ここでは、単一セルごとに生存率を監視し、細胞死を有意に予測変数を識別するプロトコルを提案します。
Lysates または時間の複数のポイントで固定セルのコレクションを必要とする標準的な細胞毒性の試金は、感度と神経細胞の運命に影響を与える要因を評価する能力に限られています。これらのアッセイは、離散時間で細胞の個別集団の観察を必要とします。その結果、個々 の細胞は涙点形成やタンパク質サッカード定位誤りなど、細胞内のイベントが恒常性維持反応病の病原性ドライバーかどうかを判別する能力を厳しく制限すること、時間をかけて前向き後ことはできません。または単なる偶然の一致現象。単一セルの縦の顕微鏡は、個体群間の生存率の差を判断して強化された感度との因果関係を描く研究をできるように、これらの制限を克服します。このビデオ ガイドは蛍光タンパク質マーカーを表現するラット一次皮質ニューロンの単一細胞生存率を測定する実験のための代表的なワークフローの概要を説明します。ビューアーは高効率 transfections を達成するため、収集し、個々 のセルの将来の追跡を有効にする画像を処理する方法について説明し、Cox 比例ハザード解析を用いた神経細胞群の相対生存率を比較します。
異常な細胞死は、多くの病気、がん、神経変性、ストローク1などの要因です。細胞死の堅牢かつ敏感な試金は、治療戦略の開発と同様に、これらの疾患の特性に拡張または縮小細胞の生存に不可欠です。現在、直接またはサロゲート マーカー2を介して細胞死の測定方法の数十があります。たとえば、細胞死を選択的に染色死んでいるか生きている細胞3、重要な染料または特定リン脂質膜4,報5,6 の出現を監視することによって助けを借りて、視覚的に評価できます。.細胞内コンポーネントまたは細胞内代謝細胞溶解時にメディアに放出の測定は、細胞死7,8のプロキシとして使用できます。また、細胞は代謝活性9,10を評価することにより近似できます。これらのメソッドは、細胞生存率を評価するための迅速な手段を提供する、けれども注意事項なしではないです。それぞれの手法は、単一の人口、それは個々 の細胞の生存率は、そのユニークなとを区別することは不可能レンダリングとして文化を観察します。また、そのような人口に基づく試金は細胞死、細胞形態、蛋白質の表現、ローカライズなどの重要となる要因を測定することではありません。多くの場合、これらの試金は離散時間ポイントに限定され、時間の経過とともに細胞の連続観測を可能にしません。
対照的に、縦の蛍光顕微鏡は直接かつ継続的に単一セル単位11死のリスクを監視する柔軟性の高い手法です。簡単に言えば、縦蛍光顕微鏡により細胞死とその強化したり、細胞死を抑制する要因の正確な決定を可能にする時間の長期間にわたって定期的に追跡する個々 の細胞の何千も、できます。メソッドは、そのベースで蛍光蛋白質を符号化するベクトルで、トランスフェクションした細胞の情報伝達を伴います。ユニークな受託者を設立し、このランドマークに関連して各 transfected セルの位置はイメージを作成し、時間、日数、または週のコース上の個々 のセルを追跡できます。これらの画像を順番に表示、蛍光、形態、および各セルの死の時間の割り当てを有効にする、細胞体の断片化の特性変化による細胞死がマークされます。死、ハザード関数によって決定の計算されたレート、定量的条件、比較したり関連の一変量あるいは多変量 Cox 比例ハザード解析12を使用して携帯電話の特性を選択できます。一緒に、これらのアプローチは、細胞集団の細胞死亡率と細胞死および/または生存 (図 1) を大幅予測変数の識別の正確かつ客観的差別を有効にします。
このメソッドを使用して、多彩なフォーマットをめっき後有糸分裂細胞の種類で生存を監視できますが、このプロトコルは株とイメージングの 96 ウェル プレートで培養ラット大脳皮質ニューロンのための条件を説明します。
ここでは、単一セルごとに神経細胞の生存を直接観察する方法が表示されます。離散時間とセルの全体の人口に制限されている細胞死の伝統的なアッセイと対照をなしてこの手法によりさまざまな細胞形態、蛋白質の表現、またはローカリゼーションなどの要因の継続的な評価とそれぞれの因子が将来的に細胞の生存をどのように影響するかを判断できます。
この方法?…
The authors have nothing to disclose.
スティーブ Finkbeiner とロボットの顕微鏡を先駆 Finkbeiner 研究室のメンバーに感謝します我々 はまた、初期のソフトウェア画像処理に必要なし、生存時間解析を自動化された建物のダン Peisach を感謝します。この作品は、神経疾患と脳卒中 (NINDS) R01 NS097542、ミシガン大学タンパク質フォールディング病イニシアティブ、アナーバー アクティブに対して ALS の国立研究所によって賄われていた。
Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
96 well plates | TPP | 0876 |