Summary
Nous présentons ici un protocole visant à surveiller la survie sur une base unicellulaires et identifier les variables qui permettent de prédire significativement la mort cellulaire.
Abstract
Les analyses de cytotoxicité standard, qui nécessitent la collecte de lysats ou des cellules fixées à plusieurs moments, ont limité la sensibilité et la capacité d’évaluer les facteurs qui influencent le destin neuronale. Ces tests requièrent l’observation des populations distinctes de cellules à des moments distincts. Ainsi, des cellules individuelles ne peuvent pas être suivies prospectivement au fil du temps, limitant sévèrement la capacité de distinguer que des événements subcellulaires, comme examen formation ou niveau de protéine, sont pilotes pathogènes de la maladie, les réponses homéostatiques, ou des phénomènes purement fortuits. Unicellulaire microscopie longitudinale permet de surmonter ces limitations, ce qui permet au chercheur de déterminer les différences de survie entre les populations et dessiner des relations causales avec une sensibilité accrue. Ce guide vidéo exposera un flux de travail représentatif pour expériences mesurant unicellulaires survie des neurones du cortex primaire rat exprimant un marqueur de la protéine fluorescente. Le spectateur va apprendre à atteindre la haute efficacité transfections, de collecter et de traiter des images permettant le suivi prospectif des cellules individuelles et comparer la survie relative des populations de neurones en utilisant l’analyse de risques proportionnels de Cox.
Introduction
La mort des cellules anormales est un facteur déterminant dans de nombreuses maladies, y compris le cancer, neurodégénérescence et course1. Les dosages robustes et sensibles pour la mort des cellules sont essentielles pour la caractérisation de ces troubles, ainsi que le développement de stratégies thérapeutiques pour étendre ou réduire la survie cellulaire. Il y a actuellement des dizaines de techniques pour mesurer la mort cellulaire, soit directement, soit par le biais de substitution des marqueurs2. Par exemple, la mort cellulaire peut être évaluée visuellement à l’aide de colorants vitaux qui tachent sélectivement les cellules mortes ou vivantes,3, ou en surveillant l’apparition des phospholipides spécifiques sur la membrane plasmique4,,5,6 . Mesures des composants intracellulaires ou des métabolites cellulaires rejetés dans les médias à la dissolution cellulaire peuvent également servir de proxies pour cellule mort7,8. Alternativement, la viabilité cellulaire peut être approchée en évaluant l’activité métabolique9,10. Bien que ces méthodes fournissent des moyens rapides d’évaluation de la survie cellulaire, ils ne sont pas sans réserves. Chaque technique relève de la culture comme une seule population, rendant impossible de distinguer les cellules individuelles et leurs tarifs uniques de survie. En outre, ces tests sur la population sont incapables de mesurer les facteurs qui peuvent être importants pour la mort de cellules, y compris la morphologie cellulaire, expression de la protéine ou la localisation. Dans de nombreux cas, ces tests sont limitées aux points de temps discret et ne permettent pas l’observation continue des cellules au fil du temps.
En revanche, microscopie de fluorescence longitudinale est une méthodologie très flexible qui directement et en permanence surveille le risque de décès sur une seule cellule base11. En bref, microscopie de fluorescence longitudinale permet à des milliers de cellules individuelles pour être suivis à intervalles réguliers pendant de longues périodes de temps, permettant à des déterminations précises de mort cellulaire et les facteurs qui favorisent ou suppriment la mort cellulaire. À sa base, la méthode implique la transfection transitoire ou la transduction des cellules avec des vecteurs codant des protéines fluorescentes. Un fiduciaire unique est alors établi, et la position de chaque cellules transfectées par rapport à ce point de repère permet à l’utilisateur de l’image et de suivre les cellules individuelles au cours des heures, jours ou semaines. Lorsque ces images sont affichés dans l’ordre, la mort cellulaire est marquée par des modifications caractéristiques en fluorescence, la morphologie et la fragmentation du corps cellulaire, permettant l’attribution d’un temps mort pour chaque cellule. Le taux calculé de la mort, déterminé par la fonction de risque, peut ensuite être quantitativement comparé entre les conditions, ou associé à sélectionner des caractéristiques cellulaires utilisant univariée ou multivariée Cox hasards proportionnels analyse12. Ensemble, ces approches permettent la discrimination précise et objective du taux de mort cellulaire chez les populations cellulaires et l’identification des variables qui permettent de prédire significativement la mort cellulaire et/ou de survie (Figure 1).
Bien que cette méthode peut être utilisée pour surveiller la survie dans n’importe quel type de cellules post-mitotiques dans une variété de formats de placage, ce protocole décrira les conditions pour transfectants et l’imagerie des neurones corticaux rat cultivées dans une plaque à 96 puits.
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Protocol
Tous les travaux d’animaux vertébré a été approuvé par le Comité sur l’utilisation et l’entretien des animaux à l’Université du Michigan (protocole # PRO00007096). Des expériences sont soigneusement planifiés afin de minimiser le nombre d’animaux sacrifiés. Enceinte femme sauvage (WT), rats Long Evans non transgéniques (Rattus norvegicus) sont logés séparément dans des chambres équipées avec enrichissement environnemental et pris en charge par l’unité de laboratoire Animal médecine (ULAM) à l’Université du Michigan, dans conformité avec le Guide de NIH-prise en charge pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Tous les rats ont été conservés dans la routine de logement pour moins de temps que possible avant l’euthanasie, conforme aux recommandations des lignes directrices sur l’euthanasie de l’American Veterinary Medical Association et l’Université du Michigan, méthodes d’euthanasie par Directives de l’espèce.
1. matérielle préparation
- Disséquer les neurones corticaux d’embryonnaire jour que 19 – 20 ratons et culture rat des neurones corticaux à 0,5 x 106 cellules par millilitre sur plaques revêtus de poly-D-lysine pour 4 jours in vitro, comme décrit plus haut13,14, 15,16,17,18,19.
- Préparer le plasmide d’ADN d’intérêt suivant les étapes décrites par un isolement d’ADN de plasmide exempte d’endotoxine nécessaire (voir la Table des matières). Quantifier l’ADN qui en résultent, à l’aide d’un spectrophotomètre.
- In vitro jour 4 (DIV4), filtre aliquote, stériliser et incuber les supports suivants à 37 ° c : 6 mL réduit médias de sérum (RSM ; par exemple., OptiMEM), neuronale 25 mL de milieu de base (NBM), 40 mL NBKY (NBM + acide kynurénique 1 mM + 10 mM MgCl2, ajustée à un pH de 7. (4), 10 mL NBC (NBM + 1 x neuronale de cellules supplément culture + 1 x supplément de L-glutamine + 1 x Pen Strep).
Remarque : Volumes indiqués sont suffisants pour la transfection une plaque à 96 puits. Se référer à la Table des matières des réactifs spécifiques.
2. la transfection des neurones corticaux de Rat
- Modifier la fournis feuille de transfection d’exemple (voir 1 de fichier supplémentaire) en ajustant le type de plaque, la carte de la plaque, le nombre de DNAs, concentration d’ADN et le nombre de puits (cases vertes).
Remarque : L’ADN total des sommes à 0,2 µg / puits, peu importe qu’on (par exemple,., A de l’ADN) ou multiples (par exemple, ADN B et C) constructions d’ADN sont ajoutées à chaque puits. - Travail de la feuille de calcul, combiner la quantité appropriée de RSM et ADN dans un tube. Mélanger la quantité appropriée de RSM et transfection réactif (par exemple, Lipofectamine) dans une éprouvette.
- Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 min.
- Mélanger l’ADN et transfection des préparations réactif RSM et incuber 20 min à RT.
- Au cours de cette étape d’incubation, utiliser une pipette multicanaux et stérile en plastique creux pour laver les cellules 2 x 100 µL / puits de la Banque nationale. Réserver les milieux conditionnés (CM) et stocker à 37 ° C. Pour cela et en suivant les étapes, prendre soin de réduire la quantité de temps que les neurones sont exposés à l’air.
- Retirez le support NBM et remplacer par 100 µL / puits de NBKY.
- Après 20 minutes se sont écoulées, ajouter 50 µL du mélange réactif/ADN transfection goutte à chaque puits.
- Incuber les cellules avec les complexes de réactif/ADN de transfection pendant 20 min à 37 ° C.
- Rincer 2 x avec NBKY et remplacez par 100 µL de CM et 100 µL de NBC / puits.
- Les cellules transfectées avec succès doivent être visibles en microscopie de fluorescence moins 16 – 24 h après transfection. Pour mesurer l’efficacité, utiliser un microscope à fluorescence pour vérifier la transfection après une nuit d’incubation à 37 ° C.
Remarque : Cette technique se traduit par un rendement global de transfection de 5 à 10 %.
3. imagerie
- Placer la plaque sur un microscope à fluorescence avec une platine motorisée et d’établir sa qualité de fiduciaire (par exemple, une marque sur le bas de la plaque) qui permet à l’utilisateur d’aligner la plaque chaque fois que c’est imagé. Enregistrer une image de ce fiduciaire pour référence.
- Accédez à un champ d’intérêt et notez les coordonnées XY par rapport à la qualité de fiduciaire.
- Se concentrer sur des cellules transfectées exprimant une étiquette fluorescente.
- Prendre les images fluorescentes dans le canal approprié ou canaux (protéine fluorescente protéine fluorescente rouge [DP], vert [GFP], 4′, 6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), soit manuellement, soit de façon automatisée. En prenant plusieurs images à intervalles espacés régulièrement, un montage du puits peut être assemblé au cours du traitement de l’image (voir étape 4).
Remarque : L’espacement dépend de plusieurs facteurs, y compris le grossissement, l’optique du microscope et la taille du détecteur. En général, l’espacement optique entre les images adjacentes se situera entre 90 à 95 % de la taille de chaque image, pour permettre un faible degré de chevauchement de l’image et l’alignement en vedette. - Répétez cette procédure aussi souvent que nécessaire, alignement au fiduciaire original chaque fois. Pour l’analyse de survie, d’imagerie a lieu toutes les 6 à 24 h, selon le type de cellule et le but de l’expérience.
4. traitement de l’image
Remarque : Après l’acquisition d’images, une série d’étapes de traitement sont nécessaires avant l’analyse de l’image. Ceux-ci incluent, mais ne se limitent pas aux coutures, empilage et soustraction de fond (Figure 1). L’objectif de ces mesures est de produire une pile d’images, ou des séries chronologiques, dans lequel les cellules sont clairement reconnaissables de leur fond et facile à suivre sur plusieurs points dans le temps. Une macro dédié de Fidji (Image_Processing.ijm, voir 2 fichier supplémentaire), effectue la base piquée, empiler et soustraction d’arrière-plan. Une explication de chaque étape et les paramètres à considérer lors de l’exécution de traitement d’image est fournie dans la section discussion.
- Réglez les données brutes ou le répertoire d’entrée pour correspondre à la mise en forme illustré à la Figure 2.
- Si les points dans le temps ne sont pas contiguës (T1, T2, T3), renommer ces dossiers afin qu’ils soient. Cette étape est essentielle pour assurer que la macro Image_Processing tombe pas en panne au cours de l’empilement.
- Double-cliquez sur l’icône de Fidji pour ouvrir le programme, puis cliquez sur la macro Image_Processing faites glisser la barre de Fidji. Cela va ouvrir la macro dans les Fidji.
- Ajuster les lignes 2-7 de la macro Image_Processing pour spécifier le répertoire contenant les images, le répertoire de sortie souhaitée pour des images piquées et empilés, le nombre de points d’imagerie, nombre de canaux fluorescent et format de plaque.
- Déterminer l’ordre dans lequel les images ont été acquises. Pour tester ceci, manuellement piquer un montage d’images à Fidji de manœuvres à la liste de Plugins déroulante | Coutures | Grille/Collection couture. Ajustez les paramètres dans les menus déroulants Type et l’ordre jusqu'à ce qu’une image avec précision cousue est produite.
- Ajuster les variables GRID_TYPE et STITCH_ORDER dans les lignes 8 et 9 de la macro Image_Processing pour correspondre à ces sélections.
- Spécifiez le nombre d’images par puits en ajustant la ligne 10 dans la macro Image_Processing .
Remarque : Pour un montage de 2 x 2 d’images, cette ligne se lirait DIM = 2. - Si soustraction de fond est nécessaire, ajuster la ligne 14 dans la macro Image_Processing pour BGSUB = true.
- Réglez le rayon de roulement bille en ajustant la ligne 15 dans la macro Image_Processing .
Remarque : Pour des résultats optimaux, la valeur du rayon au moins le diamètre le plus grand objet de premier plan dans l’image. - Cliquez sur exécuter pour démarrer la macro Image_Processing . Une fois démarré, Image_Processing avance automatiquement à travers les coutures, empilage et soustraction de l’arrière-plan.
5. marquant la mort cellulaire
Remarque : Voir la section « Discussion » pour plus d’informations sur marquant la mort cellulaire et données censuration.
- Localiser les empilements d’images produites par le script Image_Processing . Ouvrir ces aux Fidji.
- Utilisez l' outil de point dans la zone Fidji d’étiqueter individuellement chaque cellule avec un certain nombre. En appuyant sur t après que chaque point va ajouter l’identificateur de la cellule au gestionnaire de ROI (région d’intérêt).
Remarque : Les identificateurs peuvent être visualisées en cliquant sur les cases à cocher étiquettes et Afficher tous dans le gestionnaire de ROI. -
Progression dans les intervalles de chaque pile d’image et enregistrement le validant lors de chaque cellule meurt ou besoins d’être censuré dans le fichier Survival_spreadsheet.csv (voir fiche complémentaire 3).
- Chaque cellule occupe une seule ligne dans la feuille de calcul, où un identificateur unique (ID) de chaque cellule se compose de son correspondant bien et le nombre ROI dans ce puits. tp_death est le dernier point de temps, qu'on observe une cellule d’être en vie, tandis que time_death représente le temps réel de la mort en heures. Pour chaque cellule, intégrer ces données. Il est essentiel de maintenir cette structure pour une analyse ultérieure à l’aide de survie . R (voir 4 de fichier supplémentaire).
Remarque : Les critères pour déterminer la mort cellulaire sont cruciales et peuvent varier selon le type de cellule. Trois critères principaux sont utilisés pour l’identification des neurones morts11,20 (Figure 3) : perte de l’intensité de fluorescence (p. ex., neurone 1 à 69 h), arrondi du corps cellulaire (p. ex., neurone 2 h 188) et la perte des neurites l’intégrité ou blebbing (p. ex., neurone 2 h 188).
- Chaque cellule occupe une seule ligne dans la feuille de calcul, où un identificateur unique (ID) de chaque cellule se compose de son correspondant bien et le nombre ROI dans ce puits. tp_death est le dernier point de temps, qu'on observe une cellule d’être en vie, tandis que time_death représente le temps réel de la mort en heures. Pour chaque cellule, intégrer ces données. Il est essentiel de maintenir cette structure pour une analyse ultérieure à l’aide de survie . R (voir 4 de fichier supplémentaire).
- Enregistrer l’état de la censure de la cellule dans la dernière colonne.
Remarque : Ici, en raison de la manière particulière censurer est géré par R, censuré les cellules sont marquées par 0, tandis que les cellules non censurées sont marquées par 1. Notez que toutes les cellules qui vivent au dernier moment sont censurés et donc le symbole 0.
6. effectuer la Cox proportionnelle des dangers analyse et visualisation des résultats
- Si nécessaire, téléchargez R-studio à https://cran.r-project.org/mirrors.html.
- Ouvrez studio R et double-cliquez sur l’icône pour la survie de le . R script.
- Placez le curseur sur la ligne 2 de survie . R et cliquez sur le bouton exécuter dans la fenêtre principale du studio R afin de charger la bibliothèque de survie.
- Modifiez la ligne 5 de la survie . R script pour correspondre à l’emplacement du fichier Survival_spreadsheet.csv. Cliquez sur exécuter pour charger les données de survie comme un dataframe.
- Mettre en évidence les lignes 8 et 9, puis cliquez sur le bouton exécuter dans la fenêtre de console de studio R afin d’effectuer une analyse de risques proportionnels de Cox. Résultats et statistiques de sortie apparaissent dans la fenêtre de console de studio R.
- Mettre en évidence les lignes 12 à 16 de survie . R et appuyez sur le bouton exécuter afin de produire un risque cumulatif de l’intrigue de la mort, ce qui apparaîtra dans l’onglet emplacements dans studio R. Ce fichier peut être enregistré en cliquant sur le bouton exporter au-dessus de l’intrigue.
- Si c’est souhaitable pour tracer les données de survie comme une courbe de Kaplan-Meier, mettre les lignes 19 à 24 de survie . R et appuyez sur le bouton exécuter .
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Representative Results
Selon la méthode de transfection décrite ici, DIV4 neurones corticaux de rat ont été transfectées avec un plasmide codant la protéine fluorescente mApple. À partir de transfection après 24h, cellules ont été photographiés par microscopie de fluorescence toutes les 24 h pendant 10 jours consécutifs. Les images qui en résultent ont été organisés comme indiqué dans la Figure 2, puis cousus, empilés et a marqué pour la mort de cellules (Figure 1). La figure 3 montre une évolution temporelle pour 3 neurones représentatifs, deux de qui meurent au cours de l’expérience (les neurones 1 et 2), tandis que le troisième survit (neurone 3).
Données de survie ont été analysées en utilisant le script R fourni (survie. R) et les résultats résumés dans la Figure 4. La table générée lors de l’exécution des lignes 7 et 8 de la survie de le . R code fournit un résumé de la Cox analyse risques proportionnels. Quatre statistiques particulièrement importants dans le tableau sont mises en évidence dans la Figure 4 a. Le numéro dans la case 1 représente le taux de risque pour le groupe « Mutant » par rapport au « Poids ». Notez que le groupe « WT » n’est pas répertorié. C’est parce que le groupe « WT » sert la population de référence - le risque de décès observés chez tous les autres groupes est comparé à celle de la population de référence pour calculer le taux de risque. Par conséquent, les ratios de risque supérieurs à 1 indique un rythme plus rapide de la mort par rapport à la population de référence et valeurs inférieure à 1 représentent un taux réduit de la mort. Dans l’exemple fourni, les cellules mutantes affichent un taux de risque de 2,2, ce qui signifie qu’ils sont morts de 2,2 fois plus rapide que les cellules WT. Par défaut, R organisera les groupes dans l’ordre alphanumérique, avec le groupe du haut servant de la population de référence. Placer les nombres devant les noms de groupe est un moyen facile d’établir l’ordre dans lequel ils sont évalués. Les valeurs dans les cases 2 et 3 représentent respectivement les valeurs de p et des intervalles de confiance de 95 % pour les ratios de risque, calculées par l’analyse de risques proportionnels de Cox. Dans la case 4, on rapporte les résultats du test log-rank. Ce test évalue s’il y a une différence statistiquement significative dans la survie parmi les populations à l’essai, mais ne décrit pas quels groupes sont différents des autres et ne calcule pas la magnitude de la différence observée.
Courbes de Kaplan-Meier (Figure 4 b) sont largement utilisés dans les essais cliniques pour évaluer les effets d’une intervention sur la survie des patients. Pour cette raison, de nombreux chercheurs ne connaissent de l’interprétation des données de survie visualisées de cette manière. Dans le contexte de la survie de cellules individuelles, ces parcelles représentent la fraction des cellules vivantes au fil du temps dans chaque groupe. Plutôt que de la survie cellulaire traçage, une autre approche est de dépeindre le taux de mort cellulaire dans chaque groupe via un risque cumulatif de parcelle de mort (Figure 4). Dans la plupart des études de survie, le nombre d’événements ne suit pas une progression linéaire ; au contraire, pour un taux donné de mort un plus grand nombre d’événements est observé à autrefois. Par exemple, dans une population de 100 cellules, si 20 % des cellules meurent entre les intervalles, puis 20 cellules vont mourir dans le premier intervalle, 16 pendant l’intervalle de seconde, 13 durant la troisième période et cetera. Cette tendance logarithmique est conceptuellement plus facile à visualiser en utilisant le risque cumulatif de parcelles de la mort, puisque l’axe y représentant la transformation log négatif de la survie cellulaire. Par ailleurs, l’axe y du risque cumulé de l’intrigue de la mort peut aussi être présentée comme la mort cellulaire %, calculée comme 1-1/erisque cumulé de décès. Ces emplacements permettent également des comparaisons simples du risque de décès entre les populations. L’ampleur de l’indice de risque reflète la pente du risque cumulatif de l’intrigue de la mort pour chaque population, par rapport à celle du groupe de référence.
Figure 1 : schéma d’une expérience de survie typique. Les neurones corticaux de rat sont transfectées à DIV4 utilisant la procédure décrite dans cet article. À partir de transfection après 24 h, les cellules sont imagés à intervalles espacés régulièrement conformément aux exigences spécifiques de l’expérience. Les images sont cousus et empilés avant la mort des cellules est orchestrée, et analyse de risque proportionnel de Cox est utilisé pour comparer le risque de décès entre les populations. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : requis la structure du fichier. La macro de Fidji fournie nécessite que les données brutes sont formatées de manière spécifique. Pour utiliser Image_Processing, organiser les données brutes comme indiqué sur la gauche. Une expérience de l’exemple et structure des fichiers d’accompagnement est indiqué à droite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : marquant la mort cellulaire dans les neurones corticaux rat transfectées. En utilisant les méthodes décrites dans cet article, les neurones corticaux de rat ont été transfectées avec un plasmide codant la protéine fluorescente mApple. Les cellules ont été imagées puis environ toutes les 24 h, les images ont été cousus et empilés et mort cellulaire a marqué à l’aide des critères prévus. La mort cellulaire est indiquée pour 1 neurone à 69 h, comme en témoigne de la perte de fluorescence. Neurone 2 meurt à 188 h, comme indiqué par la fragmentation des processus et l’arrondi du corps cellulaire. Neurone 3 survit pendant la durée de l’expérience. Notez que certaines cellules deviennent visibles seulement tard dans l’expérience, comme en témoigne l’apparition d’une nouvelle cellule à 235 h. Uniquement les cellules qui sont visibles au moment initial de l’imagerie sont inclus dans les analyses subséquentes. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : interprétation d’analyse de risque proportionnel de Cox. (A) le résumé de sortie comprend quatre statistiques importantes qui sont mises en évidence dans cette figure. Encadré 1 comprend le taux de risque du groupe expérimental par rapport au groupe témoin, alors que Case 2 et case 3 affichent les valeurs p et intervalle de confiance de 95 % pour chaque rapport de risque, respectivement. Encadré 4 met en lumière les résultats du test log-rank. Ces données sont également représentés par un Kaplan-Meier courbe (B) et un risque cumulatif de parcelle (C) de la mort. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ici, la méthodologie de contrôler directement la survie neuronale sur une seule cellule de base est présentée. Par contraste avec les tests traditionnels pour la mort des cellules qui se limitent à des moments discrets et des populations entières de cellules, cette méthode permet l’évaluation continue d’une variété de facteurs tels que la morphologie cellulaire, expression de la protéine ou la localisation, et permet de déterminer comment chaque facteur influence la survie cellulaire de manière prospective.
Cette méthodologie peut être modifiée pour s’adapter à un large éventail de besoins expérimentaux. La fréquence et la durée de l’imagerie est facilement réglable, et une protéine d’intérêt peut être co transfectée avec le marqueur fluorescent modèle états pathologiques ou enquêter sur14,de13,de la fonction de protéine15, 16,17,18,19. Bien que cet article décrit la procédure optimale pour transfectants neurones corticaux de rat, le schéma expérimental peut être appliqué à n’importe quel type de cellules post-mitotiques. Toutefois, les conditions optimales de transfection devrez peut-être être optimisé sur une ligne par cellule et substrats peuvent devoir être ajustée afin d’empêcher les cellules de grumeaux ou de trop bouger suivre de manière fiable.
Exigences de traitement et d’analyse image variera selon les paramètres spécifiques de chaque expérience de microscopie longitudinale. Une brève explication de chaque étape critique est incluse ci-dessous pour aider à personnaliser le protocole à la meilleure adéquation exige de l’expérience.
Couture: si un montage d’images est pris, coutures peuvent être effectuées pour créer une image seule, plus grande pour chaque champ de vision. Pour la plupart des applications, il est préférable d’effectuer la couture avant l’empilage. Si seulement une seule image est prise par puits, il n’y a pas besoin d’effectuer cette étape.
Empilage : Plutôt que de scruter les cellules au fil du temps dans les fichiers d’image distincts, empilement peut être effectuée afin d’aligner les images consécutives en une série de temps unique, analogue à l’animation d’une image d’arrêt. Avec l’alignement de la fiduciaire réussie, les images individuelles comprenant l’image empilée seront étroitement alignés. Toutefois, s’il y a des changements notables ou des rotations entre les images, enregistrement d’images est nécessaire. La macro Image_Processing effectue automatiquement l’enregistrement en utilisant le plugin Fidji « MultiStackReg. » Ce plugin permet de réduire les petits décalages entre les exécutions d’imagerie. Toutefois, des changements importants, manuellement recadrage et réalignement des images peuvent être requis.
Soustraction de fond (optionnelle): un problème qui peut survenir au cours de l’acquisition d’images est inégal éclairage. Cela se traduira par des variations dans l’intensité du signal à travers une image qui peut confondre les estimations de l’intensité de la fluorescence. Dans ces cas, variations de l’intensité peuvent être éliminées par les techniques de soustraction de fond. Ceux-ci sont particulièrement pertinents avec faible signal aux rapports de bruit, où les changements d’intensité en raison de l’éclairage inégal peuvent être comparables en ampleur au signal du fluorophore lui-même. Il existe de nombreux algorithmes de soustraction de fond, plusieurs d'entre elles sont associées à des plugins de Fidji. Le choix de l’algorithme à utiliser dépend des propriétés de l’image elle-même et le signal à mesurer. La macro de Fidji Image_Processing, l’utilisateur dispose de la possibilité d’effectuer des « rolling ball » fond de soustraction sur un jeu empilées des images (ligne 14). Dans cette méthode, un fond local est déterminé pour chaque pixel, basée sur l’intensité moyenne d’un cercle entourant ce pixel. Cette valeur est ensuite soustraite de la valeur du pixel initial. La valeur optimale pour le rayon du cercle utilisé pour le fond local estimations différera selon le diamètre de la plus grand objet de premier plan dans l’image.
Marquant la mort cellulaire : Pour des comparaisons précises entre les populations, il est essentiel que les critères susmentionnés pour identifier les neurones morts appliquées de manière cohérente dans l’ensemble du groupe de données entier. En outre, marquant la mort cellulaire aux groupes expérimentaux sous enquête aveugler les individus élimine les sources potentielles de biais. Selon les critères spécifiques et leur généralisation, ils peuvent être incorporés dans les algorithmes automatisés pour l’évaluation impartiale de la survie cellulaire15,16,17,18, 19.
Dans le cadre de l’analyse de survie et d’autres analyses de temps-à-l’événement, il y a trois résultats possibles. Tout d’abord, l’événement (mort cellulaire) a eu lieu et l’heure à laquelle l’événement s’est produit est enregistré. Deuxièmement, l’événement s’est produite pendant la période d’observation. Ces observations sont censurées à la fin de l’expérience. En troisième lieu, l’événement pourrait être non marqué parce que la cellule a quitté le champ de vision, ou a été obscurcie par les cellules voisines. Dans ce cas, la cellule est censurée quand il n’est plus peut être correctement suivi. Pour le premier résultat, le moment exact de la mort cellulaire peut être difficile de déterminer, basé sur l’intervalle d’imagerie. Par exemple, une cellule qui est vivant au départ mais marquée aussi mort 24 heures plus tard pourrait être mort à n’importe quel point dans ce délai de 24h. Pour être conservateur, il est conseillé d’enregistrer l’heure de la mort comme la dernière fois qu’une cellule peut être identifiée avec confiance comme vivant (censure gauche).
Analyse de risques proportionnels de Cox effectuant et visualiser les résultats: le script Survival.R qui l’accompagne permet la comparaison des risques de mortalité chez les populations et leur signification statistique à l’aide de risques proportionnels de Cox analyse (Figure 4 a) et aussi intrigue résultats comme une courbe de Kaplan-Meier (Figure 4 b) ou un risque cumulatif de parcelle de mort (Figure 4). Analyse de survie, analyse de risques proportionnels de Cox et le paquet de « survie » dans R sont décrites plus en détail par Christensen12 et à https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf.
En adaptant les procédures décrites ici, une variété de fonctions neuronales peut être liée à la survie. Génération d’un retour sur investissement autour du corps cellulaire et/ou de noyau permet à l’utilisateur de surveiller longitudinalement la taille des cellules et morphologie, niveau d’expression de protéine et localisation ou la formation de structures subcellulaires telles que l’examen ou protéine regroupe13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. ce qui est important, parce que chacun de ces facteurs est observée en ce qui concerne la mort des cellules, il est possible de déterminer quantitativement la façon dont des facteurs individuels prédisent la survie cellulaire ou la mort au cours de la période de temps donnée. Voies de métabolisme et cellulaire des protéines peuvent également être dosés en exprimant les reporters fluorescents qui fournissent des mesures en temps réel de la physiologie cellulaire sous-jacente (par ex.., gCaMP6f à l’activité de dosage). En employant cette approche puissante, facteurs qui alimentent entretien cellulaire, fonction et dysfonctionnement peuvent être découvert et étudié en détail, inspirant ainsi les nouvelles pistes d’enquête.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Steve Finkbeiner et membres du laboratoire Finkbeiner pour microscopie robotique d’avant-garde. Nous remercions également Dan Peisach pour la construction du logiciel initial requis pour le traitement de l’image et automatisée d’analyse de survie. Ce travail a été financé par l’Institut National des troubles neurologiques et Stroke (NINDS) R01-NS097542, Université du Michigan Protein Folding maladie Initiative et Ann Arbor Active contre l’ALS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
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- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
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