כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לפקח על הישרדות על בסיס תא בודד ולזהות משתנים באופן משמעותי לחזות מוות של תאים.
מבחני סטנדרט cytotoxicity, אשר דורשים את האוסף של lysates או תאים קבוע בנקודות זמן מרובים, מוגבלת הרגישות ויכולת להעריך גורמים המשפיעים על גורל עצביים. מבחני אלה דורשים התצפית של אוכלוסיות נפרדות של תאים בנקודות זמן בדידים. כתוצאה מכך, תאים בודדים לא יכול להיות במעקב פרוספקטיבי לאורך זמן, מגבילה מאוד את היכולת להבחין בין אם אירועים subcellular, כגון היווצרות puncta או חלבון mislocalization, הם פתוגניים הנהגים של המחלה, תגובות homeostatic, . או תופעות רק צירוף מקרים… מיקרוסקופ האורך תא בודד מתגבר על מגבלות אלו, ומאפשר החוקר לקבוע הבדלים הישרדות בין אוכלוסיות וצייר סיבתי קשרי גומלין עם רגישות משופרת. מדריך וידאו זה מתאר עבודה נציג לניסויים מדידה תא בודד ההישרדות של החולדה הנוירונים קורטיקלית הראשית המבטאת סמן חלבון פלואורסצנטי. הצופה למד כיצד להשיג יעילות גבוהה transfections, לאסוף, לעבד תמונות המאפשר איתור פוטנציאליים של תאים בודדים, ולהשוות את ההישרדות היחסי של אוכלוסיות עצביים באמצעות ניתוח סיכונים ביחס קוקס.
מוות של תאים חריגים מהווה גורם המניע במחלות רבות, כולל סרטן, הקשורים ניוון מוחיים של קו1. מבחני רגישות ועמיד עבור מוות תאים חיוניים האפיון של הפרעות אלה, כמו גם הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות תוך הרחבה או צמצום הישרדות הסלולר. כיום יש עשרות טכניקות למדידת מוות של תאים, באופן ישיר או באמצעות פונדקאית סמני2. לדוגמה, מוות של תאים יכולים להידרש באופן חזותי עם העזרה של המשתמשות באופן סלקטיבי כתם תאים מתים או חיים3צבעים חיוני, או על-ידי ניטור את המראה של פוספוליפידים מסוימים קרום פלזמה4,5,6 . מדידות של רכיבים תאיים או הסלולר מטבוליטים שוחרר לתוך כלי התקשורת שנפרעו הסלולר יכול גם לשמש כאל שליחים לתא המוות7,8. לחלופין, הכדאיות הסלולר ניתן לקרב את ערכיהן על-ידי הערכת פעילות חילוף החומרים9,10. למרות ששיטות אלה מספקים אמצעי מהיר הערכת את הישרדות cell, הם לא בלי אזהרות. כל טכניקה מתבונן התרבות כאוכלוסייה אחת, טיוח זה בלתי. אפשרי להבחין בין תאים בודדים שלהם המחירים ייחודי של הישרדות. יתר על כן, מבחני מבוסס-אוכלוסייה כזו אינם יכולים למדוד גורמים שעשויים להיות חשוב עבור מוות של תאים, כולל מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה. במקרים רבים, מבחני אלה הן מוגבל לנקודות זמן בדידים, אינם מאפשרים את התצפית רציף של תאים לאורך זמן.
לעומת זאת, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות האורך היא מתודולוגיה גמיש במיוחד ישירות ובאופן רצוף מפקח על הסיכון למוות תא בודד בסיס11. בקצרה, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות האורך מאפשר אלפי תאים בודדים כדי לאתר במרווחי זמן קבועים לתקופות ממושכות של זמן, ומאפשר האישושים מדויק של מוות של תאים, את הגורמים לשפר או לדכא את מות תאים. בבסיסו, השיטה כוללת של תרביות תאים ארעי או התמרה חושית של תאים עם וקטורים קידוד חלבונים פלורסנט. להחזרי ייחודי אז נוסדה, המיקום של כל תא transfected ביחס ציון זה מאפשר למשתמש תמונה ולעקוב אחר תאים בודדים במשך שעות, ימים או שבועות. כאשר תמונות אלה מוצגים ברצף, מוות של תאים מסומן על ידי שינויים אופייניים פלורסצנטיות, מורפולוגיה, פיצול בגוף התא, המאפשר את ההקצאה של שעת המוות עבור כל תא. הקצב מחושב של מוות, נקבעים על-ידי הפונקציה הזארד, שניתן לאחר מכן באופן כמותי בהשוואה בין תנאי או הקשורים בחר מאפיינים הסלולר באמצעות univariate או רב משתנית קוקס מפגעים פרופורציונלי ניתוח12. יחד, גישות אלה מאפשרים את האפליה מדויק ואובייקטיבי של שערי מוות תאי בקרב אוכלוסיות הסלולר, וזיהוי של משתנים באופן משמעותי לחזות מוות תאי ו/או הישרדות (איור 1).
אמנם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר הישרדות בכל סוג התא הפוסט-mitotic במגוון של תבניות ציפוי, פרוטוקול זה יתאר תנאים transfecting, הדמיה החולדה הנוירונים קורטיקלית תרבותי בצלחת 96-ובכן.
כאן מוצגת מתודולוגיה לעקוב ישירות אחר הישרדות העצבית על בסיס תא בודד. בניגוד מבחני מסורתי על מות תאים הנמצאים מוגבל זמן בדידים נקודות ועל אוכלוסיות שלמות של תאים, שיטה זו מאפשרת להערכה מתמשכת של מגוון גורמים כגון מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה, ו ניתן לקבוע כיצד כל גורם משפ?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים סטיב Finkbeiner וחברי המעבדה Finkbeiner על חלוצית מיקרוסקופ רובוטית. אנו מודים גם דן Peisach לבניה הראשונית התוכנה הדרושות עבור עיבוד תמונה, אוטומטית ניתוח הישרדות. עבודה זו מומן על ידי המכון הלאומי עבור הפרעות נוירולוגיות R01 שבץ (NINDS)-NS097542, אוניברסיטת מישיגן חלבון מתקפלות המחלה יוזמה לבין אן ארבור פעיל נגד ALS.
Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
96 well plates | TPP | 0876 |