tills den är klar för utskrift.
4. skriva ut MEMAs med en array Printing robot
Anmärkning: Följande del av protokollet beskriver specifikt beredning och användning av MEMA för att undersöka effekterna av olika mikromiljöproteiner på tillväxt och spridning av MCF7 celler. Protokollet kan dock enkelt anpassas för att använda olika ligander, ECMs och celler för att studera andra cellinjer och slutpunkter av intresse.
-
Med en touch PIN-skrivare, Skriv ut EPMS och relaterat fläckar i 8 bra tallrikar. Skriv ut flera replikat av varje ECM-tillstånd för att säkerställa reproducerbarhet.
ANMÄRKNINGAR: andra plattformat eller diabilder kan användas för utskrift, men buffertoptimering kan krävas för att uppnå optimal spot formation.- Skriv ut ECMs för MEMA med 350 μm diameter stift arrangerade i en 4 x 7 skrivhuvudet konfiguration. Skriv ut arrayer i 8-brunnen plattor som 20 kolumner med 35 rader, för totalt ~ 700 fläckar. Större matriser är möjliga i dessa plattor men kommer med en trade-off av ökade kanteffekter i både cell bindning och färgning.
- Efter utskrift, förvara plattorna i en exsickator i minst 3 dagar före användning.
5. inrättande av behandlings plattor för ligand
- Designa en 96-brunn tallrik layout inklusive ligander av intresse. För att underlätta behandling av många MEMA plattor på en gång, designa denna platta med mellanrum som gör det möjligt att använda en flerkanals Pipettera med 4 radavstånd tips för att överföra vätskor mellan brunnarna i 8-väl MEMAs och en 96-bra tallrik.
Anmärkning: I detta protokoll utnyttjas hela uppsättningen av ligander som listas i tabell 2 . - Tina ligander på is. Kort snärta och snurra ner varje tub.
- Späd ligander till en arbets lager 200x med hjälp av tillverkarens rekommenderade buffert (vanligtvis PBS).
- Pipet 10 μL av varje 200x ligand lager i motsvarande brunn inom 96-brunn plattan.
- Tätnings-och lager plattorna vid-20 ° c.
Anmärkning: Gör ligand behandling plattor i omgångar, fånga alla metadata för nedströms analys.
6. odling av celler på MEMAs
- Block MEMAs för 20 min med 2 mL per brunn av icke-fouling blockerande buffert som innehåller 1% icke-fouling blockerande medel (tabell över material) i dubbeldestillerat vatten (DDH2O).
- Aspirera blockerande buffert och trippelsköljbrunnar med PBS. För att förhindra uttorkning, lämna slutlig volym PBS i brunnar tills den är klar för cellplätering.
Anmärkning: Det är oerhört bra att ha två bänk arbetare för cellodling steg på MEMAs. En bänk arbetstagare kan utföra aspiration steg, medan den andra utför tillägg steg. Det rekommenderas att använda en 1 mL flerkanals Pipettera med tips placerade för att matcha 8-brunnen plattan för pipettering och en Y-splitter med två Pasteur pipetter att aspirera flera brunnar på en gång. - Utsäde 2 x 105 MCF7 celler per brunn i 2 ml av Dulbecco är modifierad Eagle ' s medium (DMEM) medium som innehåller 10% foster bovint serum (FBS).
Anmärkning: Före en fullständig MEMA experiment, utföra ett cell titrering experiment för att optimera cell nummer så att MEMA fläckar har höga cell nummer (men är inte confluent) i slutet av den önskade experimentella varaktigheten. - Efter 2 − 18 h vidhäftning, aspirera medium och Ersätt med 2 mL reducerat odlingssubstrat (DMEM med 0,1% FBS).
Anmärkning: Reducerat serum (t. ex. 0,1% FBS) eller tillväxtfaktor-utarmade förhållanden kan användas vid denna tid för att isolera den stimulerande effekten av specifika ligander. - Tina en ligand behandling plattan på is. Centrifugera upptinad platta vid 200 x g i 1 min.
- Överför 200 μL av medlet från varje brunn i kulturen pläterar till anslå brunnen i behandlingen pläterar. Pipet upp och ner för att blanda ligand volym med medium och överföra denna blandning tillbaka till lämplig brunn i MEMA plattan.
- Lätt klippa för hand och returnera MEMA plattor till inkubatorn. Kultur under experimentets varaktighet i närvaro av ligand/ECM-kombinationen vid 37 ° c och 5% CO2.
Anmärkning: En typisk MEMA experiment körningar för 72 h; längre tid experiment kan kräva ersättning av medium och förnyad behandling med ligand. - Pulse MEMA brunnar vid 71 h med 100x 5-etynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) för en slutkoncentration på 10 μM. Inkubera i experimentella förhållanden med EdU för 1 h vid 37 ° c och 5% CO2.
Anmärkning: Andra levande cell behandlingar kan också användas vid denna tidpunkt.
7. fixering och färgning MEMAs
- Efter 72 h och alla levande cell behandlingar, aspirera brunnar. Fix MEMAs i 2 mL per brunn av 2% PARAFORMALDEHYD (PFA) för 15 min vid RT.
- Aspirera PFA. Permeabilize med 2 ml per brunn av 0,1% icke-jonaktivt ytaktivt ämne i 15 min.
- Aspirera den nonjoniska tensiden och tvätta med 2 mL per brunn av PBS. Aspirera PBS. Tvätta med 2 mL PBS med 0,05% polysorbat 20 (PBS-T).
Anmärkning: MEMA ytan är hydrofoba, och underlåtenhet att tvätta med PBS-T innan fläck och antikropp inkubation kommer att resultera i bildandet av håligheter i brunnar under inkubering steg och ge upphov till färgning artefakter. - Aspirera PBS-T. Lägg till EdU detekterings reaktions reagenser. Inkubera i 1 h vid RT, gunga och skyddas från ljus. Efter 1 h inkubering, släcka reaktion med den medföljande kommersiella släcka buffert.
Anmärkning: EdU detektering och färgning/antikropps steg kan utföras i 1,5 mL per brunn för att minska kostnaderna. - Aspirera på quenchbufferten och tvätta med PBS-T före inkuberingen med fläckar eller antikroppar.
- Inkubera Mema-brunnar med antikroppar mot Histon H3K9me3 (1:1000) och fibrillarin (1:400) i färgbuffert som innehåller 2% (w/v) bovint serumalbumin (BSA), 1 mm mgcl2 och 0,02% Nan3 över natten vid 4 ° c.
Anmärkning: Utför antikropps titreringar för att bestämma optimala koncentrationer innan du använder dem på en fullständig MEMA-uppsättning. - Efter primär antikropp eller fläck inkubation, tvätta brunnar 2x med PBS och en gång med PBS-T.
- Lägg till sekundära antikroppar (Donkey anti-Mouse IgG och Donkey anti-Rabbit IgG, båda 1:300) och 0,5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ fenylindol (DAPI). Inkubera i 1 h vid RT i mörker.
- Tvätta brunnar 2x med 2 mL per brunn av PBS, lämnar dem i den sista 2 mL PBS.
- Gå vidare till Imaging eller förvara färgade MEMAs för senare avbildning i PBS vid 4 ° c skyddat från ljus.
8. avbildning av MEMAs
- Bild MEMA på ett automatiserat avbildningssystem med lämpliga fluorescerande detekterings kanaler.
- Utdata resulterande bilddata till ett bildhanteringssystem. Segmentera celler och beräkna intensitetsnivåer med CellProfiler8.
9. analys av data
Anmärkning: Dataanalys består av normalisering, variation korrigering och sammanfattning av rå CellProfiler härledda data. I det här fallet används R-miljö med anpassad kod för att utföra alla steg. Dock kan alla statistiska miljö eller programvara utnyttjas för att utföra motsvarande åtgärder. Ett exempel på den anpassade koden för öppen källkod för R-miljön för analys finns på: https://www.Synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
- Förbearbeta och normalisera segmenterade bilddata.
- Bestäm antal spotceller med hjälp av DAPI-färgade kärnor.
- Auto-Gate EdU intensitet till etikettceller som EdU+. Mäta spridningen med hjälp av andelen EdU+ -celler på varje plats.
- Median sammanfatta cytoplasmiska fläckar och nukleära morfologi mätningar på spotnivå.
- Utföra borttagning av oönskade variation (RUV) normalisering på data för att förbättra datakvalitet9.
Anmärkning: Denna metod tillämpas på varje intensitet och morfologi signal självständigt som en matris med matriser med hjälp av rader och fläckar som kolumnerna som beskrivs tidigare9. - Tillämpa normalisering av bivariat Loess till RUV normaliserade rester med hjälp av arrayraden och arraykolumnen som de oberoende variablerna för att korrigera för rumsliga eller intensitetsrelaterade effekter.
- När normalisering har slutförts sammanfattar median replikat för varje villkor för mikromiljön för rapportering och ytterligare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att förenkla mikromiljö påverkan på celltillväxt och spridning och för att identifiera villkor som främjade eller hämmade celltillväxt och proliferation, var bröstcancer cellinjer MCF7 seedade på en uppsättning av åtta 8-väl MEMAs som beskrivs i protokollet. Detta test exponerade cellerna till 48 olika ECMs och 57 olika ligander, för totalt 2736 kombinatoriska mikromiljö förhållanden. Efter 71 h i kultur, celler pulsade med EdU, fast, permeablized, och färgade med DAPI, reaktionen för EdU upptäckt, en anti-Fibrillin antikropp, och en anti-H3K9me3 antikropp. Celler var avbildade på ett hög innehåll Mikroskop. Bilderna laddades upp till en Omero Server10, segmenterade med cellprofiler8, och normaliserades och analyserades i R9. De resultat som beskrivs nedan fokuserar på DAPI-och EdU-signalerna.
Den bildanalys plattform av MEMAs ger några resultat som liknar de som finns tillgängliga från flödescytometri metoder, såsom DNA-innehåll tomter visar 2N och 4N fraktioner för celler som behandlats med en given ligand (figur 3a), baserat på DAPI intensitet och yta. Dessa tomter ger belägg för villkor som främjar aktiv cell cykling kontra som framgår av tydliga bimodal toppar som motsvarar celler i G1 eller G2 faser kontra tillväxt gripna celler, som skulle visa förändringar i topparna jämfört med kontrollvillkor. Vi använder data för cell nummer och Färgnings intensitet för att sammanfatta data, där effekten av mikromiljön (ligander på en axel, ECM på den andra axeln) på både cell nummer (figur 3B) och EdU inkorporering (figur 3C) kan lättare ses som förändringar i heatmap färg och intensitet. Som framgår av dessa tomter, många av effekterna är ligand-driven, som ECM villkoret inte starkt påverkar cell nummer eller EdU positivitet. Nidogen-1 är ett tydligt undantag, eftersom närvaron av denna ECM-molekyl hämmar cell bindning och tillväxt av MCF7. Ligander som FGF6 och NRG1α (NRG 1,1 på tomter) öka cell nummer och har hög grad av EdU inkorporering, medan ligander som AREG och NRG1-SMDF (NRG 1.10 på tomter) hämmar cell bindning och/eller tillväxt av celler. Dessa fynd stöds av bilderna av de celler som växer på fläckarna, där en tydlig skillnad i cell nummer och EdU positivitet är uppenbar (se exempel i figur 3D).
Eftersom MEMA-plattformen är en nyare teknik validerades resultaten i separata analyser. MCF7 celler var seedade i 24-väl plattor belagda med kollagen i i DMEM medium med 10% FBS. Efter 18 h, media utbyttes för minskad tillväxtmedium (DMEM med 0,1% FBS) och celler behandlades med NRG1α, FGF6, eller AREG och odlade för 72 h. EdU lades 1 h före fixering. Celler färgas med DAPI och för EdU inkorporering, avbildas, segmenteras och analyseras. I likhet med de resultat som erhålls från MEMA-plattformen gav FGF6 och NRG1α båda upphov till högre cell nummer (figur 4A) och EdU inkorporering (figur 4B) jämfört med AREG-behandlade celler, validerar våra observationer i de ursprungliga MEMA-experimenten.
Figur 1 : Flödesschema som visar arbetsflödet och tidslinjen för de olika faserna i ett typiskt MEMA-experiment. När MEMAs skrivs ut, kan de lagras i rumstemperatur uttorkade i flera månader före användning. Typiskt, den experimentella fasen varar 3 − 4 dagar, men vissa långsamt växande primära celler har odlas på MEMAs i upp till 2 veckor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : ECM-källplattslayout för Array-utskrifter. Kollagen blocket trycks på MEMA som ett rutnät, vilket ger en mycket repetitiv uppsättning villkor som möjliggör mer robust normalisering mellan brunnar. De PBS-fyllda brunnar ger fukt till stöd i förebyggande av avdunstning under tryckprocessen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Exempel på data som genereras från ett typiskt MEMA-experiment. (A) cell Cykelprofiler av papperskorgen DAPI-intensitetsvärden kontra antal celler från en 8-brunns platta som behandlats med olika ligander och visar bifasisk DAPI-intensitet som indikerar cellerna i G1 kontra G2 cellcykelns fas. (B) heatmap visar normaliserade spot cell räknas grupperade efter likhet med hierarkisk klustring. Rött indikerar högre cell nummer och blått är lägre cell nummer. Ligander är på x-axeln, ECMs är på y-axeln. (C) heatmap visar normaliserad EdU inkorporering, med röd indikerar högre och blå indikerar lägre EdU inkorporering. Ligander är på x-axeln, ECMs är på y-axeln. (D) exempel på MCF7 celler som växer på en Mema Spot som behandlats med NRG1-α som visar hög grad av EdU inkorporering (rosa kärnor). Grön fläck är cell mask och blå är DAPI. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Validering av MEMA resultat i cellkultur. Akvantifiering av cell nummer till följd av behandling av MCF7 med olika ligander. Motsvarande antal MCF7 celler var pläterade i flerväggiga plattor sedan behandlas med antingen AREG, FGF6, eller NRG1α. Brunnar behandlade med AREG hade signifikant färre celler än de som behandlades med FGF6 (* * vilket indikerar elevens t-test p-värden mindre än 0,01) eller NRG1α (* indikerar ett p-värde på 0,05) vid 72 h post ligand behandling. Bkvantifiering av nivån på EdU INKORPORERING i MCF7 på grund av behandling med olika ligander, som i panel A. AREG behandling resulterar i en signifikant lägre andel celler som innehåller EdU än celler som behandlats med FGF6 (* *, p < 0,01) eller NRG1α (* * *, p = 0,01). Felstaplar representerar standardavvikelse. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Proteiners namn | Uniprot-ID | Lager Koncentration (μg/mL) |
Slutliga Koncentration (μg/mL) |
| ANGPT1 | 1 | Q15389 | 1 | 100 | 0,04 |
| ANGPT2 | 1 | O15123 | 1 | 100 | 0,2 |
| Areg | P15514 | 100 | 0,02 |
| BMP2 | P12643 | 100 | 0,1 |
| BMP3 | P12645 | 1000 | 0,1 |
| BMP4 | P12644 | 100 | 0,1 |
| BMP5 | 1 | P22003 | 1 | 100 | 0,1 |
| BMP6 | P22004 | 100 | 0,1 |
| BMP7 | P18075 | 100 | 0,1 |
| CSF2 | P04141 | 100 | 0,02 |
| CTGF | 1 | P29279 | 1 | 100 | 0,05 |
| CXCL12 | Alpha | P48061 | 2 | 100 | 0,01 |
| CXCL12 | Beta | P48061 | 1 | 100 | 0,03 |
| CXCL1 | P09341 | 100 | 0,004 |
| CXCL8 | 1 | P10145 | 1 | 100 | 0,3 |
| DLL1 | 1 | O00548 | 1 | 500 | 0,5 |
| DLL4 | Q9NR61 | 200 | 0,6 |
| EGF | 1 | P01133 | 1 | 500 | 0,01 |
| FASLG | 1 | P48023 | 1 | 10 | 0,02 |
| FGF2 | 3 | P09038 | 2 | 100 | 0,01 |
| FGF6 | P10767 | 100 | 0,01 |
| FLT3LG | 1 | P49771 | 1 | 50 | 0,001 |
| GPNMB | 1 | Q14956 | 1 | 100 | 0,5 |
| HGF | 1 | P14210 | 1 | 50 | 0,04 |
| IGF1 | 1 | P05019 | 1 | 200 | 0,01 |
| IGFBP2 | P18065 | 100 | 0,05 |
| IGFBP3 | 1 | P17936 | 1 | 100 | 0,1 |
| IL13 | P35225 | 100 | 0,01 |
| IL15 | IL15S48AA | P40933 | 1 | 50 | 0,01 |
| IL1B | P01584 | 25 | 0,001 |
| IL6 | P05231 | 100 | 0,01 |
| IL7 | 1 | P13232 | 1 | 100 | 0,01 |
| JAG1 | 1 | P78504 | 1 | 200 | 0,5 |
| JAG2 | Lång | Q9Y219 | 1 | 100 | 0,5 |
| KITLG | 1 | P21583 | 1 | 100 | 0,005 |
| KNG1 | HMW | P01042 | 1 | 100 | 0,2 |
| Lep | P41159 | 1000 | 0,002 |
| LYVE1 | Q9Y5Y7 | 100 | 0,05 |
| NRG1 | 10 | Q02297 | 10 | 100 | 0,01 |
| NRG1 | 1 | Q02297 | 1 | 100 | 0,05 |
| NRG1 | 6 | Q02297 | 6 | 100 | 0,01 |
| PDGFAB | go1990265 | 100 | 0,05 |
| PDGFB | 1 | P01127 | 1 | 100 | 0,05 |
| Ptn | P21246 | 100 | 0,5 |
| Shh | Q15465 | 100 | 0,5 |
| TGFB1 | | Cterminus | P01137 | Cterminus | 20 | 0,01 |
| TGFB1 | | Varv | P01137 | Varv | 100 | 0,15 |
| TGFB2 | A | P61812 | 1 | 20 | 0,01 |
| THPO | 1 | P40225 | 1 | 50 | 0,002 |
| TNFRSF11B | O00300 | 100 | 0,02 |
| TNFSF11 | 1 | O14788 | 1 | 100 | 0,01 |
| Tnf | P01375 | 100 | 0,01 |
| VEGFA | VEGF206 | P15692 | 1 | 100 | 0,01 |
| WNT10A | Q9GZT5 | 100 | 0,1 |
| WNT3A | 1 | P56704 | 1 | 200 | 0,1 |
| Wnt5a | 1 | P22725 | 1 | 100 | 0,1 |
Tabell 1: en fullständig förteckning över ligander som används för MEMA-experiment. Bimaculatum-ID, lagerkoncentrationer och slutliga arbetskoncentrationer tillhandahålls.
| ECM-protein | UniprotID | Lager koncentration (μg/mL) |
Slutliga Koncentration (μg/mL) |
Anteckningar |
| ALCAM | 1 | Q13740 | 1 | 100 | 30 | |
| CDH20 | Q9HBT6 | 300 | 80 | |
| CDH6 | 1 | P55285 | 1 | 100 | 40 | |
| CDH8 | P55286 | 100 | 20 | |
| CD44 | 1 | P16070 | 1 | 100 | 30 | |
| CEACAM6 | P40199 | 100 | 30 | |
| COL1A1 | P02453 | 5000 | 200 | flera underordnade enheter med flera bimaculatum-ID: n |
| COL2A1 | 2 | P02458 | 2 | 1000 | 200 | |
| COL3A1 | 1 | P02461 | 1 | 1000 | 200 | |
| COL4A1 | 1 | P02462 | 1 | 1000 | 200 | flera underordnade enheter med flera bimaculatum-ID: n |
| COL5A1 | P20908 | 1000 | 200 | |
| COL23A1 | 1 | Q86Y22 | 1 | 200 | 80 | |
| DSG2 | Q14126 | 100 | 30 | |
| CDH1 | 1 | P12830 | 1 | 100 | 40 | |
| ECM1 | 1 | Q16610 | 1 | 100 | 40 | |
| FN1 | 1 | P02751 | 1 | 1000 | 200 | |
| GAP43 | 1 | P17677 | 1 | 158 | 40 | |
| HyA-500K | 1000 | 200 | LOR-0005 | |
| HyA-50K | 1000 | 200 | LOR-0007 | |
| ICAM1 | P05362 | 400 | 80 | |
| ALCAM | 1 | Q13740 | 1 | 100 | 30 | |
| CDH20 | Q9HBT6 | 300 | 80 | |
| CDH8 | P55286 | 100 | 20 | |
| CD44 | 1 | P16070 | 1 | 100 | 30 | |
| CEACAM6 | P40199 | 100 | 30 | |
| DSG2 | Q14126 | 100 | 30 | |
| CDH15 | P55291 | 100 | 20 | |
| VCAM1 | 1 | P19320 | 1 | 1000 | 200 | |
| LAMA1 | P25391 | 500 | 200 | flera underordnade enheter med flera bimaculatum-ID: n |
| LAMA3 | 2 | Q16787 | 2 | 130 | 40 | |
| Lum | P51884 | 200 | 80 | |
| CDH15 | P55291 | 100 | 20 | |
| NID1 | 1 | P14543 | 1 | 100 | 9,3 μg/mL Nid, 130 μg/mL lam, 46,5 μg/mL COL4 | + COL4 och laminin |
| Omd | Q99983 | 100 | 40 | |
| SPP1 | A | P10451 | 1 | 100 | 40 | |
| CDH3 | 1 | P22223 | 1 | 100 | 40 | |
| PECAM1 | Lång | P16284 | 1 | 150 | 40 | |
| TNC | 1 | P24821 | 1 | 500 | 200 | |
| VCAM1 | 1 | P19320 | 1 | 1000 | 200 | |
| VTN | P04004 | 100 | 40 | |
| Bgn | P21810 | 100 | 40 | |
| DCN | A | P07585 | 1 | 300 | 80 | |
| POSTN | 1 | Q15063 | 1 | 100 | 40 | |
| Sparc | P09486 | 100 | 40 | |
| THBS1 | 1 | P07996 | 1 | 100 | 40 | |
| BCAN | 1 | Q96GW7 | 1 | 100 | 40 | |
| ELN | 3 | P15502 | 3 | 1000 | 200 | |
| FBN1 | P35555 | 254 | 80 |
Tabell 2: en fullständig förteckning över ECM-proteiner och-villkor som används i MEMA-experimenten. Bimaculatum-ID, lagerkoncentrationer och slutliga arbetskoncentrationer tillhandahålls. I vissa fall representerar det utskrivna villkoret ett proteinkomplex eller en kombination av flera proteiner, vilket anges i antecknings kolumnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vikten av "dimensionalitet" och sammanhang har varit en motiverande faktor i utvecklingen av in vitro-kultursystem som verktyg i karakterisering av cancerceller genom deras interaktion med mikromiljö11, och förmågan hos in vitro- kultur system för att efterlikna in vivo-miljön är en drivande kraft bakom strävan att förbättra dessa kultur system. In vitro-system är dock fortfarande betydande verktyg för cancerforskning just på grund av deras förmåga att destillera den komplexa in vivo situationen ner till en förenklad modell12.
Även 2D-system kan inkludera ECMs och ligands, de har traditionellt saknade kapacitet att förhöra en bred panel av kombinatoriska pertubagens. Populära kommersiella basalmembran extrakt möjliggör odling i 3D, men saknar härkomst en noggrant definierad panel av proteiner. De kommersiella utdragen lider typiskt av ofullständigt definierad sammansättning, som kan blanda ihop analys och resultera i betydande sats-till-sats variation3,13. Den MEMA plattformen övervinner dessa hinder, möjliggör studiet av förändringar i cellulära fenotyper, metabolisk aktivitet, differentiering status, och variationer i celltillväxt och proliferation eftersom de moduleras av specifika och definierade endogena Faktorer.
MEMA-plattformen är en kraftfull, medelhög till hög genomflöde metod för att bedöma effekterna av mikromiljön (både ECM och lösliga faktorer) på fenotyp av celler. Plattformen visar stor flexibilitet för de typer av analyser och celler för vilka den kan utnyttjas. Vi kan observera effekter från både lösliga ligander och ECM proteiner som cellerna exponeras. I själva verket fann vi nyligen att ligander var en viktig drivkraft för resistens mot HER2-riktade hämmare, men att dessa effekter kan moduleras av ECM5. En mängd olika celler, inklusive primära celler och cellinjer som härleds från olika celltyper, inklusive lungor, urinblåsa, prostata, bröst och bukspottkörtel, samt inducerade pluripotenta stamceller (iPS), har framgångsrikt kultiverats på MEMA-plattformen (se exempel i referenser5,7,14). Användningen av olika fläckar möjliggör avläsning av flera cellulära endpoints, inklusive celltillväxt, differentiering, och metabolism. Andra forskare har utökat plattformen för att förhöra effekten av stelhet eller elastiska Modulus, lägga till en extra dimension till MEMA-plattformen15. Slutligen, plattformen är mottaglig för att utföra narkotika skärmar för identifiering av mikromiljö villkor som antingen förbättra eller hämma läkemedels effekt, som vi och andra nyligen har rapporterat5,14,15 .
Det kanske mest kritiska steget till framgången för ett MEMA-experiment är att optimera cell beläggningstätheten. Optimera densiteten av cellerna säkerställer att tillräckligt med celler är närvarande för att ge robusta data, men inte så många att platsen blir alltför confluent. Confluent fläckar kan signifikant blanda ihop resultat, särskilt om proliferation används som en Endpoint, vilket gör det omöjligt att avgöra om låg spridnings frekvens är ett resultat av interaktioner med mikromiljö faktorer eller på grund av kontakthämning från hög cellulär densitet. Cell titrering experiment kan avslöja dessa problem, som genomsnittliga cell nummer per plats kommer att visa en linjär ökning med ökande antal celler pläterade, men kommer så småningom platå. Det optimala cellnumret bör väljas i kurvans linjära intervall.
Som nämnts ovan, MEMA plattformen är flexibel och kan förberedas på en mängd olika substrat med olika ytor. Dessa inkluderar glas rutschbanor och flerväggiga plåtformat. Enligt vår erfarenhet, inte alla Ytkemiska är mottagliga för MEMA utskrift, som vi har observerat fläck avlossning på vissa ytor på grund av dålig vidhäftning egenskaper och oförmåga att blockera celladhesion på andra hög vidhäftning ytor. Dessutom kräver byte mellan olika substrat optimering av buffertförhållanden, eftersom utförandet av utskriften med samma utskriftsbuffert kan variera beroende på ytkemin.
Diametern på de tryckta ECM-fläckarna spelar en viktig roll i kvaliteten på data. I allmänhet rekommenderar vi att du använder de största tryck stiften för diameter som är tillgängliga för det arrayer som används (vi använder för närvarande 350 μm-stift). Större diameter fläckar tillåter ett större antal celler att uppta en plats, vilket tenderar att resultera i mer robusta data än vad som genereras med mindre diameter stift. Eftersom bindningen av cellerna är en stokastisk process, det tenderar att vara en hög grad av variation i de data som är relaterade till antalet celler som ursprungligen var knutna till varje plats. Därför rekommenderar vi att du skriver ut ett stort antal replikat för varje ECM-tillstånd. Vi skriver ut 10 − 15 ECM-replikat i varje brunn med våra aktuella utskriftsförhållanden för att säkerställa robust statistik.
Vi har noterat i våra tidigare experiment som till största delen, ligand effekter tenderar att dominera över ECM effekter. Detta kan delvis bero på vårt beslut att lägga till kollagen I till alla ECM fläckar, vilket garanterar robust cell bindning. Men vi tror att detta också kan homogenisera ECM effekter, eftersom de flesta fläckar tenderar att bete sig på ett sätt som är mycket likt kollagen I. ändring av dekorfärgs sammansättningen för att utesluta kollagen I kan resultera i differential cells beteende till följd av interaktionen med ECM, men också avsevärt påverkar cell bindning, vilket resulterar i många fler obesatta fläckar. Användare bör skräddarsy sin ECM sammansättning hålla dessa skillnader i åtanke, särskilt de som är intresserade av stamceller och stamcells celler och differentiering, där matrisen kan ha en betydande inverkan16.
Vi utför vanligtvis MEMA-analyserna under relativt korta tidsperioder (t. ex. 72 h maximum). Detta beror på att cellerna är begränsade till fläckarna (blockeringsbufferten tillåter inte tillväxt utanför fläckarna i vår erfarenhet). Med snabbt dividera celler, tillväxt längre än 72 h kommer att leda till överväxt av platsen, vilket i sin tur komplimenterar bildsegmentering som celler blir trångt och stapla upp på varandra, och kan också påverka data som tillväxt gripande kan inträffa med kontakthämning. Vi har utfört längre behandlingar med mycket långsamt växande primära celler (10 − 14 dagar), men försiktighet måste iakttas i dessa analyser för att byta media och fylla på ligander var 3 − 4 dagar.
Fortsatta satsningar på att utveckla MEMA-plattformen är inriktade på två intresseområden, maximering av den optiska kvaliteten för avbildning och optimering inom mindre odlings fartyg. Optisk kvalitet blir en avgörande faktor när forskare kräver högre upplösning mikroskopi att identifiera subcellulära lokalisering av deras markörer av intresse. Initiala skärmar kan utföras med lägre upplösning på hög kapacitet Mikroskop följt av avbildning av specifika platser av intresse på högre upplösning instrument, men bildkvaliteten kan äventyras om de optiska egenskaperna hos substratet är dålig. Förbättring av de optiska egenskaperna hos substratet skulle göra det möjligt för forskare att utföra de första skärmarna på högupplösta bildsystem utan att behöva hämta valda bilder med högre upplösning. Slutligen, förmågan att utföra MEMAs i mindre odlings fartyg, såsom 96-bra tallrikar, skulle möjliggöra en minskning av behandlings volymen och en utvidgning av förhörs ligander och replikat. Denna övergång kräver optimering av substrat-buffert-proteininteraktioner och array utskrift inom nya odlings fartyg. Sådana pågående insatser kommer att förbättra MEMA-plattformen och utöka sin kraftfulla förmåga att identifiera relevanta mikromiljöproteiner som förändrar cellulära fenotyper för en mängd olika celltyper, som sedan kan undersökas i bekräftande analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH gemensam fond bibliotek av Network cellulära signaturer (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H., och J. E. K).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| Vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
- Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
- Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
- Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , Report No. 820 (2013).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
- Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
- Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
- Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
