Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zum Überleben auf eine einzelne Zelle Basis überwachen und Variablen, die deutlich Zelltod Vorhersagen zu identifizieren.
Abstract
Standard Zytotoxizität Assays, die die Sammlung von Lysates oder festen Zellen zu mehreren Zeitpunkten erfordern, haben nur begrenzte Empfindlichkeit und Fähigkeit zur Bewertung von Faktoren, die Einfluss auf neuronale Schicksal. Diese Tests erfordern die Beobachtung der getrennten Populationen von Zellen zu diskreten Zeitpunkten. Infolgedessen darf nicht einzelne Zellen prospektiv folgen im Laufe der Zeit die Fähigkeit zur Unterscheidung, ob subzelluläre Ereignisse, z. B. Puncta Entstehung oder Protein Mislocalization, pathogenen Treiber von Krankheit, homöostatische Reaktionen stark einschränken, oder rein zufällig Phänomene. Einzellige längs Mikroskopie überwindet diese Einschränkungen, so dass des Forschers um Unterschiede im Überleben zwischen Populationen bestimmen und zeichnen Sie kausale Zusammenhänge mit verbesserte Empfindlichkeit. Dieser video-Anleitung skizziere einen repräsentativen Workflow für Experimente Messung Einzeller Überleben der Ratte primären kortikalen Neuronen einen fluoreszierendes Protein-Marker zum Ausdruck zu bringen. Der Betrachter wird lernen, wie man Hocheffizienz Transfektionen erreichen, sammeln und verarbeiten Bilder ermöglichen die zukünftige Verfolgung einzelner Zellen und das relative Überleben der neuronalen Populationen mit Cox proportional Gefahrenanalyse zu vergleichen.
Introduction
Abnorme Zellen der Tod ist ein treibender Faktor in vielen Krankheiten, einschließlich Krebs, Neurodegeneration und Takt1. Robust und sensibel Assays für Zelltod sind unerlässlich, um die Charakterisierung dieser Störungen sowie die Entwicklung von therapeutischen Strategien zur Erweiterung oder Reduzierung der zellulären überleben. Derzeit gibt es Dutzende von Techniken zur Messung der Zelltod, entweder direkt oder durch Surrogat-Marker-2. Zum Beispiel kann Zelltod visuell beurteilt werden mit Hilfe der lebenswichtige Farbstoffe, die tote oder lebende Zellen3selektiv beflecken oder durch das Auftreten von bestimmten Phospholipide auf der Plasmamembran4,5,6 Überwachung . Messungen von intrazellulären Komponenten oder zellulären Metaboliten in den Medien auf zelluläre Auflösung freigegeben dient auch als Proxys für Zelle Tod7,8. Alternativ kann zelluläre Lebensfähigkeit angenähert werden, durch die Beurteilung der Stoffwechselaktivität9,10. Obwohl diese Methoden schnelle Mittel zur Bewertung der Zelle überleben bieten, sind sie nicht ohne Vorbehalte. Jede Technik beobachtet die Kultur als eine einzelne Population, wodurch es unmöglich, zwischen den einzelnen Zellen und ihre einzigartige Preise des Überlebens zu unterscheiden. Darüber hinaus können solche bevölkerungsbezogene Assays Faktoren messen, die für Zelltod, einschließlich zellulären Morphologie, Proteinexpression oder Lokalisierung wichtig sein können. In vielen Fällen diese Tests beschränken sich auf diskreten Zeitpunkten, und erlauben nicht die kontinuierliche Beobachtung von Zellen im Laufe der Zeit.
Im Gegensatz dazu ist längs Fluoreszenzmikroskopie eine hochflexible Methodik, die direkt und kontinuierlich das Risiko des Todes auf eine einzelne Zelle Basis11 überwacht. In Kürze kann längs Fluoreszenzmikroskopie Tausende von einzelnen Zellen verfolgt werden in regelmäßigen Abständen über einen längeren Zeitraum hinweg, ermöglicht die präzise Bestimmung der Zelltod und die Faktoren, die zu verbessern oder zu unterdrücken, Zelltod. An der Basis umfasst der Methode die transiente Transfektion oder Transduktion von Zellen mit Vektoren fluoreszierende Proteine codieren. Eine einzigartige Treuhänder ist dann hergestellt, und die Position der einzelnen transfizierten Zellen in Bezug auf dieses Merkmal ermöglicht dem Benutzer, Bild und verfolgen Sie einzelne Zellen im Verlauf von Stunden, Tagen oder Wochen. Wenn diese Bilder nacheinander angezeigt werden, zeichnet sich Zelltod durch charakteristische Veränderungen in Fluoreszenz, Morphologie und Fragmentierung der Zellkörper, ermöglicht die Zuordnung von einer Zeit der Tod für jede Zelle. Die errechnete Rate des Todes, bestimmt durch die Hazard-Funktion kann dann quantitativ im Vergleich zwischen den Bedingungen oder im Zusammenhang mit zelluläre Eigenschaften mit univariaten und multivariaten Cox proportional Gefahren Analyse12auswählen. Zusammen ermöglichen diese Ansätze die genaue und objektive Diskriminierung der Preise des Zelltods bei der zellularen Bevölkerung sowie die Ermittlung der Variablen, die deutlich Zelltod und/oder überleben (Abbildung 1 Vorhersagen).
Obwohl diese Methode verwendet werden kann, zu überleben in jeder Post-mitotische Zelle Art in einer Vielzahl von Formaten Plattieren zu überwachen, wird dieses Protokoll Bedingungen für transfecting und imaging-Ratte kortikale Neuronen in einer 96-Well-Platte kultiviert beschreiben.
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Protocol
Alle Wirbeltiere tierische Arbeit wurde vom Ausschuss für die Nutzung und Pflege von Tieren an der University of Michigan (Protokoll # PRO00007096) genehmigt. Experimente sind sorgfältig geplant, um die Anzahl der Tiere geopfert zu minimieren. Schwangere Frauen-Wildtyp (WT), nicht-transgenen lange Evans Ratten (Rattus Norvegicus) sind einzeln untergebracht, in Kammern mit Umweltanreicherung ausgestattet und betreut vom Referat für Labor Tier Medizin (ULAM) an der University of Michigan, in Übereinstimmung mit dem NIH-gestützte Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Alle Ratten wurden in der Routine Gehäuse für so wenig Zeit wie möglich vor Euthanasie, Einklang mit den Empfehlungen der Leitlinien für die Euthanasie von der American Veterinary Medical Association und der University of Michigan Methoden der Euthanasie durch gehalten. Arten-Richtlinien.
1. materielle Vorbereitung
- Sezieren Sie kortikale Neuronen aus embryonalen Tag 19 – 20 Ratte Welpen und Kultur kortikale Neuronen bei 0,5 x 106 Zellen pro Milliliter auf Poly-D-Lysin beschichtete Platten für 4 Tage in Vitro, Ratte, wie zuvor beschrieben13,14, 15,16,17,18,19.
- Bereiten Sie das Plasmid DNA des Interesses das Wiederherstellungsprogramm Endotoxin-freie Plasmid DNA-Isolierung kit (siehe Tabelle der Materialien). Die daraus resultierende DNA mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren.
- Auf in-vitro-Tag 4 (DIV4), Aliquoten, Filter zu sterilisieren und inkubieren Sie folgenden Medien bei 37 ° C: 6 mL reduziert Serum Medien (RSM, z.B.., OptiMEM), 25 mL neuronalen basale Medien (NBM), 40 mL NBKY (NBM + 1 mM Kynurenic Säure + 10 mM MgCl2, einem pH-Wert von 7 eingestellt. (4), 10 mL NBC (NBM + 1 X neuronale Zelle Kultur Ergänzung + 1 x L-Glutamin ergänzen + 1 x Stift Strep).
Hinweis: Bände aufgeführt sind ausreichend für transfecting einer 96-Well-Platte. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für bestimmte Reagenzien.
2. die Transfektion von kortikalen Neuronen der Ratte
- Ändern Sie die mitgelieferten Beispiel Transfektion Blatt (siehe ergänzende Datei 1) durch die Anpassung der Platte, Platte Karte, Anzahl der DNAs, DNA-Konzentration und Anzahl der Bohrungen (grüne Felder).
Hinweis: Der gesamte-DNA fasst um 0,2 µg pro Bohrloch, unabhängig davon, ob man (z. B.., DNA-A) oder mehrere (z. B. DNA-B und C) DNA-Konstrukte hinzugefügt in jede Vertiefung. - Kombinieren Sie aus der Tabelle arbeiten, die entsprechende Menge von RSM und DNA in eine Röhre. Kombinieren Sie die entsprechende Menge an RSM und Transfection Reagens (z. B. Lipofectamine) in einem separaten Rohr.
- Bei Raumtemperatur (RT) für 5 min inkubieren.
- Kombinieren Sie die DNA und Transfection Reagens RSM Mischungen und 20 min bei RT inkubieren.
- Während dieser Inkubationsschritt verwenden, eine Mehrkanal-Pipette und sterile Kunststoff Tröge waschen Zellen 2 X mit 100 µL pro Bohrloch der NBM. Reservieren Sie die konditionierten Medien (CM) und bei 37 ° c lagern Für diese und folgende Schritte kümmern Sie sich um die Zeit zu minimieren, die Neuronen der Luft ausgesetzt sind.
- Entfernen Sie die NBM-Medien und mit 100 µL pro Bohrloch des NBKY ersetzen.
- Nach 20 min vergangen, fügen Sie 50 µL Transfection Reagens/DNA-Gemisch tropfenweise in jede Vertiefung hinzu.
- Inkubieren Sie Zellen mit Transfection Reagens/DNA-komplexe für 20 min bei 37 ° c
- Spülen Sie 2 X mit NBKY und mit 100 µL CM und 100 µL der NBC pro Bohrloch zu ersetzen.
- Erfolgreich transfected Zellen sollten durch Fluoreszenzmikroskopie innerhalb von 16 – 24 h Transfektion sichtbar. Um Effizienz zu beurteilen, verwenden Sie fluoreszierende Mikroskop, überprüfen die Transfektion nach Übernachtung Inkubation bei 37 ° C.
Hinweis: Diese Technik ergibt sich ein Gesamtwirkungsgrad der Transfektion von 5 bis 10 %.
(3) Bildgebung
- Die Platte auf einem fluoreszierenden Mikroskop mit einem motorisierten Stadium, und etablieren ein Treuhänder (z. B. eine Markierung auf der Unterseite der Platte), die es ermöglichen den Benutzer, die Platte jedes Mal ausrichten, die es abgebildet ist. Speichern Sie ein Bild von diesem Treuhand als Referenz.
- Navigieren Sie zu einem Interessengebiet und beachten Sie die X / y-Koordinaten relativ zum Treuhänder.
- Fokus auf transfizierten Zellen eine fluoreszierende Label zum Ausdruck zu bringen.
- Nehmen Sie fluoreszierende Bilder in der entsprechenden Kanal oder Kanäle (z. B. rot fluoreszierende Protein [Ausschreibung] grün fluoreszierendes Protein [GFP], 4, 6-Diamidino-2-Phenylindole ' [DAPI]), entweder manuell oder automatisiert. Nehmen Sie mehrere Bilder in Abständen regelmäßig verteilt, kann eine Montage des Brunnens während der Bildverarbeitung montiert werden (siehe Schritt 4).
Hinweis: Der Abstand hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich Vergrößerung, die Optik des Mikroskops und der Detektorgröße. Der optischen Abstand zwischen benachbarten Bildern werden in der Regel zwischen 90 – 95 % der Größe der jedes einzelne Bild, um eine kleine Portion Bildüberlappung zu ermöglichen und Ausrichtung verfügen. - Wiederholen Sie diesen Vorgang so oft wie erforderlich, Angleichung an die ursprünglichen Treuhänder jedes Mal. Für Überlebensanalyse findet bildgebenden alle 6 – 24 h, je nach Zelltyp und dem Zweck des Experiments.
(4) Bildverarbeitung
Hinweis: Nach Bildaufnahme sind eine Reihe von Verarbeitungsschritten erforderlich, vor der Bildanalyse. Diese beinhalten, aber sind nicht beschränkt auf, Nähte, stapeln und Hintergrundabzug (Abbildung 1). Diese Schritte soll ein Bildstapel oder Zeitreihen, in denen Zellen deutlich erkennbar von ihrer Herkunft und leicht zu folgen über mehrere Zeitpunkte sind zu produzieren. Ein spezielles Fidschi-Makro (Image_Processing.ijm, siehe ergänzende Datei 2), führt grundlegende Nähte, stapeln, und im Hintergrund der Subtraktion. Eine Erklärung von jedem Schritt und die Parameter, die bei der Durchführung von Bildverarbeitung wird in die Diskussion Abschnitt bereitgestellt.
- Passen Sie die raw-Daten oder Eingabeverzeichnis entsprechend der Formatierung in Abbildung 2dargestellt.
- Wenn Zeitpunkten nicht zusammenhängend sind (T1, T2, T3), benennen Sie diese Ordner, so dass sie sind. Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass das Image_Processing -Makro nicht abstürzt während stapeln.
- Doppelklicken Sie auf die Fidschi-Symbol öffnen Sie das Programm dann klicken und ziehen das Image_Processing -Makro auf die Fidschi-Bar. Es öffnet sich das Makro in Fidschi.
- Passen Sie Zeilen 2 bis 7 des Image_Processing Makros mit Bildern, das gewünschte Ausgabeverzeichnis für genäht und gestapelten Bilder, die Anzahl der bildgebenden Zeitpunkte, fluoreszierende Kanalanzahl und Plattenformat Eingabeverzeichnis angeben.
- Bestimmen Sie die Reihenfolge, in der die Bilder erworben wurden. Um dies zu testen, Nähen Sie manuell eine Montage von Bildern in Fidschi von manövrieren zu Plugins Dropdown-Menü | Nähte | Raster/Sammlung zu nähen. Passen Sie die Einstellungen in den Dropdown-Menüs, Art und Reihenfolge , bis ein akkurat genähten Bild entsteht.
- Passen Sie die Variablen GRID_TYPE und STITCH_ORDER in den Zeilen 8 und 9 des Image_Processing Makros entsprechend dieser Auswahl.
- Geben Sie die Anzahl der Bilder pro Bohrloch durch Linie 10 in das Image_Processing -Makro anpassen.
Hinweis: Für ein 2 x 2 Montage der Bilder, lautet diese Zeile DIM = 2. - Hintergrundabzug erforderlich, passen Sie Linie 14 in das Image_Processing -Makro, BGSUB = True.
- Den rollende Ball Radius durch Anpassung der Linie 15 in das Image_Processing -Makro festgelegt.
Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, legen Sie den Radius mindestens die Durchmesser der größten Vordergrundobjekt im Bild. - Klicken Sie auf Ausführen , um das Image_Processing -Makro zu starten. Einmal gestartet, wird die Image_Processing automatisch durch Nähte, stapeln und Hintergrundabzug voraus.
5. Tore schießen Zelltod
Hinweis: Sehen Sie die Diskussion Abschnitt Weitere Informationen auf scoring Zelltod und Zensur Daten.
- Suchen Sie die Bild-Stapel durch das Image_Processing -Skript erzeugt. Öffnen Sie diese in Fidschi.
- Verwenden Sie die richten Werkzeug , in Fidschi, um individuell beschriften Sie jede Zelle mit einer Zahl. Drücken t , nachdem jeder Punkt der ROI (Region of Interest) Manager die Cell-ID hinzugefügt werden.
Hinweis: Die Bezeichner können visualisiert werden, indem Sie auf den Etiketten und zeigen alle Checkboxen in der ROI-Manager. -
Fortschritt durch die Zeitpunkte in jedem Bildstapel und Datensatz Timepoint wenn jede Zelle entweder stirbt oder muss in der Datei Survival_spreadsheet.csv (siehe ergänzende Datei 3) zensiert werden.
- Jede Zelle nimmt eine einzelne Zeile in der Tabelle, wo eine eindeutige Kennung (ID) für jede Zelle der entsprechend gut und ROI-Nummer innerhalb so gut besteht. Tp_death ist der letzte Zeitpunkt, die, den eine Zelle beobachtet wird, zu leben, während Time_death der tatsächliche Zeitpunkt des Todes in Stunden darstellt. Geben Sie für jede Zelle diese Daten. Es ist wichtig, diese Struktur für die spätere Analyse mit überleben zu erhalten. R (siehe ergänzende Datei 4).
Hinweis: Die Kriterien für die Bestimmung der Zelltod sind von entscheidender Bedeutung und können je nach Zelltyp. Drei Hauptkriterien dienen zur Identifizierung der Toten Neuronen11,20 (Abbildung 3): Verlust der Fluoreszenzintensität (z. B. Neuron 1 69 h), Rundung der Zellkörper (z. B. Neuron 2 188 h) und den Verlust von Neuriten Integrität oder Blebbing (z. B. Neuron 2 188 h).
- Jede Zelle nimmt eine einzelne Zeile in der Tabelle, wo eine eindeutige Kennung (ID) für jede Zelle der entsprechend gut und ROI-Nummer innerhalb so gut besteht. Tp_death ist der letzte Zeitpunkt, die, den eine Zelle beobachtet wird, zu leben, während Time_death der tatsächliche Zeitpunkt des Todes in Stunden darstellt. Geben Sie für jede Zelle diese Daten. Es ist wichtig, diese Struktur für die spätere Analyse mit überleben zu erhalten. R (siehe ergänzende Datei 4).
- Notieren Sie den Zensor-Status der Zelle in der letzten Spalte.
Hinweis: Hier, aufgrund der besonderen Art Zensur erfolgt durch R, zensierte Zellen zeichnen sich durch 0, während unzensierte Zellen durch 1gekennzeichnet sind. Beachten Sie, dass alle Zellen, die bis zum letzten Zeitpunkt Leben zensiert, und daher 0gekennzeichnet.
6. Durchführung Cox Proportional Gefahren, Analyse und Visualisierung von Ergebnissen
- Bei Bedarf downloaden Sie R-Studio bei https://cran.r-project.org/mirrors.html.
- Öffnen Sie R-Studio, und doppelklicken Sie auf das Symbol für das Überleben der . R Skript.
- Platzieren Sie den Cursor in Zeile 2 der überleben. R und klicken Sie auf den run -Button im Hauptfenster der R-Studio um die Überlebens-Bibliothek laden.
- Ändern Sie Zeile 5 der überleben. R Skript, um den Speicherort der Datei übereinstimmen Survival_spreadsheet.csv. Klicken Sie auf die Überlebensdaten als einen Dataframe laden laufen .
- Markieren Sie Linien 8 und 9 zu und klicken Sie auf Ausführen in der R-Studio-Konsole-Fenster um Cox proportional Gefahrenanalyse durchführen. Ergebnisse und Statistiken der Ausgabe erscheint im Konsolenfenster von R-Studio.
- Markieren Sie die Zeilen 12-16 überleben. R und drücken Sie die Schaltfläche " Ausführen " um eine kumulative Risiko des Todes Plot, zu produzieren, die in der Registerkarte "Grundstücke" R-Studio angezeigt wird. Diese Datei kann gespeichert werden, indem Sie auf die Schaltfläche " exportieren " über das Grundstück.
- Wenn es wünschenswert ist, die Überlebensdaten als Kaplan-Meier-Kurve zu zeichnen, markieren Sie, Zeilen 19-24 von überleben. R und drücken Sie die Schaltfläche " Ausführen ".
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Representative Results
Mit Hilfe der Transfektion beschriebene hier waren DIV4 Ratte kortikale Neuronen mit einem Plasmid Codierung der fluoreszierenden Proteins mApple transfiziert. Ab 24 h nach Transfektion, wurden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie alle 24 h für 10 aufeinanderfolgende Tage abgebildet. Die resultierenden Bilder wurden organisiert, wie in Abbildung 2gezeigt dann genäht, gestapelt und erzielte für Zelltod (Abbildung 1). Abbildung 3 zeigt einen zeitlichen Verlauf für 3 repräsentativen Neuronen überlebt zwei die sterben im Laufe des Experiments (Neuronen 1 und 2) während der dritten (Neuron 3).
Überlebensdaten wurden analysiert mit dem R-Skript zur Verfügung gestellt (überleben. R), und die Ergebnisse in Abbildung 4zusammengefasst. Die Tabelle erzeugt bei Ausführung der Linien 7 und 8 der überleben. R Code enthält eine Zusammenfassung des Cox proportional Gefahrenanalyse. Vier besonders wichtige Statistiken in der Tabelle sind in Abbildung 4Ahervorgehoben. Die Zahl im Feld 1 steht die Hazard-Ratio für die Gruppe "Mutant" relativ "WT". Beachten Sie, dass die Gruppe "WT" nicht aufgeführt ist. Und zwar deshalb, weil die Gruppe "WT" als die Referenzpopulation dient-das Risiko des Todes in allen anderen Gruppen beobachtet im Vergleich zu derjenigen der Referenzpopulation die Hazard Ratio berechnen. Hazard ratio größer als 1 eine schnellere Rate des Todes im Vergleich zu der Referenzpopulation zeigen und kleiner als 1 Werte stellen daher einen ermäßigten Satz des Todes. In dem gegebenen Beispiel anzeigen mutierte Zellen eine Hazard-Ratio von 2,2, was bedeutet, dass sie 2,2 x schneller als WT-Zellen gestorben. Standardmäßig werden R Gruppen in alphanumerischer Reihenfolge mit der Spitzengruppe als die Referenzpopulation arrangieren. Zahlen vor Namen ist eine einfache Möglichkeit, die Reihenfolge festzulegen, in der sie ausgewertet werden. Die Werte in den Feldern 2 und 3 stellen die p-Werte und 95 %-Konfidenzintervalle für die Hazard ratio bzw. durch Cox proportional Gefahrenanalyse berechnet. In Feld 4werden die Ergebnisse der Log-Rank-Test gemeldet. Dieser Test prüft, ob gibt es ein statistisch signifikanter Unterschied in der Überlebensrate Bevölkerung getestet werden, aber wird nicht beschrieben, welche Gruppen unterscheiden sich von den anderen, und keine Größenordnung für die beobachtete Differenz berechnen.
Kaplan-Meier Kurven (Abbildung 4 b) sind verbreitet in klinischen Studien zur Beurteilung der Auswirkungen einer Intervention auf Patienten überleben. Aus diesem Grund sind viele Forscher vertraut mit Überlebensdaten visualisiert auf diese Weise zu interpretieren. Im Rahmen der einzelnen Zelle überleben zeigen diese Grundstücke der Anteil der Zellen am Leben im Laufe der Zeit in jeder Gruppe. Anstatt Plotten Zelle Überleben ist ein alternativer Ansatz, die Rate der Zelltod in jeder Gruppe über eine kumulative Risiko des Todes Plot (Abbildung 4) darzustellen. In den meisten überleben Studien folgt die Anzahl der Ereignisse keine lineare Progression; Vielmehr wird eine größere Anzahl von Veranstaltungen für einen gegebenen Satz des Todes zu früheren Zeiten beobachtet. Zum Beispiel in einer Population von 100 Zellen, werden wenn 20 % der Zellen zwischen den Intervallen, sterben dann 20 Zellen sterben innerhalb des ersten Intervalls, 16 in der zweiten Pause, 13 in der dritten Pause und so weiter. Dieser logarithmischen Trend ist konzeptionell einfacher zu visualisieren, mit kumulative Risiko des Todes Grundstücke, da die y-Achse die negative Log-Transformation der zellulären Überleben darstellt. Alternativ kann die y-Achse das kumulative Risiko des Todes Grundstück auch als % Zelltod, berechnet als 1-1/ekumulative Risiko des Todesvorgelegt werden. Diese Grundstücke können auch einfache Vergleiche der das Risiko des Todes zwischen Populationen. Das Ausmaß der die Hazard Ratio spiegelt die Steigung der das kumulative Risiko des Todes Grundstück für jede Bevölkerung im Verhältnis zu der Referenzgruppe.
Abbildung 1: Schema für eine typische überleben Experiment. Ratte kortikale Neuronen sind bei DIV4 transfiziert mit dem in diesem Artikel beschriebenen Verfahren. Ab 24 h nach Transfektion, werden Zellen in regelmäßig Abständen gemäß den besonderen Bestimmungen des Experiments abgebildet. Bilder sind genäht und gestapelt vor Zelltod erzielte, und Cox proportional Hazard Analyse verwendet wird, um das Risiko des Todes zwischen Populationen zu vergleichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: erforderliche Dateistruktur. Das mitgelieferte Fidschi Makro erfordert, dass die raw-Daten in einer bestimmten Weise formatiert sind. Nutzen organisieren Image_Processing, die raw-Daten wie auf der linken Seite dargestellt. Ein Beispiel-Experiment und begleitende Dateistruktur wird auf der rechten Seite angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Scoring Zelltod in transfizierten Ratte kortikalen Neuronen. In diesem Artikel beschriebenen Methoden verwenden, waren kortikale Neuronen der Ratte mit einem Plasmid Codierung der fluoreszierenden Proteins mApple transfiziert. Zellen wurden dann ca. alle 24 h abgebildet, die Bilder wurden genäht und gestapelt und Zelltod erzielte anhand der Kriterien zur Verfügung gestellt. Zelltod ist für Neuron 1 69 h, wie Verlust der Fluoreszenz belegt angegeben. Neuron 2 stirbt mit 188 h, wie durch Fragmentierung der Prozesse und Rundung der Zellkörper gekennzeichnet. Neuron 3 überlebt für die Dauer des Experiments. Beachten Sie, dass einige Zellen im Experiment erst spät sichtbar werden, wie das Aussehen einer neuen Zelle um 235 h belegt. Nur Zellen, die in der Anfangszeit der Bildgebung sichtbar sind werden in nachfolgenden Analysen einbezogen. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Interpretation der Cox proportional Gefahrenanalyse. (A) die Ausgabe Zusammenfassung enthält vier wichtige Statistiken, die hervorgehoben werden in dieser Abbildung. Kasten 1 enthält die Hazard-Ratio von der Experimentalgruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe, während Feld 2 und Feld 3 die p-Werte und 95 %-Konfidenzintervall für jedes Hazard-Ratio bzw. zeigen. Kasten 4 zeigt die Ergebnisse der Log-Rank-Test. Diese Daten sind auch abgebildete über eine Kaplan-Meier Kurve (B) und eine kumulative Risiko des Todes Plot (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier präsentiert Methodik neuronaler überleben auf einer Single-Cell-Basis direkt zu überwachen. Diese Methode erlaubt im Gegensatz zur traditionellen Assays für Zelltod, die zu diskreten Zeitpunkten und ganze Bevölkerungen der Zellen beschränkt sind, für die kontinuierliche Bewertung einer Vielzahl von Faktoren wie zellulären Morphologie, Proteinexpression oder Lokalisierung, und können Sie bestimmen, wie jeder Faktor zellulare überleben in einer prospektiven Weise beeinflusst.
Diese Methodik kann eine Vielzahl von experimentellen Bedürfnisse angepasst werden. Die Häufigkeit und Dauer der Bildgebung ist leicht einstellbar kann, und jedes Protein des Interesses Co transfected mit fluoreszierenden Marker Modell Krankheitszuständen oder Protein Funktion13,14,15zu untersuchen, 16,17,18,19. Obwohl dieser Artikel das optimale Verfahren beschreibt für transfecting Ratte kortikale Neuronen, kann die experimentellen Schema auf Post-mitotische Zelltypen jeglicher Art angewendet werden. Allerdings können die optimale Transfektion Bedingungen auf einer Basis pro Zelle Zeile optimiert werden müssen, und Substrate müssen möglicherweise angepasst werden, um zu verhindern, dass Zellen aus Verklumpung oder bewegte zu viel zuverlässig verfolgen.
Bild-Verarbeitung und Analyse-Anforderungen variieren je nach der spezifischen Parameter jedes längs Mikroskopie-Experiment. Eine kurze Erläuterung der einzelnen kritischen Schritte ist unten enthalten, helfen, dem Protokoll zum besseren Spiel ein Experiment Anforderungen anpassen.
Stitching: Wenn man eine Montage von Bildern nimmt, Nähte kann durchgeführt werden, um einen einzigen, größeren Bild für jedes Sichtfeld zu erstellen. Für die meisten Anwendungen ist es vorzuziehen, führen Sie vor dem Stapeln Nähte. Wenn nur ein Bild pro Bohrloch genommen wird, gibt es keine Notwendigkeit, diesen Schritt auszuführen.
Stapeln: Eher als tracking-Zellen im Laufe der Zeit über separate Bilddateien, kann Stapeln durchgeführt werden, um aufeinander folgende Bilder in einer einzigen Zeitreihe, analog zu einem Stop-Frame-Animation ausrichten. Mit erfolgreichen treuhänderische Ausrichtung werden die Einzelbilder bestehend aus gestapelten Bild eng ausgerichtet. Wenn deutliche Verschiebungen oder Rotationen zwischen Frames vorhanden sind, ist jedoch Bild-Registrierung erforderlich. Das Image_Processing -Makro führt automatisch die Registrierung mit dem Fidschi-Plugin "MultiStackReg." Dieses Plugin hilft kleinen Fehlstellungen zwischen imaging Ausführungen zu verringern. Jedoch möglicherweise mit erheblichen Verschiebungen manuell zuschneiden und Neuausrichtung Bilder erforderlich.
Hintergrundabzug (optional): ein potenzielles Problem, das während der Bildaufnahme entstehen kann ist ungleichmäßige Ausleuchtung. Variationen dadurch in Signalintensität in einem Bild, die Schätzungen der Fluoreszenzintensität durcheinander bringen können. In diesen Fällen können die Intensitätsschwankungen durch Hintergrund Subtraktion Techniken beseitigt werden. Diese sind insbesondere mit low-Signal für Rausch-Verhältnis, wo Intensität Verschiebungen durch ungleichmäßige Ausleuchtung vergleichbar in der Größe auf das Signal von der Fluorophor selbst sein können. Es gibt viele Hintergrund Subtraktion Algorithmen, von die einige Fidschi Plugins verknüpft haben. Die Wahl hängt von welcher Algorithmus verwenden auf die Eigenschaften des Bildes selbst und das Signal gemessen wird. Innerhalb der Fidschi-Makro Image_Processing, erhält der Benutzer die Möglichkeit, "rollende Kugel" durchführen Hintergrund Subtraktion auf gestapelten Bilder (Linie 14). Bei dieser Methode wird ein lokaler Hintergrund für jedes Pixel basierend auf die durchschnittliche Intensität von einem Kreis um die Pixel bestimmt. Dieser Wert wird dann vom ersten Pixelwert subtrahiert. Der optimale Wert für den Radius des Kreises zur lokalen Hintergrund Schätzungen abweichen werden basierend auf den Durchmesser des größten Vordergrundobjekts im Bild.
Zelltod scoring: Für genaue Vergleiche zwischen den Populationen ist es unerlässlich, dass die Toten Neuronen identifizieren oben genannten Kriterien konsequent über das gesamte Dataset angewendet werden. Darüber hinaus beseitigt Verblindung der Individuen scoring Zelltod zu den Versuchsgruppen untersucht mögliche Quellen der Vorspannung. Abhängig von den spezifischen Kriterien und ihre Generalizability dürfen sie in automatisierten Algorithmen für die objektive Beurteilung der zellulären überleben15,16,17,18, integriert werden 19.
Im Zusammenhang mit der Analyse und andere Zeit Ereignisanalysen gibt es drei mögliche Ergebnisse. Erstens das Ereignis (Zelltod) aufgetreten, und die Zeit, zu der das Ereignis aufgetreten ist, wird aufgezeichnet. Zweitens das Ereignis nicht innerhalb des Zeitrahmens der Beobachtung auftreten. Diese Beobachtungen werden nach Abschluss des Experiments zensiert. Drittens könnte die Veranstaltung nicht gewertet, da die Zelle aus dem Blickfeld verschoben oder von benachbarten Zellen verdeckt war. In diesem Fall wird die Zelle zensiert, wenn sie nicht mehr genau nachverfolgt werden kann. Für das erste Ergebnis der genaue Zeitpunkt des Zelltods schwierig zu bestimmen, möglicherweise anhand der Bildgebung Intervall. Zum Beispiel kann eine Zelle, die zunächst lebt aber wie tot 24 h später gekennzeichnet an jedem beliebigen Punkt innerhalb dieser 24 h Zeit gestorben. Konservativ zu sein, ist es empfehlenswert, zum Zeitpunkt des Todes als das letzte Mal aufzeichnen, die eine Zelle getrost als lebendig (linke Zensur) identifiziert werden kann.
Durchführung von Cox proportional Gefahrenanalyse und Visualisierung der Ergebnisse: die begleitende Survival.R Skript ermöglicht den Vergleich der Gefahr des Todes unter Bevölkerungen und ihre statistische Signifikanz mit Cox proportional Gefahren Analyse (Abb. 4A), sowie Plot Ergebnisse als eine Kaplan-Meier-Kurve (Abbildung 4 b) oder eine kumulative Risiko des Todes Plot (Abbildung 4). Überlebensanalyse, Cox proportional Gefahrenanalyse und das "überleben" Paket in R sind Christensen12 und am https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf etwas ausführlicher beschrieben.
Durch die Anpassung der hier beschriebenen Verfahren, kann eine Vielzahl von neuronalen Funktionen zu überleben zusammenhängen. Ein ROI um den Zellkörper und/oder Kern-Generation ermöglicht dem Benutzer die Zellengröße und Morphologie, Proteinexpressionsgrad und Lokalisierung oder die Bildung von subzellulären Strukturen wie Puncta längs zu überwachen oder Protein aggregiert13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. wichtig ist, weil jeder dieser Faktoren in Bezug auf Zelle Tod beobachtet wird, es ist möglich, quantitativ zu bestimmen, wie gut einzelne Faktoren zellulare überleben oder Tod während eines bestimmten Zeitraums Vorhersagen. Protein-Stoffwechsel und zellulären Wege können auch zum Ausdruck bringen fluoreszierende Reporter, der Echtzeit-Messwerte der zugrunde liegenden Zellphysiologie liefert geprüft werden (z.B.., gCaMP6f, Aktivität assay). Durch den Einsatz dieser mächtigen Ansatzes, können Faktoren, die zelluläre Wartung, Funktion und Dysfunktion aufgedeckt und studierte im Detail, so inspirierende neue Wege der Untersuchung sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Steve Finkbeiner und Mitglieder des Finkbeiner Lab für zukunftsweisende Robotik Mikroskopie. Wir danken auch Dan Peisach für Gebäude, die die ursprüngliche Software für Bildverarbeitung und automatisiert Überlebensanalyse. Diese Arbeit wurde durch das nationale Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall (NINDS) R01-NS097542, der University of Michigan Protein Folding Disease Initiative und Ann Arbor aktiv gegen ALS finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
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