Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zum Überleben auf eine einzelne Zelle Basis überwachen und Variablen, die deutlich Zelltod Vorhersagen zu identifizieren.
Standard Zytotoxizität Assays, die die Sammlung von Lysates oder festen Zellen zu mehreren Zeitpunkten erfordern, haben nur begrenzte Empfindlichkeit und Fähigkeit zur Bewertung von Faktoren, die Einfluss auf neuronale Schicksal. Diese Tests erfordern die Beobachtung der getrennten Populationen von Zellen zu diskreten Zeitpunkten. Infolgedessen darf nicht einzelne Zellen prospektiv folgen im Laufe der Zeit die Fähigkeit zur Unterscheidung, ob subzelluläre Ereignisse, z. B. Puncta Entstehung oder Protein Mislocalization, pathogenen Treiber von Krankheit, homöostatische Reaktionen stark einschränken, oder rein zufällig Phänomene. Einzellige längs Mikroskopie überwindet diese Einschränkungen, so dass des Forschers um Unterschiede im Überleben zwischen Populationen bestimmen und zeichnen Sie kausale Zusammenhänge mit verbesserte Empfindlichkeit. Dieser video-Anleitung skizziere einen repräsentativen Workflow für Experimente Messung Einzeller Überleben der Ratte primären kortikalen Neuronen einen fluoreszierendes Protein-Marker zum Ausdruck zu bringen. Der Betrachter wird lernen, wie man Hocheffizienz Transfektionen erreichen, sammeln und verarbeiten Bilder ermöglichen die zukünftige Verfolgung einzelner Zellen und das relative Überleben der neuronalen Populationen mit Cox proportional Gefahrenanalyse zu vergleichen.
Abnorme Zellen der Tod ist ein treibender Faktor in vielen Krankheiten, einschließlich Krebs, Neurodegeneration und Takt1. Robust und sensibel Assays für Zelltod sind unerlässlich, um die Charakterisierung dieser Störungen sowie die Entwicklung von therapeutischen Strategien zur Erweiterung oder Reduzierung der zellulären überleben. Derzeit gibt es Dutzende von Techniken zur Messung der Zelltod, entweder direkt oder durch Surrogat-Marker-2. Zum Beispiel kann Zelltod visuell beurteilt werden mit Hilfe der lebenswichtige Farbstoffe, die tote oder lebende Zellen3selektiv beflecken oder durch das Auftreten von bestimmten Phospholipide auf der Plasmamembran4,5,6 Überwachung . Messungen von intrazellulären Komponenten oder zellulären Metaboliten in den Medien auf zelluläre Auflösung freigegeben dient auch als Proxys für Zelle Tod7,8. Alternativ kann zelluläre Lebensfähigkeit angenähert werden, durch die Beurteilung der Stoffwechselaktivität9,10. Obwohl diese Methoden schnelle Mittel zur Bewertung der Zelle überleben bieten, sind sie nicht ohne Vorbehalte. Jede Technik beobachtet die Kultur als eine einzelne Population, wodurch es unmöglich, zwischen den einzelnen Zellen und ihre einzigartige Preise des Überlebens zu unterscheiden. Darüber hinaus können solche bevölkerungsbezogene Assays Faktoren messen, die für Zelltod, einschließlich zellulären Morphologie, Proteinexpression oder Lokalisierung wichtig sein können. In vielen Fällen diese Tests beschränken sich auf diskreten Zeitpunkten, und erlauben nicht die kontinuierliche Beobachtung von Zellen im Laufe der Zeit.
Im Gegensatz dazu ist längs Fluoreszenzmikroskopie eine hochflexible Methodik, die direkt und kontinuierlich das Risiko des Todes auf eine einzelne Zelle Basis11 überwacht. In Kürze kann längs Fluoreszenzmikroskopie Tausende von einzelnen Zellen verfolgt werden in regelmäßigen Abständen über einen längeren Zeitraum hinweg, ermöglicht die präzise Bestimmung der Zelltod und die Faktoren, die zu verbessern oder zu unterdrücken, Zelltod. An der Basis umfasst der Methode die transiente Transfektion oder Transduktion von Zellen mit Vektoren fluoreszierende Proteine codieren. Eine einzigartige Treuhänder ist dann hergestellt, und die Position der einzelnen transfizierten Zellen in Bezug auf dieses Merkmal ermöglicht dem Benutzer, Bild und verfolgen Sie einzelne Zellen im Verlauf von Stunden, Tagen oder Wochen. Wenn diese Bilder nacheinander angezeigt werden, zeichnet sich Zelltod durch charakteristische Veränderungen in Fluoreszenz, Morphologie und Fragmentierung der Zellkörper, ermöglicht die Zuordnung von einer Zeit der Tod für jede Zelle. Die errechnete Rate des Todes, bestimmt durch die Hazard-Funktion kann dann quantitativ im Vergleich zwischen den Bedingungen oder im Zusammenhang mit zelluläre Eigenschaften mit univariaten und multivariaten Cox proportional Gefahren Analyse12auswählen. Zusammen ermöglichen diese Ansätze die genaue und objektive Diskriminierung der Preise des Zelltods bei der zellularen Bevölkerung sowie die Ermittlung der Variablen, die deutlich Zelltod und/oder überleben (Abbildung 1 Vorhersagen).
Obwohl diese Methode verwendet werden kann, zu überleben in jeder Post-mitotische Zelle Art in einer Vielzahl von Formaten Plattieren zu überwachen, wird dieses Protokoll Bedingungen für transfecting und imaging-Ratte kortikale Neuronen in einer 96-Well-Platte kultiviert beschreiben.
Hier präsentiert Methodik neuronaler überleben auf einer Single-Cell-Basis direkt zu überwachen. Diese Methode erlaubt im Gegensatz zur traditionellen Assays für Zelltod, die zu diskreten Zeitpunkten und ganze Bevölkerungen der Zellen beschränkt sind, für die kontinuierliche Bewertung einer Vielzahl von Faktoren wie zellulären Morphologie, Proteinexpression oder Lokalisierung, und können Sie bestimmen, wie jeder Faktor zellulare überleben in einer prospektiven Weise beeinflusst.
Dies…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Steve Finkbeiner und Mitglieder des Finkbeiner Lab für zukunftsweisende Robotik Mikroskopie. Wir danken auch Dan Peisach für Gebäude, die die ursprüngliche Software für Bildverarbeitung und automatisiert Überlebensanalyse. Diese Arbeit wurde durch das nationale Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall (NINDS) R01-NS097542, der University of Michigan Protein Folding Disease Initiative und Ann Arbor aktiv gegen ALS finanziert.
Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
96 well plates | TPP | 0876 |