Summary
Lo scopo del metodo qui presentato è quello di mostrare come i microarray di microambiente (MEMA) possono essere fabbricati e utilizzati per interrogare l'impatto di migliaia di semplici microambienti combinatori sul fenotipo delle cellule coltivate.
Abstract
Comprendere l'impatto del microambiente sul fenotipo delle cellule è un problema difficile dovuto alla complessa miscela di fattori di crescita solubili e proteine associate a matrici nel microambiente in vivo. Inoltre, i reagenti prontamente disponibili per la modellazione di microambienti in vitro in genere utilizzano complesse miscele di proteine che sono incompletamente definite e soffrono di variabilità in lotti. La piattaforma microarray microambiente (MEMA) consente la valutazione di migliaia di semplici combinazioni di proteine microambientali per il loro impatto sui fenotipi cellulari in un unico test. I MEMA sono preparati in piastre di pozzo, che consente l'aggiunta di singoli ligandri per separare pozzi contenenti proteine a matrice extracellulare (ECM) suddivise. La combinazione del ligando solubile con ogni ECM stampato forma una combinazione unica. Un tipico test MEMA contiene più di 2.500 microambienti combinatori unici a cui le cellule sono esposte in un unico test. Come test case, la linea cellulare del cancro al seno MCF7 è stata placcata sulla piattaforma MEMA. L'analisi di questo analisi ha identificato i fattori che migliorano e inibiscono la crescita e la proliferazione di queste cellule. La piattaforma MEMA è altamente flessibile e può essere estesa per l'uso con altre questioni biologiche al di là della ricerca sul cancro.
Introduction
La raccolta di linee cellulari tumorali su plastica in monostrati bidimensionali (2D) rimane uno dei principali cavalli di battaglia per i ricercatori oncologici. Tuttavia, il microambiente è sempre più riconosciuto per la sua capacità di impatto sui fenotipi cellulari. Nel cancro, il microambiente tumorale è noto per influenzare più comportamenti cellulari, tra cui la crescita, sopravvivenza, invasione, e la risposta alla terapia1,2. Le colture cellulari monostratore tradizionali in genere mancano di influenze microambientali, il che ha portato allo sviluppo di analisi tridimensionali più complesse (3D) per far crescere le cellule, compresi gli estratti di membrana seminterrato purificati disponibili in commercio. Tuttavia, queste matrici purificate sono in genere complicate da usare e soffrono di problemi tecnici come la variabilità del lotto3 e le composizioni complesse3. Di conseguenza, può essere difficile assegnare la funzione a specifiche proteine che possono avere un impatto sui fenotipi cellulari3.
Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato la tecnologia microarray microambiente (MEMA), che riduce il microambiente fino a semplici combinazioni di matrice extracellulare (ECM) e proteine solubili del fattore di crescita4,5 . La piattaforma MEMA consente l'identificazione di fattori microambientali dominanti che influenzano il comportamento delle cellule. Utilizzando un formato di matrice, migliaia di combinazioni di fattori di microambiente possono essere tese in un unico esperimento. La MEMA qui descritta interroga 2.500 diverse condizioni di microambiente unico. Le proteine ECM stampate in lastre di pozzo formano pastiglie di crescita su cui le cellule possono essere coltivate. I ligandi solubili vengono aggiunti ai singoli pozzi, creando microambienti combinatori unici (ECM e ligando) su ogni punto diverso a cui sono esposte le cellule. Le cellule vengono coltivate per diversi giorni, quindi fisse, colorate e imagete per valutare i fenotipi cellulari come risultato dell'esposizione a queste specifiche combinazioni di microambienti. Poiché i microambienti sono semplici combinazioni, è semplice identificare le proteine che guidano i principali cambiamenti fenotipici nelle cellule. I MEMA sono stati utilizzati con successo per identificare i fattori che influenzano più fenotipi cellulari, compresi quelli che guidano le decisioni del destino cellulare e la risposta alla terapia4 ,5,6,7. Queste risposte possono essere convalidate in semplici esperimenti 2D e possono quindi essere valutate in condizioni che riassumono più pienamente la complessità del microambiente tumorale. La piattaforma MEMA è altamente adattabile a una varietà di tipi di cellule ed endpoint, a condizione che siano disponibili buoni biomarcatori fenotipici.
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Protocol
NOT: Una panoramica dell'intero processo MEMA, incluso il tempo stimato, è descritta nel diagramma di flusso illustrato nella Figura 1. Questo protocollo descrive in dettaglio la fabbricazione di MEMA in lastre a 8 pozze. Il protocollo può essere adattato per altre piastre o diapositive.
1. Preparazione di buffer proteici, diluenti e coloranti
- Fiale di ECMs Equilibrat ligando, e citochine a temperatura ambiente (RT) e centrifuga brevemente. Aggiungere il volume appropriato del buffer RT appropriato come indicato nella scheda dati del prodotto. Seguire la raccomandazione del produttore per le concentrazioni di scorte.
NOT: Un elenco completo dei ligandi e degli EPER con le loro scorte e le loro concentrazioni finali è riportato nelle tabelle 1 e nella tabella 2. Sia i ligandi che gli EMM sono tipicamente utilizzati alla più alta concentrazione della gamma raccomandata dal produttore che suscita un effetto biologico nei saggi di coltura standard di 2 giorni. Maneggiare le proteine delicatamente e in armadietti di biosicurezza sotto il flusso laminare per evitare la contaminazione. - Incubare fiale con dondolo delicato a RT per 1 h. Non vortice proteine in quanto ciò può causare loro la denatura.
- Proteine aliquote per lo stoccaggio a lungo termine in modo che tutti gli usi siano monouso solo per evitare la degradazione con cicli di congelamento/scongelamento ripetuti. Conservare le proteine lofilizzate a -80 gradi centigradi (se non diversamente specificato) fino a quando necessario. Fare attenzione a raccogliere tutti i metadati per riferimento futuro, ad esempio: (i) nome della proteina, (ii) data preparata, (iii) numero di lotto/batch, (iv) fornitore, (v) numero di catalogo, concentrazione (vi), volume (vii) e (viii) preparatore.
- Preparare il buffer diluente contenente 20% (v/v) glicerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7.2 e sterilizzare il filtro. Mantenere questo buffer sterile e memorizzare in RT.
- Preparare il buffer di colorazione contenente 2% (w/v) BSA, 1 mM MgCl2e 0,02% NaN3 in pbx (Phosphate-buffered). Filtrare e conservare a 4 gradi centigradi.
2. Preparazione di una piastra sorgente ECM
- Rimuovere gli stock di proteine ECM da stampare e scongelare sul ghiaccio. Registrare tutti i numeri di lotto per il rilevamento dei metadati.
- I tubi di proteine scongerate pulivano delicatamente per garantire una corretta sospensione e spin giù in una centrifuga.
-
Crea miscele di stampa ECM (EPM) e un fiduciario fluorescente da utilizzare da un robot a movimentazione liquida che creerà le lastre casuali di 384 pozze.
NOTA: Le lastre di origine 384-well verranno utilizzate da una stampante di serie di pin touch per creare gli array stampati in 8 lastre ben.- Etichettare i tubi di microcentrifuga da 1,5 ml per ogni EPM e fiduciario.
- Preparare ogni EPM combinando 125 l di buffer diluente (vedere il punto 1.4) con il volume appropriato del brodo ECM e portare la miscela fino a un volume totale di 250 gradi con PBS. Le concentrazioni finali in ogni tubo EPM saranno 1x proteina ECM, 5 mM EDTA, 10% glicerol e 100 mM Tris.
- Preparare un fiduciario fluorescente sciogliendolo nell'appropriato buffer specificato dal produttore e trasferire 250 l in un tubo fiduciario etichettato.
3. Creazione della piastra di origine utilizzando un gestore di liquidi
- Progettare un layout a lamiera a 384 pozze che perlizzi le posizioni degli ECC ed è ottimizzato per la testa del pin della stampante di array utilizzata. Progettare il posizionamento del fiduciario in modo che venga stampato nella riga 1, colonna 1 posizione di ogni bene per facilitare l'orientamento della matrice.
NOT: Per garantire dati affidabili, vengono utilizzati un totale di 14-15 repliche di ogni ECM. Includere repliche aggiuntive di collagene o di un altro ECM che produce un robusto attaccamento per la valutazione dell'uniformità della legatura. Il layout potrebbe dover utilizzare più lastre di 384 pozze a seconda del numero di ECC di interesse. - Trasferire i tubi EPM a un gestore liquido, mantenendo i tubi a 4 gradi centigradi con un rack di tubi raffreddati o utilizzando un robot per la movimentazione del liquido situato in una stanza fredda.
- Utilizzando il software del gestore liquido, eseguire un programma per trasferire 15 l- di ogni EPM e il fiducialo ai pozzi predesignati all'interno delle 384-well targhe di origine.
- Pipet PBS in qualsiasi pozzi inutilizzati per aumentare l'umidità e proteggere contro la disidratazione durante il processo di stampa.
NOT: Vedere Figura 2 per un esempio di un set di piastra di origine 384-well che è ottimizzato per una testa di pin 4 x 7 e include un collagene I blocco e PBS. - Sigillare le lastre e tenere a 4 gradi centigradi fino a quando non è pronto per la stampa.
4. Stampa meMBR utilizzando un robot di stampa array
NOT: La parte seguente del protocollo descrive specificamente la preparazione e l'uso di MEMA per studiare l'impatto di diverse proteine microambientali sulla crescita e la proliferazione delle cellule MCF7. Tuttavia, il protocollo può essere facilmente adattato per utilizzare diversi ligando, EMM e cellule per studiare altre linee cellulari e punti finali di interesse.
-
Utilizzando una stampante touch pin, stampare EPM e punti fiduciari in 8 lastre di pozzo. Stampare più repliche di ogni condizione ECM per garantire la riproducibilità.
NOTA: per ottenere una formazione ottimale dei punti è possibile utilizzare altri formati di lamiera o diapositive, ma potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione del buffer per ottenere una formazione ottimale dei punti.- Stampare gli ECU per il MEMA utilizzando perni di 350 m di diametro disposti in una configurazione della testina di stampa 4 x 7. Stampare le matrici nelle lastre 8-well come 20 colonne per 35 righe, per un totale di 700 punti. Array più grandi sono possibili in queste piastre, ma sono dotati di un compromesso di maggiori effetti di bordo sia in legare cellulare e colorazione.
- Dopo la stampa, conservare le lastre in un desiccatore per un minimo di 3 giorni prima dell'uso.
5. Creazione di piastre di trattamento ligando
- Progetta un layout a lamiere da 96 po' che include i ligandi di interesse. Per facilitare il trattamento di molte piastre MEMA contemporaneamente, progettare questa piastra con spaziatura che consente l'uso di un tubo multicanale con 4 punte distanziate per trasferire liquidi tra i pozzi di 8-well MEMA e una piastra di 96 pozzetti.
NOT: In questo protocollo viene utilizzato il set completo di ligandi elencati nella tabella 2. - Scongela i ligogi sul ghiaccio. Brevemente scorrere e girare verso il basso ogni tubo.
- Diluire i ligandi a un magazzino di lavoro 200x utilizzando il buffer consigliato dal produttore (in genere PBS).
- Tubo 10 l di ogni 200x ligand brodo nel pozzo corrispondente all'interno della piastra 96-pozze.
- Sigillare e conservare le piastre a -20 gradi centigradi.
NOT: Crea piastre di trattamento del ligando in lotti, catturando tutti i metadati per l'analisi a valle.
6. Coltivare le cellule sulle MEMA
- Bloccare meME per 20 min con 2 mL per pozzo di buffer di blocco non incrostato contenente 1% agente di blocco non incrostazione (Tabella dei materiali) in acqua a doppia distillazione (ddH2O).
- Aspirati buffer di blocco e triplo risciacquo pozzi con PBS. Per evitare l'idratazione, lasciare il volume finale di PBS in pozze fino a quando non è pronto per la placcatura cellulare.
NOT: È estremamente utile avere due bench worker per le fasi di coltura cellulare sulle MEMA. Un banco può eseguire passaggi di aspirazione, mentre il secondo esegue passaggi di addizione. Si consiglia di utilizzare un pipet multicanale da 1 mL con punte distanziate per abbinare la piastra di 8 pozzetti per la pipettatura e uno splitter Y con due pipette Pasteur per aspirare più pozzi contemporaneamente. - Seme 2 x 105 cellule MCF7 per pozzo in 2 mL del mezzo medio di Eagle (DMEM) modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS).
NOT: Prima di un esperimento MEMA completo, eseguire un esperimento di titolazione cellulare per ottimizzare il numero di celle in modo che i punti MEMA abbiano numeri di cella elevati (ma non siano confluenti) alla fine della durata sperimentale desiderata. - Dopo 2-18 h di adesione, aspirare medio e sostituire con 2 mL di mezzo a crescita ridotta (DMEM con 0.1% FBS).
NOT: Siero ridotto (ad esempio, 0,1% FBS) o condizioni di esaurimento del fattore di crescita in questo momento può essere utilizzato per isolare l'impatto stimolatore di specifici ligandi. - Scongelare una piastra di trattamento del ligando sul ghiaccio. Centrifuga scongelata piastra a 200 x g per 1 min.
- Trasferire 200 l di mezzo da ogni pozzo nella piastra di coltura al pozzo appropriato nella piastra di trattamento. Pipet su e giù per mescolare il volume di ligando con medio e trasferire questa miscela di nuovo al pozzo appropriato nella piastra MEMA.
- Roccia leggermente a mano e riportando le lastre MEMA all'incubatrice. Coltura per la durata dell'esperimento in presenza della combinazione ligand/ECM a 37 e 5% di CO2.
NOT: Un tipico esperimento MEMA dura 72 h; esperimenti di maggiore durata possono richiedere la sostituzione del mezzo e il ritrattamento con legamento. - Pulse MEMA pozzi a 71 h con 100x 5-ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU) per una concentrazione finale di 10 M. Incubare in condizioni sperimentali con EdU per 1 h a 37 s C e 5% CO2.
NOT: Altri trattamenti con cellule vive possono anche essere utilizzati in questo momento.
7. Fissaggio e colorazione delle MEMA
- Dopo 72 h e tutti i trattamenti a cellule vive, aspirate pozzi. Fissare MEMAs in 2 mL per pozzo di 2% paraformaldeide (PFA) per 15 min a RT.
- AspiraTo PFA. Permeabilizzare con 2 mL per pozzo dello 0,1% surfactant nonionico per 15 min.
- Aspirata il surfactant nonionico e lavare con 2 mL per pozzetto di PBS. PbS di Aspirate. Lavare con 2 mL di PBS con 0,05% di polisoromatto 20 (PBS-T).
NOT: La superficie MEMA è idrofobica, e il mancato lavaggio con PBS-T prima dell'incubazione di macchie e anticorpi comporterà la formazione di vuoti nei pozzi durante le fasi di incubazione e darà origine a manufatti di colorazione. - Aspira TOPB-T. Aggiungere reagenti di reazione di rilevamento EdU. Incubare per 1 h a RT, a dondolo e protetto dalla luce. Dopo 1 h incubazione, spegnire la reazione con il buffer di slittamento commerciale fornito.
NOT: Il rilevamento EdU e la colorazione/anticorpo possono essere eseguiti in 1,5 mL per pozzo per ridurre i costi. - Aspirare il tampone di tintura e lavare con PBS-T prima dell'incubazione con macchie o anticorpi.
- Incubare pozzi MEMA con anticorpi contro l'istone H3K9me3 (1:1,000) e fibrillarin (1:400) in buffer di colorazione contenente 2% (w/v) siero albumina bovina (BSA), 1 mM MgCl2 e 0.02% NaN3 per la notte a 4 gradi centigradi.
NOT: Eseguire titrations anticorpale per determinare le concentrazioni ottimali prima di utilizzarle su un set MEMA completo. - Dopo l'incubazione primaria di anticorpi o macchie, lavare i pozzi 2x con PBS e una volta con PBS-T.
- Aggiungere gli anticorpi secondari (IgG anti-tono d'asino e IgG anti-coniglio d'asino, entrambi 1:300) e 0,5 g/mL 4' 6-diamidino-2-fenillindole (DAPI). Incubare per 1 h a RT al buio.
- Lavare i pozzi 2x con 2 mL per pozzetto di PBS, lasciandoli negli ultimi 2 mL PBS.
- Procedere con l'imaging o conservare i MEMA macchiati per l'imaging successivo in PBS a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
8. Imaging di MEMA
- Immagine MEMA su un sistema di imaging automatizzato con canali di rilevamento fluorescente appropriati.
- Output dei dati immagine risultanti in un sistema di gestione delle immagini. Segmentare le celle e calcolare i livelli di intensità utilizzando CellProfiler8.
9. Analisi dei dati
NOT: L'analisi dei dati consiste nella normalizzazione, nella correzione delle variazioni e nel riepilogo dei dati derivati di CellProfiler non elaborati. In questo caso, l'ambiente R con codice personalizzato viene utilizzato per eseguire tutti i passaggi. Tuttavia, qualsiasi ambiente statistico o programma software può essere utilizzato per eseguire le azioni equivalenti. Un esempio del codice personalizzato open source per l'ambiente R per l'analisi è disponibile all'indirizzo: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
- Pre-elaborare e normalizzare i dati immagine segmentati.
- Determinare il numero di cellule spot utilizzando i nuclei macchiati DAPI.
- Intensità EdU auto-gate per etichettare le celle come EdU. Misurare la proliferazione utilizzando la proporzione di cellule EdU in ogni punto.
- Mediani riassumono le macchie citoplasmatiche e le misurazioni della morfologia nucleare a livello spot.
- Eseguire la rimozione della normalizzazione delle variazioni indesiderate (RUV) sui dati per migliorare la qualità dei dati9.
NOT: Questo approccio viene applicato a ogni segnale di intensità e morfologia in modo indipendente come matrice con matrici che utilizzano le righe e le macchie come le colonne come descritto in precedenza9. - Applicare la normalizzazione di bivariate loess ai residui normalizzati RUV utilizzando la riga della matrice e la colonna della matrice come variabili indipendenti per correggere gli effetti spaziali o correlati all'intensità.
- Una volta completata la normalizzazione, la mediana riepiloga le repliche per ogni condizione di microambiente per la creazione di report e un'ulteriore analisi.
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Representative Results
Per semplificare gli impatti microambientali sulla crescita e la proliferazione delle cellule e per identificare le condizioni che hanno promosso o inibito la crescita e la proliferazione cellulare, la linea cellulare del cancro al seno MCF7 è stata seminata su una serie di otto MEMA con 8 carri come descritto nel protocollo. Questo test ha esposto le cellule a 48 diversi EPER e 57 diversi ligandi, per un totale di 2736 condizioni microambientali combinatori. Dopo 71 h in coltura, le cellule sono state pulsate con EdU, fisso, permeablizzato e macchiato con DAPI, la reazione per il rilevamento EdU, un anticorpo anti-fibrillina, e un anticorpo anti-H3K9me3. Le cellule sono state immagini in un microscopio ad alto contenuto. Le immagini sono state caricate su un server Omero10, segmentate utilizzando CellProfiler8e normalizzate e analizzate in R9. I risultati descritti di seguito si concentrano sui segnali DAPI ed EdU.
La piattaforma di analisi delle immagini dei MEMA produce alcuni risultati simili a quelli disponibili dagli approcci di citometria di flusso, come i grafici del contenuto del DNA che mostrano frazioni 2N e 4N per le cellule trattate con un determinato ligando (Figura 3A), in base al DAPI l'intensità e l'area. Questi complotti forniscono prove per le condizioni che promuovono il ciclismo cellulare attivo rispetto a quanto indicato da picchi bimodali chiari corrispondenti alle cellule nelle fasi G1 o G2 rispetto alle cellule arrestate di crescita, che mostrerebbero cambiamenti nei picchi rispetto alle condizioni di controllo. Utilizziamo il numero di cella e i dati sull'intensità delle macchie per riepilogare i dati, dove l'impatto del microambiente (legature su un asse, ECM sul secondo asse) su entrambi i numeri di cella (Figura 3B) e l'incorporazione di EdU (Figura 3C) possono essere più facilmente visti come cambiamenti nel colore e nell'intensità della mappa termica. Come si è visto da questi appezzamenti, molti degli effetti sono ligando-driven, come la condizione ECM non ha fortemente impatto numero di cella o positività EdU. Nidogen-1 è una chiara eccezione, poiché la presenza di questa molecola ECM inibisce il legame cellulare e la crescita di MCF7. I ligandi come f.FGF6 e NRG1 (NRG1.1 su appezzamenti) migliorano il numero di cellule e hanno alti tassi di incorporazione EdU, mentre i ligandi come AREG e NRG1-smdf (NRG1.10 su lotti) inibiscono l'associazione cellulare e/o la crescita delle cellule. Questi risultati sono supportati dalle immagini delle cellule che crescono sui punti, dove è evidente una netta differenza nel numero di cellule e nella positività dell'EdU (vedere l'esempio in Figura 3D).
Poiché la piattaforma MEMA è una tecnologia più recente, i risultati sono stati convalidati in analisi separate. Le cellule MCF7 sono state semiate in 24 lastre di benessere rivestite con collagene I nel mezzo DMEM con 10% FBS. Dopo 18 h, i media sono stati scambiati per un mezzo di crescita ridotto (DMEM con 0,1% FBS) e le cellule sono state trattate con NRG1, FGF6 o AREG e coltivate per 72 h. EdU è stato aggiunto 1 h prima della fissazione. Le cellule sono state macchiate con DAPI e per l'incorporazione, l'immagine, la segmentazione e l'analisi di EdU. Analogamente ai risultati ottenuti dalla piattaforma MEMA, la FGF6 e la NRG1 hanno dato luogo a numeri di cella più elevati (Figura 4A) e tassi di incorporazione EdU (Figura 4B) rispetto alle cellule trattate areG, convalidando le nostre osservazioni in gli esperimenti MEMA originali.
Figura 1 : diagramma di flusso che mostra il flusso di lavoro e la sequenza temporale per le diverse fasi di un tipico esperimento MEMA. Una volta stampati, i MEMA possono essere conservati a temperatura ambiente desiccati per diversi mesi prima dell'uso. Tipicamente, la fase sperimentale dura 3/4 giorni, ma alcune cellule primarie a crescita lenta sono state coltivate su MEMA per un massimo di 2 settimane. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : layout della lastra di origine ECM per la stampa di array. Il blocco di collagene viene stampato su MEMA come griglia, che fornisce una serie altamente ripetitiva di condizioni che consentono una normalizzazione più robusta tra i pozzi. I pozzetti riempiti con PBS forniscono umidità per aiutare nella prevenzione dell'evaporazione durante il processo di stampa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Esempi di dati generati da un tipico esperimento MEMA. (A) Profili del ciclo cellulare dei valori di intensità DAPI collocati rispetto ai conteggi cellulari da una piastra di 8 pozzetti trattata con diversi ligandi, mostrando un'intensità DAPI bifasica che indica le cellule nella fase del ciclo cellulare G1 rispetto alla fase del ciclo cellulare G2. (B) Mappa di calore che mostra conteggi di celle spot normalizzate raggruppate per somiglianza utilizzando il clustering gerarchico. Il rosso indica un numero di cella più alto e il numero di cella blu è il numero di cella inferiore. I ligandi sono sull'asse x, gli EMM sono sull'asse y. (C) Mappa di calore che mostra l'incorporazione EdU normalizzata, con il rosso che indica un'incorporazione EdU inferiore. I ligandi sono sull'asse x, gli EMM sono sull'asse y. (D) Esempio di cellule MCF7 in crescita su uno spot MEMA trattato con NRG1-z che mostra alti tassi di incorporazione EdU (nuclei rosa). La macchia verde è la maschera per le cellule e il blu è DAPI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : la convalida di MEMA determina la coltura cellulare. (A) Quantificazione del numero di cellule risultante dal trattamento di MCF7 con diversi ligandi. Un numero equivalente di cellule MCF7 è stato placcato in piastre multiwall e poi trattato con AREG, FGF6 o NRG1. I pozzi trattati con AREG avevano un numero significativamente inferiore di cellule rispetto a quelle trattate con FGF6 (sezione indicazione dei valori p di test t dello studente inferiori a 0,01) o NRG1 (- indica un valore p di 0,05) a 72 h dopo il trattamento del ligando. (B) Quantificazione del livello di incorporazione di EdU in MCF7 a causa di trattamento con diversi ligandi, come nel pannello A. Il trattamento AREG comporta una percentuale significativamente inferiore di cellule che incorporano EdU rispetto alle cellule trattate con FGF6 (Sezione PF6 (,p < 0,01) o NRG1 (NRG1 ). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nome proteina | ID Uniprot | merce concentrazione (G/mL) |
ultimo concentrazione (G/mL) |
ANGPT1 | Q15389 | 100 del sistema | 0,04 (in linguaggio da 20>: |
ANGPT2 | O151231 | 100 del sistema | 0,2 0,2 |
AREG | P15514 | 100 del sistema | 0,02 (in linguaggio 02) |
BMP2 | P12643 | 100 del sistema | 0.1 0 |
BMP3 | P12645 | 1000 | 0.1 0 |
BMP4 | P12644 | 100 del sistema | 0.1 0 |
BMP5 | P22003 | 100 del sistema | 0.1 0 |
BMP6 (in inglese) | P22004 | 100 del sistema | 0.1 0 |
BMP7 | P18075 | 100 del sistema | 0.1 0 |
CsF2 (informazioni in base alla prima proprietà) | P04141 | 100 del sistema | 0,02 (in linguaggio 02) |
CTGF 1 | P29279 | 100 del sistema | 0,05 (in via di sin. |
CXCL12 alfa m inv f inv | P48061-2 | 100 del sistema | 0,01 |
CXCL12 Beta | P48061 | 100 del sistema | 0,03 (in vi estati) |
CXCL1 (in modo intasato) | P09341 | 100 del sistema | 0.004 (in questo 04) |
CXCL8 | P10145 | 100 del sistema | 0.3 0.3 |
DLL1-1 | O00548 | 500 | 0,5 0,5 |
DLL4 | Q9NR61 | 200 anni | 0,6 (in inglese) |
L'EGF 1 | P01133 | 500 | 0,01 |
FASLG 1 | P48023 | 10 del sistema | 0,02 (in linguaggio 02) |
FGF2 -3 | P09038-2 | 100 del sistema | 0,01 |
FGF6 | P10767 | 100 del sistema | 0,01 |
FLT3LG | P4977111 | 50 anni | 0.001 (intito) |
GRUPPO DI gruppo 1 | Q14956 | 100 del sistema | 0,5 0,5 |
HGF 1 | P14210 | 50 anni | 0,04 (in linguaggio da 20>: |
IGF1 1 | P05019 | 200 anni | 0,01 |
IGFBP2 | P18065 | 100 del sistema | 0,05 (in via di sin. |
IGFBP3 | P17936 | 100 del sistema | 0.1 0 |
IL13 (in uso) | P35225 | 100 del sistema | 0,01 |
IL15 IL15S48AA | P40933 | 50 anni | 0,01 |
IL1B (ilminfa a i m | P01584 | 25 mi lato | 0.001 (intito) |
IL6 (in inglese) | P05231 | 100 del sistema | 0,01 |
IL7 | P13232 | 100 del sistema | 0,01 |
IL sistema DI controllo DI SISTEMA | P78504 | 200 anni | 0,5 0,5 |
IL file JAG2 lungo | Q9Y219 | 100 del sistema | 0,5 0,5 |
KITLG 1 | P21583 | 100 del sistema | 0,005 (in questo da 20>) |
KNG1 HMW | P01042 | 100 del sistema | 0,2 0,2 |
Lep | P41159 | 1000 | 0.002 (in 3:0) |
LVE1 | Q9Y5Y7 | 100 del sistema | 0,05 (in via di sin. |
NRG1-10 | Q02297 | 100 del sistema | 0,01 |
NRG1 | Q02297 | 100 del sistema | 0,05 (in via di sin. |
NRG1-6 | Q02297 | 100 del sistema | 0,01 |
PDGFAB | go1990265 | 100 del sistema | 0,05 (in via di sin. |
PDGFB 1 | P01127 | 100 del sistema | 0,05 (in via di sin. |
Ptn | P21246 | 100 del sistema | 0,5 0,5 |
Shh | Q15465 | 100 del sistema | 0,5 0,5 |
TGFB1 Cterminus | P01137 Cterminus | 20 anni | 0,01 |
TGFB1 Giro | P01137 Giro | 100 del sistema | 0.15 |
TGFB2 un | P61812 | 20 anni | 0,01 |
IL TPO 1 | P40225 | 50 anni | 0.002 (in 3:0) |
TNFRSF11B | O00300 | 100 del sistema | 0,02 (in linguaggio 02) |
TNFSF11 | O14788 | 100 del sistema | 0,01 |
Tnf | P01375 | 100 del sistema | 0,01 |
VEGFA VEGF206 | P15692 | 100 del sistema | 0,01 |
WNT10A | Q9G-T5 | 100 del sistema | 0.1 0 |
WNT3A 1 | P56704 | 200 anni | 0.1 0 |
Wnt5a 1 | P22725 | 100 del sistema | 0.1 0 |
Tabella 1: L'elenco completo dei ligandi utilizzati per gli esperimenti MEMA. Vengono forniti l'ID uniprot, le concentrazioni di scorte e le concentrazioni di lavoro finali.
Proteine ECM | UniprotID | Concentrazione delle scorte (G/mL) |
ultimo concentrazione (G/mL) |
Note |
ALCAM 1 | Q13740 | 100 del sistema | 30 milio | |
CDH20 (in questo caso) | Q9HBT6 | 300 | 80 | |
CDH6 | P55285 | 100 del sistema | 40 anni ( | |
CDH8 (in questo caso) | P55286 | 100 del sistema | 20 anni | |
CD44 | P16070 | 100 del sistema | 30 milio | |
CEACAM6 | P40199 | 100 del sistema | 30 milio | |
COL1A1 | P02453 | 5000 | 200 anni | più sottounità con più ID uniprot |
COL2A1-2 | P02458-2 | 1000 | 200 anni | |
COL3A1 | P02461 | 1000 | 200 anni | |
COL4A1 | P02462 | 1000 | 200 anni | più sottounità con più ID uniprot |
COL5A1 | P20908 (informazioni in stato in e | 1000 | 200 anni | |
COL23A11 | Q86Y22 | 200 anni | 80 | |
DSG2 | Q14126 | 100 del sistema | 30 milio | |
CDH1 | P12830 | 100 del sistema | 40 anni ( | |
ECM11 | Q16610 | 100 del sistema | 40 anni ( | |
Tasto FN1 | P02751 | 1000 | 200 anni | |
GAP43 | P17677 | 158 del sistema | 40 anni ( | |
HyA-500K | 1000 | 200 anni | LOR-0005 | |
HyA-50K | 1000 | 200 anni | LOR-0007 | |
ICAM1 | P05362 | 400 | 80 | |
ALCAM 1 | Q13740 | 100 del sistema | 30 milio | |
CDH20 (in questo caso) | Q9HBT6 | 300 | 80 | |
CDH8 (in questo caso) | P55286 | 100 del sistema | 20 anni | |
CD44 | P16070 | 100 del sistema | 30 milio | |
CEACAM6 | P40199 | 100 del sistema | 30 milio | |
DSG2 | Q14126 | 100 del sistema | 30 milio | |
CDH15 (in modo non instato) | P55291 | 100 del sistema | 20 anni | |
VCAM1 | P19320 | 1000 | 200 anni | |
LAMA1 | P25391 | 500 | 200 anni | più sottounità con più ID uniprot |
LAMA3-2 | Q16787 | 130 del sistema | 40 anni ( | |
Lum | P51884 | 200 anni | 80 | |
CDH15 (in modo non instato) | P55291 | 100 del sistema | 20 anni | |
NID111 | P14543 | 100 del sistema | 9,3 g/mL Nid, 130 g/mL Lam, 46,5 g/mL COL4 | COL4 e laminina |
OMD | Q99983 | 100 del sistema | 40 anni ( | |
SPP1 un | P10451 | 100 del sistema | 40 anni ( | |
CDH3 | P22223 | 100 del sistema | 40 anni ( | |
PECAM1 lungo | P16284 | 150 anni | 40 anni ( | |
TNC 1 (TNC) | P24821 | 500 | 200 anni | |
VCAM1 | P19320 | 1000 | 200 anni | |
Vtn | P04004 | 100 del sistema | 40 anni ( | |
Bgn | P21810 (in via p21810) | 100 del sistema | 40 anni ( | |
DCN un | P07585 | 300 | 80 | |
POSTN 1 | Q15063 | 100 del sistema | 40 anni ( | |
Sparc | P09486 | 100 del sistema | 40 anni ( | |
TBS11 | P07996 | 100 del sistema | 40 anni ( | |
BCAN 1 | Q96GW7 | 100 del sistema | 40 anni ( | |
ELN-3 | P15502 | 1000 | 200 anni | |
FBN1 | P35555 | 254 | 80 |
Tabella 2: L'elenco completo delle proteine ECM e delle condizioni utilizzate negli esperimenti MEMA. Vengono forniti l'ID uniprot, le concentrazioni di scorte e le concentrazioni di lavoro finali. In alcuni casi, la condizione stampata rappresenta un complesso proteico o una combinazione di più proteine, che è indicato nella colonna Note.
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Discussion
L'importanza della "dimensionalità" e del contesto è stata un fattore motivante nello sviluppo di sistemi di coltura in vitro come strumenti nella caratterizzazione delle cellule tumorali attraverso la loro interazione con il microambiente11,e la capacità di in vitro sistemi di coltura per imitare l'ambiente in vivo è una forza trainante dietro la ricerca di migliorare quei sistemi di coltura. I sistemi in vitro, tuttavia, rimangono strumenti significativi di ricerca sul cancro proprio a causa della loro capacità di distillare la complessa situazione in vivo fino a un modello semplificato12.
Anche se i sistemi 2D possono includere ECM e ligando, hanno tradizionalmente mancato le capacità di throughput per interrogare un ampio pannello di pertubageni combinatori. Estratti di membrana sotterranea commerciale popolari consentono la coltura in 3D, ma mancano la provenienza di un pannello di proteine accuratamente definito. Gli estratti commerciali in genere soffrono di composizione incompletamente definita, che può confondere l'analisi e provocare una significativa variazione batch-to-batch3,13. La piattaforma MEMA supera queste barriere, consentendo lo studio delle alterazioni dei fenotipi cellulari, dell'attività metabolica, dello stato di differenziazione e delle variazioni nella crescita e nella proliferazione delle cellule in quanto sono modulate da endogeni specifici e definiti Fattori.
La piattaforma MEMA è un approccio potente, medio-alto,velocità per valutare l'impatto del microambiente (fattori ECM e solubili) sul fenotipo delle cellule. La piattaforma mostra grande flessibilità per i tipi di saggi e celle per i quali può essere utilizzata. Possiamo osservare gli effetti sia dai ligandi solubili che dalle proteine ECM a cui sono esposte le cellule. Infatti, recentemente abbiamo scoperto che i ligandi erano un importante fattore di resistenza agli inibitori mirati HER2, ma che questi effetti potrebbero essere modulati dall'ECM5. Una varietà di cellule, tra cui cellule primarie e cellule derivate da diversi tipi di cellule, tra cui polmone, vescica, prostata, seno e pancreas, nonché cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), sono state coltivate con successo sulla piattaforma MEMA (vedi esempi nei riferimenti5,7,14). L'uso di diverse macchie consente la lettura di più endpoint cellulari, tra cui la crescita cellulare, differenziazione, e metabolismo. Altri ricercatori hanno esteso la piattaforma per interrogare l'impatto della rigidità o del modulo elastico, aggiungendo una dimensione aggiuntiva alla piattaforma MEMA15. Infine, la piattaforma è suscettibile di eseguire schermi di farmaci per l'identificazione di condizioni di microambiente che migliorano o inibiscono l'efficacia del farmaco, come abbiamo recentemente riportato5,14,15 .
Forse il passo più importante per il successo di un esperimento MEMA è ottimizzare la densità di placcatura cellulare. L'ottimizzazione della densità delle cellule garantisce la presenza di un numero sufficiente di celle per fornire dati affidabili, ma non così tante che il punto diventa eccessivamente confluente. Le macchie confluenti possono confondere significativamente i risultati, in particolare se la proliferazione viene utilizzata come endpoint, rendendo impossibile determinare se bassi tassi di proliferazione sono il risultato di interazioni con fattori microambientali o a causa di inibizioni di contatto da alta densità cellulare. Gli esperimenti di titolazione cellulare possono rivelare questi problemi, poiché il numero medio di cellule per posto dimostrerà un aumento lineare con un numero crescente di cellule placcate, ma alla fine plateau. Il numero di cella ottimale deve essere scelto nell'intervallo lineare della curva.
Come accennato in precedenza, la piattaforma MEMA è flessibile e può essere preparata su una varietà di substrati con diverse superfici. Questi includono vetrini in vetro e formati di lastra multiwall. Nella nostra esperienza, non tutte le chimiche di superficie sono suscettibili alla stampa MEMA, come abbiamo osservato il distacco spot su alcune superfici a causa di scarse proprietà di adesione e l'incapacità di bloccare l'adesione cellulare su altre superfici ad alta adesione. Inoltre, il passaggio tra i diversi substrati richiede l'ottimizzazione delle condizioni del buffer, in quanto le prestazioni della stampa con lo stesso buffer di stampa possono variare a seconda della chimica della superficie.
Il diametro degli spot ECM stampati svolge un ruolo importante nella qualità dei dati. In generale, si consiglia di utilizzare i perni di stampa di diametro maggiore disponibili per l'arrayer in uso (attualmente utilizziamo perni di 350 m di diametro). Le macchie di diametro maggiori consentono a un maggior numero di celle di occupare un punto, il che tende a dare risultati a dati più robusti rispetto a quelli generati con perni di diametro più piccolo. Poiché il legame delle celle è un processo stocastico, i dati sono correlati al numero di celle originariamente attaccate a ciascun punto. Pertanto, si consiglia di stampare un numero elevato di repliche per ogni condizione ECM. Stampiamo repliche ECM da 10 a 15 in ogni pozzo con le nostre attuali condizioni di stampa per garantire statistiche solide.
Abbiamo notato nei nostri esperimenti passati che, per la maggior parte, gli effetti del ligando tendono a dominare gli effetti ECM. Questo può essere in parte dovuto alla nostra decisione di aggiungere collagene I a tutti gli spot ECM, che garantisce una robusta legame cellulare. Tuttavia, crediamo che questo possa anche omogeneizzare gli effetti ECM, poiché la maggior parte delle macchie tende a comportarsi in modo molto simile al collagene I. Alterare la composizione spot per escludere il collagene posso provocare un comportamento differenziale delle cellule come risultato dell'interazione con il ECM, ma influisce anche in modo significativo sull'associazione cellulare, con conseguente molti più punti non occupati. Gli utenti dovrebbero personalizzare la loro composizione ECM tenendo presenti queste differenze, in particolare quelle interessate alle cellule staminali e progenitrici e alla differenziazione, dove la matrice può avere un impatto significativo16.
In genere eseguiamo i saggi MEMA per periodi di tempo relativamente brevi (ad esempio, 72 h massimo). Questo perché le celle sono vincolate alle macchie (il buffer di blocco non consente la crescita al di fuori dei punti nella nostra esperienza). Con la rapida divisione delle cellule, la crescita più lunga di 72 h porterà a una crescita eccessiva dello spot, che a sua volta complica la segmentazione dell'immagine man mano che le cellule si affollano e si accumulano l'una sull'altra, e può anche avere un impatto sui dati in quanto l'arresto della crescita può verificarsi con l'inibizione del contatto. Abbiamo eseguito trattamenti più lunghi con cellule primarie a crescita molto lenta (10-14 giorni), ma bisogna fare attenzione a questi saggi per cambiare i media e ricostituire i ligandi ogni 3/4 giorni.
Gli sforzi continui per sviluppare la piattaforma MEMA si concentrano su due aree di interesse, massimizzando la qualità ottica per l'imaging e l'ottimizzazione all'interno di vasi di coltura più piccoli. La qualità ottica diventa un fattore cruciale quando i ricercatori richiedono una microscopia ad alta risoluzione per identificare la localizzazione subcellulare dei loro marcatori di interesse. Gli schermi iniziali possono essere eseguiti a bassa risoluzione su microscopi ad alta velocità seguita dall'imaging di punti di interesse specifici su strumenti ad alta risoluzione, ma la qualità dell'immagine può essere compromessa se le proprietà ottiche del substrato sono scarse. Il miglioramento delle proprietà ottiche del substrato consentirebbe ai ricercatori di eseguire gli schermi iniziali su sistemi di imaging ad alta risoluzione senza la necessità di riacquisire le immagini selezionate a risoluzione più elevata. Infine, la capacità di eseguire MEMA in vasi a coltura più piccoli, come le lastre di 96 pozze, consentirebbe una riduzione del volume di trattamento e un'espansione dei ligandi e delle repliche interrogati. Questa transizione richiede l'ottimizzazione delle interazioni substrato-buffer-proteina e la stampa di array all'interno di nuovi vasi di coltura. Tali sforzi in corso miglioreranno la piattaforma MEMA e amplieranno le sue potenti capacità per identificare le proteine microambientali rilevanti che alterano i fenotipi cellulari per una varietà di tipi di cellule, che possono essere successivamente studiate in saggi confermativi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione HG008100 (J.W.G., L.M.H.) niH Common Fund Library of Network Cellular Signatures (LINCS).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Triton X100 | Sigma | T9284 | |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
BSA | Fisher | BP-1600 | |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
Vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
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