Summary
Her presenterer vi en protokoll for å overvåke overlevelse på encellede basis og identifisere variabler som predikerer betydelig celledød.
Abstract
Standard cytotoksisitet analyser, som krever samlingen av lysates eller fast celler på flere tidspunkt, har begrenset følsomhet og kapasitet til å vurdere faktorene som påvirker neuronal skjebne. Disse analyser krever observasjon av egen befolkningen i celler på atskilte tidspunkt. Resultatet kan ikke enkeltceller følges prospektivt over tid, sterkt begrense muligheten til å diskriminere om subcellular hendelser, for eksempel puncta formasjon eller protein mislocalization, er patogene driverne av sykdom, homøostatisk svar, eller bare tilfeldig fenomener. Encellede langsgående mikroskopi overvinner disse begrensningene, slik at forskeren til å finne forskjellen i overlevelse mellom bestander og tegne årsaksforhold med økt følsomhet. Denne video guide vil skissere en representant arbeidsflyt for eksperimenter måle encellede overlevelse av rotte primære kortikale nevroner uttrykke merketråd fluorescerende protein. Betrakteren vil lære å oppnå høy virkningsgrad transfections, samle inn og behandle bilder slik at potensielle sporing av individuelle celler, og sammenligne relative overlevelse av neuronal bestander Cox proporsjonal farer analyse.
Introduction
Unormal celledød er en drivende faktor i mange sykdommer, inkludert kreft, neurodegeneration og strek1. Robust og sensitive analyser for celledød er avgjørende for karakterisering av disse lidelsene, samt utvikling av strategier for utvider eller reduserer mobilnettet overlevelse. Det finnes dusinvis av teknikker for måling celledød, enten direkte eller via surrogat markører2. For eksempel kan celledød vurderes visuelt ved hjelp av vitale fargestoffer som selektivt flekker død eller levende celler3, eller ved å overvåke utseendet på bestemte fosfolipider på plasma membranen4,5,6 . Målinger av intracellular komponenter eller cellular metabolitter ut i media på mobilnettet oppløsning kan også brukes som proxyer for celle død7,8. Alternativt kan mobilnettet levedyktighet tilnærmes ved å vurdere metabolsk aktivitet9,10. Selv om disse metodene gir rask måte å vurdere celle overlevelse, er de ikke uten begrensninger. Hver teknikk observerer kulturen som en enkelt befolkning, gjengivelse det umulig å skille mellom individuelle celler og deres unike priser for å overleve. Videre er slik befolkningen-baserte analyser ikke måler faktorer som kan være viktige for celledød, inkludert mobilnettet morfologi, protein uttrykk eller lokalisering. I mange tilfeller disse analyser er begrenset til diskret tidspunkt og tillater ikke kontinuerlig observasjon av celler over tid.
Langsgående fluorescens mikroskopi er derimot en svært fleksibel metode som direkte og kontinuerlig overvåker risiko for død på en enkeltcelle basis11. I korte trekk kan langsgående fluorescens mikroskopi tusen individuelle celler spores regelmessig over lengre tid, slik at presise avgjørelser av celledød og faktorene som forbedrer eller undertrykke celledød. På sin base innebærer metoden forbigående transfection eller signaltransduksjon celler med vektorer koding fluorescerende proteiner. En unik tillitsforhold opprettes deretter, og plasseringen av hver transfekterte celle i forhold til dette landemerket lar brukeren image og spore individuelle celler i løpet av timer, dager eller uker. Når disse bildene vises etter hverandre, merkes celledød av karakteristiske endringer i fluorescens morfologi og fragmentering av cellen kroppen, aktivere tilordningen av gangen død for hver celle. De beregnede satsen av død, bestemmes av funksjonen fare, kan deretter kvantitativt forhold mellom vilkår eller relatert til Velg mobilnettet egenskaper univariate eller multivariabel Cox proporsjonal farer analyse12. Sammen kan disse metodene nøyaktig og objektive diskriminering av celledød blant mobilnettet populasjoner og identifikasjon av variabler som predikerer betydelig celledød og/eller overlevelse (figur 1).
Selv om denne metoden kan brukes til å overvåke overlevelse i en post mitotisk celle type i en rekke plating formater, vil denne protokollen beskrive transfecting og imaging rotte kortikale nevroner kultivert i en 96-brønns plate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle virveldyr dyr arbeid ble godkjent av komiteen på bruk og vare på dyrene ved University of Michigan (protokollen # PRO00007096). Eksperimenter er nøye planlagt å minimere antallet av dyr ofret. Gravid kvinne vill-type (WT), ikke-transgene lang Evans rotter (Rattus norvegicus) ligger enkeltvis i rom utstyrt med miljømessig berikelse, og tatt vare på av enheten for laboratoriet dyr medisin (ULAM) ved University of Michigan, i samsvar med NIH-støttet Guide og bruk av forsøksdyr. Alle rotter ble holdt i rutine bolig for så lite tid som mulig før dødshjelp, samsvar med anbefalingene fra retningslinjene på Euthanasia amerikaneren Veterinary Legeundersøkelse Forening og University of Michigan metoder for Euthanasia av Arter retningslinjer.
1. materialet forberedelse
- Dissekere kortikale nevroner fra embryonale dag 19 – 20 rotte unger og kultur rotte kortikale nevroner på 0,5 x 106 celler per milliliter på poly-D-lysine belagt plater for 4 dager i vitro, som beskrevet tidligere13,14, 15,16,17,18,19.
- Forberede plasmider DNA rundt fremgangsmåten beskrevet av en endotoxin-fri plasmider DNA isolering kit (se Tabell for materiale). Kvantifisere resulterende DNA bruker et spektrofotometer.
- I vitro dag 4 (DIV4), aliquot, filter sterilisere og ruge følgende medier på 37 ° C: 6 mL redusert serum media (RSM, f.eks., OptiMEM), 25 mL neuronal basale media (NBM), 40 mL NBKY (NBM + 1 mM kynurenic acid + 10 mM MgCl2, justert til en pH på 7. 4), 10 mL NBC (NBM + 1 x neuronal celle kultur supplement + 1 x L-glutamin supplement + 1 x penn Strep).
Merk: Volumene som er oppført er tilstrekkelig for transfecting en 96-brønns plate. Se Tabellen for materiale for bestemte reagenser.
2. hva rotte kortikale neurons
- Endre gitt eksempel transfection ark (se ekstra fil 1) ved å justere skivetype, plate kartet, antall DNAs, DNA konsentrasjon og antall brønner (grønne bokser).
Merk: Totalt DNA summerer til 0,2 µg per brønn, uavhengig av om en (f.eks., DNA-A) eller flere (f.eks DNA B og C) DNA konstruksjoner legges i hver brønn. - Arbeider fra regnearket, kombinere riktig mengde RSM og DNA i en tube. Kombinere riktig mengde RSM og transfection reagens (f.eks Lipofectamine) i et separat rør.
- Inkuber ved romtemperatur (RT) for 5 min.
- Kombiner DNA og transfection reagens RSM blandinger og ruge på RT for 20 min.
- Under denne inkubasjon trinn, bruke en flerkanals pipette og steril plast daler å vaske cellene 2 x med 100 µL per brønn av NBM. Reservere betinget media (CM), og lagre på 37 ° C. For dette og følge trinnene, ta vare for å minimere tiden neurons er eksponert for luft.
- Fjerne NBM media og erstatte med 100 µL per brønn av NBKY.
- Etter 20 min har gått, legge 50 µL av transfection reagens/DNA blandingen dropwise i hver brønn.
- Inkuber celler med transfection reagens/DNA komplekser etter 20 min på 37 ° C.
- Skyll 2 x med NBKY og erstatte med 100 µL cm og 100 µL av NBC per brønn.
- Vellykket transfekterte celler skal vises av fluorescens mikroskopi i 16-24 h transfection. For å måle effektiviteten, bruke fluorescerende mikroskop sjekke hva etter overnatting inkubasjon på 37 ° C.
Merk: Denne teknikken gir et transfection virkningsgraden i 5 til 10%.
3. imaging
- Plasser platen på fluorescerende mikroskop med en motorisert scene, og etablere en tillitsforhold (f.eks et merke på bunnen av platen) som vil tillate brukeren å justere platen hver gang det er fotografert. Lagre et bilde av dette tillitsforhold for referanse.
- Naviger til et felt av interesse og merke x-og y-koordinater relativt på tillitsforhold.
- Fokus på transfekterte celler som uttrykker en fluorescerende etikett.
- Ta fluorescerende bildene i riktig kanal eller kanaler (f.eks rød fluorescerende protein [RFP], grønne fluorescerende protein [GFP], 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), enten manuelt eller på en automatisert måte. Ved å ta flere bilder med regelmessig plasserte mellomrom, en montasje av brønnen kan monteres under bildebehandling (se trinn 4).
Merk: Avstanden avhenger av flere faktorer, inkludert forstørrelsen, optikk mikroskopet og detektor størrelsen. Generelt, vil optisk avstanden mellom tilstøtende bilder være mellom 90-95% av størrelsen på hvert enkelt bilde, å tillate en liten grad av bildet overlapping og har justering. - Gjenta denne prosessen så ofte som nødvendig, justere til den opprinnelige tillitsforhold hver gang. For overlevelse analyse foregår tenkelig hver 6-24 h, avhengig celle og formålet med eksperimentet.
4. bildebehandling
Merk: Etter bildeopptak, en rekke behandlingstrinn er nødvendig før bildeanalyser. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, søm, stabling og bakgrunn subtraksjon (figur 1). Målet med denne fremgangsmåten er å produsere en bildestakk eller tidsserier, der cellene er klart synlige fra bakgrunnen og lett å følge over flere tidspunkt. En dedikert FIJI makro (Image_Processing.ijm, se ekstra fil 2) utfører grunnleggende stitching, stabling, og bakgrunn subtraksjon. En forklaring på hvert trinn og parameterne når du utfører bildebehandling tilbys under diskusjon.
- Justere rådata eller input directory tilsvarer formateringen vist i figur 2.
- Hvis tidspunkt ikke er sammenhengende (dvs., T1, T2, T3), gi mappene slik at de er. Dette er avgjørende for å sikre at makroen Image_Processing ikke krasj under stabling.
- Dobbeltklikk på ikonet Fiji åpner programmet, og klikk og dra Image_Processing makroen til baren Fiji. Dette åpner makroen i Fiji.
- Juster linjene 2-7 av makroen Image_Processing angi inndata katalogen som inneholder bilder, ønsket utdatamappen for sydd og stablet bilder, antall tenkelig timepoints, antall fluorescerende kanaler og plate format.
- Bestem hvor bildene ble anskaffet. Test dette ved manuelt sette en montasje av bilder i FIJI ved manøvrering til Plugins rullegardinmenyen | Søm | Rutenett/samling søm. Juster innstillingene i rullegardinmenyene Type og orden til en nøyaktig sydd bildet er produsert.
- Juster GRID_TYPE og STITCH_ORDER variablene i linje 8 og 9 av makroen Image_Processing å matche disse valgene.
- Angi antall bilder per brønn ved å justere linje 10 i makroen Image_Processing .
Merk: For en 2 x 2 montasje av bilder, denne linjen ville lese DIM = 2. - Hvis bakgrunnen subtraksjon, justere linje 14 i makroen Image_Processing til BGSUB = true.
- Angi rullende ballen radius ved å justere linje 15 i makroen Image_Processing .
Merk: For optimale resultater, sette avstanden til minst diameter største forgrunnsobjektet i bildet. - Klikk Kjør for å starte Image_Processing makroen. Når startet, vil Image_Processing automatisk gå gjennom søm, stabling og bakgrunn subtraksjon.
5. scoring celledød
Merk: Se drøftingen for mer informasjon på scoring celledød og sensur.
- Finn bildestakker produsert av skriptet Image_Processing . Åpne disse i FIJI.
- Bruk den peker verktøyet i FIJI individuelt Merk hver celle med et tall. Trykk t etter hvert punkt legges cellen identifikatoren til avkastning (regionen steder) Manager.
Merk: Identifikatorene kan visualiseres ved etiketter og Vis alle avmerkingsboksene i Avkastningen Manager. -
Fremgang gjennom timepoints i hver bildestakk og posten timepoint når hver celle dør eller trenger å bli sensurert i filen Survival_spreadsheet.csv (se ekstra filen 3).
- Hver celle har en enkelt rad i regnearket der en unik identifikator (ID) for hver celle består svarer godt og Avkastningen tall i at godt. tp_death er det siste tidspunktet en celle er observert for å være i live, mens time_death representerer den faktiske tiden døde i timer. Angi disse dataene for hver celle. Det er viktig å opprettholde denne strukturen for påfølgende analyse med overlevelse. R (se ekstra fil 4).
Merk: Som celledød er avgjørende og kan variere avhengig av celle type. Tre viktigste kriteriene brukes i identifikasjon av død neurons11,20 (Figur 3): tap av fluorescens intensitet (f.eks Neuron 1 på 69 h), avrunding av celle kroppen (f.eks Nevron 2 på 188 h) og tap av neurite integritet eller blebbing (f.eks Nevron 2 på 188 h).
- Hver celle har en enkelt rad i regnearket der en unik identifikator (ID) for hver celle består svarer godt og Avkastningen tall i at godt. tp_death er det siste tidspunktet en celle er observert for å være i live, mens time_death representerer den faktiske tiden døde i timer. Angi disse dataene for hver celle. Det er viktig å opprettholde denne strukturen for påfølgende analyse med overlevelse. R (se ekstra fil 4).
- Registrere sensurere cellen i den siste kolonnen.
Merk: Her, på grunn av den særegne måten sensurere håndteres av R, sensurert celler er merket med 0, mens usensurert celler er merket med 1. Merk at alle celler som lever til siste punkt er sensurert, og derfor merket som 0.
6. utfører Cox proporsjonal helsefare analyse og visualisere resultatene
- Eventuelt Last R studio på https://cran.r-project.org/mirrors.html.
- Åpne R studio og dobbeltklikk ikonet for overlevelse. R skript.
- Plass markøren på linje 2 overlevelse. R og klikke knappen Kjør i hovedvinduet for R studio for å laste inn biblioteket for overlevelse.
- Endre linje 5 med overlevelse. R skriptet tilsvarer plasseringen av filen Survival_spreadsheet.csv. Klikk på Kjør laste overlevelse dataene som en dataframe.
- Merk linje 8 og 9 og klikke knappen Kjør i konsollvinduet R studio for å utføre Cox proporsjonal farer analyse. Resultater og produksjon statistikk vises i konsollvinduet R Studio.
- Merk linjer 12-16 overlevelse. R og trykk på Kjør -knappen for å produsere en kumulativ risiko for død plot, som vises i kategorien tomter i R studio. Denne filen kan lagres ved å klikke på Eksporter -knappen over tomten.
- Hvis det er ønskelig å plotte overlevelse dataene som en Kaplan-Meier kurve, markere linjer 19-24 overlevelse. R og trykk på Kjør -knappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke hva fremgangsmåten som er beskrevet her, DIV4 rotten kortikale nevroner ble transfekterte med en plasmider koding fluorescerende protein mApple. Fra 24 timer etter transfection, ble celler fotografert av fluorescens mikroskopi hver 24 timer for 10 dager. Resulterende bildene ble organisert som vist i figur 2, så sydd, stablet, og scoret for celledød (figur 1). Figur 3 viser en gang kurs for 3 representant neurons, to av som dør i løpet av eksperimentet (nevroner 1 og 2) mens tredje overlever (Nevron 3).
Overlevelse data ble analysert bruker R manuset leveres (overlevelse. R), og resultatene oppsummeres i Figur 4. Tabellen generert på running linje 7 og 8 av overlevelse. R gir et sammendrag av Cox proporsjonal farer analyse. Fire spesielt viktig statistikk i tabellen utheves i figur 4A. Tallet i boks 1 representerer fare forholdet for gruppen "Mutant" i forhold til "WT". Legg merke til at "WT" gruppen ikke finnes. Dette er fordi gruppen "WT" fungerer som befolkningen referanse - risiko for død i alle andre grupper er sammenlignet med befolkningen referanse å beregne fare forholdet. Hazard prosenter større enn 1 angir raskere død i forhold til befolkningen referanse, og verdier mindre enn 1 representerer derfor redusert sats for død. I eksemplet gitt viser mutant cellene fare forholdet 2.2, betyr at de døde 2.2 x raskere enn WT celler. Standard ordner R grupper i alfabetisk rekkefølge, med toppen gruppen som befolkningen referanse. Plassere tall foran gruppenavn er det enkelt å etablere rekkefølgen som de er evaluert. Verdiene i boksene 2 og 3 representerer p-verdier og 95% konfidensintervall for fare forholdstall, henholdsvis beregnet av Cox proporsjonal farer analyse. Boks 4rapporteres resultatene av Logg-rank test. Denne testen vurderer om det er en statistisk signifikant forskjell i overlevelse blant populasjoner testet, men ikke beskriver hvilke grupper er forskjellig fra de andre, og beregner ikke en størrelsesorden observert forskjellen.
Kaplan-Meier kurver (figur 4B) er mye brukt i kliniske studier for å vurdere effekten av en intervensjon på pasienten overlevelse. Av denne grunn er mange forskere kjent med tolke overlevelse data visualisert på denne måten. I forbindelse med encellede overlevelse skildrer disse flatene brøkdel av celler i live over tid i hver gruppe. Snarere enn inntegningsrekkefølgen celle overlevelse er en alternativ tilnærming å skildre frekvensen av celledød i hver gruppe via en kumulativ risiko for død plot (figur 4C). I de fleste overlevelse studier følger antall hendelser som ikke en lineær progresjon; i stedet for en gitt hastighet på død er et større antall hendelser observert i tidligere tider. For eksempel i en befolkning på 100 celler, vil hvis 20% av cellene dør mellom intervaller, deretter 20 celler dø innen det første intervallet, 16 under andre intervall, 13 under tredje intervall, og så videre. Denne logaritmisk trenden er konseptuelt lettere å visualisere bruker kumulative risiko for død tomter, siden y-aksen representerer negative Logg transformasjonen av mobilnettet overlevelse. Y-aksen i kumulative risikoen for død tomten kan eventuelt også presenteres som % celledød, beregnes som 1-1/ekumulative risiko for død. Disse flatene kan også direkte sammenligninger av risiko for død mellom populasjoner. Omfanget av fare forholdet gjenspeiler skråningen av kumulativ risikoen av død plott for hver befolkningen, i forhold til referansegruppen.
Figur 1: skjemaet for en typisk survival eksperiment. Rotte kortikale neurons er transfekterte på DIV4 ved hjelp av fremgangsmåten i denne artikkelen. Fra 24 timer etter transfection, er celler avbildet med jevnlig spredte intervaller i henhold til bestemte eksperimentet. Bildene er sydd og stablet før celledød er scoret, og Cox proporsjonal fare analyse brukes til å sammenligne risiko for død mellom populasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: nødvendig filstrukturen. Angitte FIJI makroen krever at rådata er formatert på en bestemt måte. For å bruke organisere Image_Processing, rådataene som vises til venstre. Et eksempel eksperiment og tilhørende filstruktur vises til høyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Scoring celledød i transfekterte rotten kortikale nevroner. Bruke metodene som er beskrevet i denne artikkelen, rotte kortikale nevroner ble transfekterte med en plasmider koding fluorescerende protein mApple. Cellene ble deretter fotografert ca hver 24 h, bildene ble sydd og stablet og celledød scoret bruker kriteriene gitt. Celledød er indisert for Neuron 1 på 69 h, som dokumentert av tap av fluorescens. Nevron 2 dør på 188 h, som indikert av fragmentering av prosesser og avrunding av celle kroppen. Nevron 3 overlever for varigheten av eksperimentet. Legg merke til at enkelte celler blir synlig bare sent i forsøket, som dokumentert av utseendet på en ny celle på 235 h. Bare celler som er synlig ved første imaging er inkludert i senere analyser. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: tolkning av Cox proporsjonal fare analyse. (A) utgang sammendraget inneholder fire viktige statistikker som er uthevet i denne illustrasjonen. Boks 1 inkluderer fare forholdet mellom forsøksgruppen i forhold til kontrollgruppen, mens boks 2 og boks 3 viser p-verdier og 95% konfidensintervall for hver hazard ratio, henholdsvis. Boks 4 fremhever resultatene av Logg-rank test. Disse dataene er også avbildet via en Kaplan-Meier kurve (B) og en kumulativ risiko for død plot (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenteres metodikk direkte overvåke neuronal overlevelse på encellede basis. I motsetning til tradisjonelle analyser for celledød som er begrenset til diskret tidspunkt og hele populasjoner av celler, gir denne metoden kontinuerlig vurdering av en rekke faktorer som mobilnettet morfologi, protein uttrykk eller lokalisering, og kan bestemme hvordan hver faktor påvirker mobilnettet overlevelse i en potensiell måte.
Denne metoden kan endres for å passe en rekke eksperimentelle behov. Hyppigheten og varigheten av bildebehandling kan enkelt justeres, og noen protein av interesse kan være co transfekterte med fluorescerende markøren til modell sykdomstilstander eller undersøke protein funksjonen13,14,15, 16,17,18,19. Selv om denne artikkelen optimal prosedyren for transfecting rotten kortikale nevroner, kan eksperimentelle skjemaet brukes til hvilken som helst post mitotisk cellen. Imidlertid optimale transfection betingelsene må optimaliseres linje per celle, og underlag må justeres for å hindre celler mot klumper eller flytte for mye pålitelig spore.
Bilde behandling og analyse kravene vil variere avhengig av spesifikke parameterne for hvert langsgående mikroskopi eksperiment. En kort beskrivelse av hvert kritiske trinn er inkludert nedenfor for å tilpasse protokollen for bedre å tilpasse et eksperiment krav.
Stitching: Hvis en montasje av bilder er tatt, søm kan utføres for å opprette ett enkelt større bilde for hver synsfelt. For de fleste programmer er det best å utføre sømmene før stabling. Hvis kun ett bilde er tatt per brønn, er det ikke nødvendig å utføre dette trinnet.
Stabling: I stedet for å spore celler over tid over separate bildefiler, kan stabling utføres for å justere påfølgende bilder til en eneste gang serie, slik som en stopp delbildeanimasjon. Med vellykket tillitsforhold justering, vil de individuelle rammene bestående av stablet bildet være nært linje. Men hvis det er merkbar SKIFT eller rotasjoner mellom bilder, er bilde registrering nødvendig. Makroen Image_Processing utfører automatisk registrering ved hjelp av FIJI plugin "MultiStackReg." Denne plugin hjelper redusere små avvik mellom tenkelig kjøres. Men med betydelig SKIFT, kan manuelt beskjæring og realigning bilder være nødvendig.
Bakgrunn subtraksjon (valgfritt): et potensielt problem som kan oppstå under bildeopptak er ujevn belysning. Dette vil resultere i variasjoner i signal intensitet over et bilde som kan forvirre anslag over fluorescens intensitet. I slike tilfeller, kan intensitet variasjoner fjernes av bakgrunnen subtraksjon teknikker. Dette er spesielt relevant med lav signal til støy forhold, hvor intensiteten Skift på grunn av ujevn belysning kan sammenlignes signalet fra fluorophore selv størrelsesordener. Det er mange bakgrunn subtraksjon algoritmer, hvorav flere har knyttet FIJI plugins. Valget av hvilken algoritme som skal bruke avhenger av egenskapene til bildet selv og signalet måles. I FIJI makroen Image_Processing, brukeren får muligheten til å utføre "rullende ball" bakgrunn subtraksjon på et stablet sett av bilder (linje 14). Denne metoden bestemmes lokalt bakgrunn for hver piksel basert på gjennomsnittlig intensiteten i en sirkel rundt bildepunktet. Denne verdien er deretter trukket fra bildepunktverdien første. Den optimale verdien for radius i sirkelen brukes for lokale bakgrunn anslag vil variere basert på diameteren på største forgrunnsobjektet i bildet.
Scoret celledød: Nøyaktige sammenligninger mellom populasjoner er det viktig at kriteriene skissert ovenfor skal identifisere døde neurons brukes konsekvent over hele datasettet. Videre eliminerer blendende enkeltpersoner scoring celledød til eksperimentelle grupper under etterforskning potensielle kilder til skjevhet. Avhengig av de bestemte kriteriene og deres generalizability, kan de innlemmes i automatisert algoritmene for objektiv vurdering av mobilnettet overlevelse15,16,17,18, 19.
I sammenheng med overlevelse analyse og andre tid-å-hendelse analyser finnes det tre mulige utfall. Først hendelsen (celledød) har oppstått, og tidspunktet der det oppstod er registrert. Andre hendelsen ikke skje under tidsrammen observasjon. Disse observasjonene er sensurert forsøket er ferdig. Tredje kan hendelsen ikke scoret fordi cellen flyttet ut av synsfeltet, eller var skjult av nærliggende celler. I dette tilfellet er cellen sensurert når kan det ikke lenger nøyaktig spores. For det første resultatet, kan nøyaktige tidspunktet for celledød være vanskelig å fastslå basert på tenkelig intervallet. For eksempel kan en celle som er levende først, men merket som død 24 timer senere ha dødd på noe punkt i 24 timer perioden. For å være konservative, er det lurt å registrere tidspunktet for dødsfallet som sist gang en celle trygt kan identifiseres som levende (venstre sensur).
Utføre Cox proporsjonal farer analyse og visualisere resultatene: medfølgende Survival.R skriptet gjør sammenligning av risikoen for dødsfall blant populasjoner og deres statistiske betydning bruker Cox proporsjonal farer analyse (figur 4A), og også tomten resultater som en Kaplan-Meier kurve (figur 4B) eller en kumulativ risiko for død plot (figur 4C). Overlevelse analyse, Cox proporsjonal farer analyse og "overlevelse" pakken i R er beskrevet i detalj av Christensen12 og på https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf.
Ved å tilpasse prosedyrene som står her, kan en rekke neuronal funksjoner være relatert til overlevelse. Generering av en avkastning rundt celle kroppen og/eller kjernen lar brukeren overvåke langs Cellestørrelse og morfologi, protein uttrykk nivå og lokalisering eller dannelsen av subcellular strukturer som puncta eller protein samler13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. viktigere fordi hver av disse faktorene er observert i forhold til celledød, er det mulig å fastslå kvantitativt hvor godt individuelle faktorer forutsi mobilnettet overlevelse eller død under gitt tidsramme. Protein metabolisme og cellular veier kan også være assayed ved å uttrykke fluorescerende journalister som gir sanntids målinger av underliggende mobilnettet fysiologi (f.eks., gCaMP6f til analysen aktivitet). Ved å bruke denne kraftige, kan faktorer som påvirker mobilnettet vedlikehold, funksjon og dysfunksjon avdekket og studert i detalj, og dermed inspirerende nye muligheter for forespørsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Steve Finkbeiner og medlemmer av Finkbeiner laboratorium for banebrytende robot mikroskopi. Vi takker også Dan Peisach for den første programvaren kreves for bildebehandling og automatisert overlevelse analyse. Dette arbeidet ble finansiert av National Institute for nevrologiske lidelser og strek (NINDS) R01-NS097542, Universitetet i Michigan Protein Folding sykdom initiativ og Ann Arbor aktive mot ALS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
