Nous présentons ici un protocole visant à surveiller la survie sur une base unicellulaires et identifier les variables qui permettent de prédire significativement la mort cellulaire.
Les analyses de cytotoxicité standard, qui nécessitent la collecte de lysats ou des cellules fixées à plusieurs moments, ont limité la sensibilité et la capacité d’évaluer les facteurs qui influencent le destin neuronale. Ces tests requièrent l’observation des populations distinctes de cellules à des moments distincts. Ainsi, des cellules individuelles ne peuvent pas être suivies prospectivement au fil du temps, limitant sévèrement la capacité de distinguer que des événements subcellulaires, comme examen formation ou niveau de protéine, sont pilotes pathogènes de la maladie, les réponses homéostatiques, ou des phénomènes purement fortuits. Unicellulaire microscopie longitudinale permet de surmonter ces limitations, ce qui permet au chercheur de déterminer les différences de survie entre les populations et dessiner des relations causales avec une sensibilité accrue. Ce guide vidéo exposera un flux de travail représentatif pour expériences mesurant unicellulaires survie des neurones du cortex primaire rat exprimant un marqueur de la protéine fluorescente. Le spectateur va apprendre à atteindre la haute efficacité transfections, de collecter et de traiter des images permettant le suivi prospectif des cellules individuelles et comparer la survie relative des populations de neurones en utilisant l’analyse de risques proportionnels de Cox.
La mort des cellules anormales est un facteur déterminant dans de nombreuses maladies, y compris le cancer, neurodégénérescence et course1. Les dosages robustes et sensibles pour la mort des cellules sont essentielles pour la caractérisation de ces troubles, ainsi que le développement de stratégies thérapeutiques pour étendre ou réduire la survie cellulaire. Il y a actuellement des dizaines de techniques pour mesurer la mort cellulaire, soit directement, soit par le biais de substitution des marqueurs2. Par exemple, la mort cellulaire peut être évaluée visuellement à l’aide de colorants vitaux qui tachent sélectivement les cellules mortes ou vivantes,3, ou en surveillant l’apparition des phospholipides spécifiques sur la membrane plasmique4,,5,6 . Mesures des composants intracellulaires ou des métabolites cellulaires rejetés dans les médias à la dissolution cellulaire peuvent également servir de proxies pour cellule mort7,8. Alternativement, la viabilité cellulaire peut être approchée en évaluant l’activité métabolique9,10. Bien que ces méthodes fournissent des moyens rapides d’évaluation de la survie cellulaire, ils ne sont pas sans réserves. Chaque technique relève de la culture comme une seule population, rendant impossible de distinguer les cellules individuelles et leurs tarifs uniques de survie. En outre, ces tests sur la population sont incapables de mesurer les facteurs qui peuvent être importants pour la mort de cellules, y compris la morphologie cellulaire, expression de la protéine ou la localisation. Dans de nombreux cas, ces tests sont limitées aux points de temps discret et ne permettent pas l’observation continue des cellules au fil du temps.
En revanche, microscopie de fluorescence longitudinale est une méthodologie très flexible qui directement et en permanence surveille le risque de décès sur une seule cellule base11. En bref, microscopie de fluorescence longitudinale permet à des milliers de cellules individuelles pour être suivis à intervalles réguliers pendant de longues périodes de temps, permettant à des déterminations précises de mort cellulaire et les facteurs qui favorisent ou suppriment la mort cellulaire. À sa base, la méthode implique la transfection transitoire ou la transduction des cellules avec des vecteurs codant des protéines fluorescentes. Un fiduciaire unique est alors établi, et la position de chaque cellules transfectées par rapport à ce point de repère permet à l’utilisateur de l’image et de suivre les cellules individuelles au cours des heures, jours ou semaines. Lorsque ces images sont affichés dans l’ordre, la mort cellulaire est marquée par des modifications caractéristiques en fluorescence, la morphologie et la fragmentation du corps cellulaire, permettant l’attribution d’un temps mort pour chaque cellule. Le taux calculé de la mort, déterminé par la fonction de risque, peut ensuite être quantitativement comparé entre les conditions, ou associé à sélectionner des caractéristiques cellulaires utilisant univariée ou multivariée Cox hasards proportionnels analyse12. Ensemble, ces approches permettent la discrimination précise et objective du taux de mort cellulaire chez les populations cellulaires et l’identification des variables qui permettent de prédire significativement la mort cellulaire et/ou de survie (Figure 1).
Bien que cette méthode peut être utilisée pour surveiller la survie dans n’importe quel type de cellules post-mitotiques dans une variété de formats de placage, ce protocole décrira les conditions pour transfectants et l’imagerie des neurones corticaux rat cultivées dans une plaque à 96 puits.
Ici, la méthodologie de contrôler directement la survie neuronale sur une seule cellule de base est présentée. Par contraste avec les tests traditionnels pour la mort des cellules qui se limitent à des moments discrets et des populations entières de cellules, cette méthode permet l’évaluation continue d’une variété de facteurs tels que la morphologie cellulaire, expression de la protéine ou la localisation, et permet de déterminer comment chaque facteur influence la survie cellulaire de manière prospecti…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Steve Finkbeiner et membres du laboratoire Finkbeiner pour microscopie robotique d’avant-garde. Nous remercions également Dan Peisach pour la construction du logiciel initial requis pour le traitement de l’image et automatisée d’analyse de survie. Ce travail a été financé par l’Institut National des troubles neurologiques et Stroke (NINDS) R01-NS097542, Université du Michigan Protein Folding maladie Initiative et Ann Arbor Active contre l’ALS.
Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
96 well plates | TPP | 0876 |