Summary
Aquí, presentamos un protocolo de seguimiento de sobrevivencia de forma unicelular e identificar variables que predicen significativamente la muerte celular.
Abstract
Ensayos de citotoxicidad estándar, que requieren la colección de lisados o células fijas en varios puntos del tiempo, han limitado la sensibilidad y la capacidad para evaluar los factores que influyen en la suerte neuronal. Estos ensayos requieren la observación de diferentes poblaciones de células en los puntos de tiempo discretos. Como resultado, las células individuales no pueden seguirse prospectivamente con el tiempo, limitando seriamente la capacidad de discriminar si eventos subcelulares, tales como formación de puncta o mislocalization proteína, son patogénicos de enfermedad, respuestas homeostáticas, o fenómenos meramente coincidentes. Sola célula longitudinal microscopia supera estas limitaciones, permitiendo al investigador determinar las diferencias en la supervivencia entre las poblaciones y las relaciones causales con mayor sensibilidad. Esta video guía describirá un flujo de trabajo representativa para los experimentos de medición unicelular supervivencia de neuronas corticales primarias de rata expresan un marcador de proteína fluorescente. El visor se aprende a lograr alta eficiencia transfecciones, recoger y procesar imágenes permitiendo el seguimiento prospectivo de células individuales y comparar la supervivencia relativa de poblaciones neuronales utilizando el análisis de riesgos proporcionales de Cox.
Introduction
Muerte celular anormal es un factor de conducción en muchas enfermedades, incluyendo cáncer, neurodegeneración y tiempos1. Robustos y sensibles análisis de muerte celular son esenciales para la caracterización de estos trastornos, así como el desarrollo de estrategias terapéuticas para ampliar o reducir la supervivencia celular. Actualmente existen decenas de técnicas para la medición de muerte celular, ya sea directamente o a través de sustituto marcadores2. Por ejemplo, la muerte celular puede ser evaluada visualmente con la ayuda de colorantes vitales que tiñe selectivamente las células muertas o vivas3, o mediante el control de la aparición de fosfolípidos específicos en la membrana plasmática4,5,6 . Mediciones de componentes intracelulares o metabolitos celulares liberados en los medios de comunicación sobre disolución celular también pueden ser utilizadas como sustitutos célula muerte7,8. Por otra parte, viabilidad celular se puede aproximar mediante la evaluación de la actividad metabólica9,10. Aunque estos métodos proporcionan medios rápidos de evaluar la supervivencia de la célula, no son sin salvedades. Cada técnica observa la cultura como una sola población, haciendo imposible distinguir entre las células individuales y su ritmo único de supervivencia. Además, estos ensayos poblacionales son incapaces de medir factores que pueden ser importantes para la muerte celular, incluyendo localización, morfología celular y expresión de la proteína. En muchos casos, estos ensayos están limitados a puntos de tiempo discretos y no permiten la observación continua de las células con el tiempo.
En cambio, la microscopía de fluorescencia longitudinal es una metodología altamente flexible que directamente y continuamente monitorea el riesgo de muerte en una sola célula base11. En Resumen, microscopía de fluorescencia longitudinal permite miles de células individuales para realizar un seguimiento a intervalos regulares durante períodos prolongados de tiempo, lo que permite determinaciones precisas de la muerte de las células y los factores que mejoran o inhiben la muerte celular. En su base, el método implica la transfección transitoria o transducción de células con vectores que codifican las proteínas fluorescentes. Luego se establece un único Fiduciario, y la posición de cada célula transfected en relación con este monumento permite al usuario de la imagen y seguir las células individuales en el transcurso de horas, días o semanas. Cuando estas imágenes se ven secuencialmente, la muerte celular se caracteriza por cambios característicos en la fluorescencia, la morfología y la fragmentación del cuerpo de la célula, permitiendo la asignación de un tiempo de la muerte para cada celda. La tasa calculada de la muerte, determinada por la función de riesgo, puede entonces ser cuantitativamente en comparación entre condiciones, o relacionados con seleccionar características celulares usando univariantes o multivariantes de análisis de riesgos proporcionales Cox12. Juntos, estos métodos permiten la discriminación precisa y objetiva de las tasas de muerte celular en poblaciones celulares y la identificación de las variables que predicen significativamente la muerte celular o supervivencia (figura 1).
Aunque este método puede utilizarse para monitorear la supervivencia en cualquier tipo de poste-mitotic de la célula en una variedad de formatos de la galjanoplastia, este protocolo describe las condiciones de transferencia y proyección de imagen las neuronas corticales de rata cultivadas en una placa de 96 pocillos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal vertebrado todo el trabajo fue aprobado por el Comité sobre el uso y cuidado de animales en la Universidad de Michigan (protocolo # PRO00007096). Experimentos se planean cuidadosamente para reducir al mínimo el número de animales sacrificados. Embarazadas mujer tipo salvaje (WT), ratas de largo Evans no transgénicas (Rattus norvegicus) se encuentran solo en cámaras equipadas con enriquecimiento ambiental y atendida por la unidad de medicina Animal laboratorio (ULAM) en la Universidad de Michigan, en acuerdo con la guía de apoyo de NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todas las ratas se mantuvieron en la vivienda como poca hora como sea posible antes de la eutanasia, consistente con las recomendaciones de las directrices sobre la eutanasia de la Asociación Médica Veterinaria americana y la Universidad de Michigan métodos de eutanasia por rutina Guía de especies.
1. material preparación
- Diseccionar las neuronas corticales de embrionario día que 19 – 20 cachorros de rata y cultura rata neuronas corticales en 0.5 x 106 células por mililitro en placas cubiertas poly-D-lisina para 4 días en vitro, tal como se describe anteriormente13,14, 15,16,17,18,19.
- Preparar el plásmido de DNA de interés siguiendo los pasos descritos por un aislamiento de DNA de plásmido libre de endotoxina kit (véase Tabla de materiales). Cuantificar el ADN resultante usando un espectrofotómetro.
- In vitro día 4 (DIV4), alícuota, filtro esterilizar, incubar a 37 ° C: 6 mL los siguientes medios de reducir medios suero (RSM, por ejemplo., OptiMEM), 25 mL neuronal basal media (NBM), 40 mL NBKY (Banco Nacional de Moldova + ácido quinurénico de 1 mM + 10 mM MgCl2, ajustada a un pH de 7. 4), 10 mL NBC (NBM 1 x neuronal celular suplemento Cultura + 1 x suplemento de L-glutamina + 1 x pluma Strep).
Nota: Volúmenes mencionados son suficientes para la transferencia de una placa de 96 pocillos. Consulte la Tabla de materiales reactivos específicos.
2. transfección de las neuronas corticales de rata
- Modificar la proporcionado hoja de transfección de ejemplo (ver 1 archivo suplementario) ajustando el tipo de placa, mapa de placa, número de DNAs, concentración de ADN y el número de pozos (caja verde).
Nota: El ADN total suma 0.2 μg por pozo, independientemente de si uno (por ejemplo,., A ADN) o múltiples (e.g., DNA B y C) construcciones de ADN se añaden a cada pocillo. - Trabajo de la hoja de cálculo, combinar la cantidad adecuada de RSM y de ADN en un tubo. Combinar la cantidad adecuada de RSM y transfección reactivos (por ejemplo, Lipofectamine) en un tubo separado.
- Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos.
- Combinar el ADN y transfección reactivos RSM de mezclas e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
- Durante esta etapa de incubación, utilice una pipeta multicanal y bebederos de plástico estériles para lavar las células x 2 con 100 μl por pocillo de NBM. Reserva los medios condicionados (CM) y almacena a 37 ° C. Por esto y siguiendo los pasos, tenga cuidado para reducir al mínimo la cantidad de tiempo que las neuronas están expuestas al aire.
- Quitar los medios de comunicación NBM y reemplazar con 100 μl por pozo de NBKY.
- Después de 20 min, agregar 50 μl de la mezcla de ADN reactivo de transfección gota a gota a cada pocillo.
- Incubar las células con los complejos de ADN reactivo de transfección por 20 min a 37 ° C.
- Enjuague 2 x con NBKY y reemplace con 100 μl de CM y 100 μl de NBC por pozo.
- Con éxito transfected las células deben ser visibles por microscopía de fluorescencia dentro de 16 a 24 h de la transfección. Para medir eficiencia, usar un microscopio de fluorescencia para comprobar la transfección después de la incubación durante la noche a 37 ° C.
Nota: Esta técnica da como resultado una total eficacia de transfección del 5 al 10%.
3. la proyección de imagen
- Coloque la placa en un microscopio de fluorescencia con una etapa motorizada y establecer un Fiduciario (por ejemplo, una marca en la parte inferior de la placa) que permitirá al usuario alinear la placa cada vez que es reflejada. Guardar una imagen de este Fiduciario para referencia.
- Desplácese a un campo de interés y tenga en cuenta las coordenadas x-y en relación con el Fiduciario.
- Se centran en las células transfected con una etiqueta fluorescente.
- Tomar imágenes fluorescentes en el canal o canales (p. ej., proteína fluorescente de la proteína fluorescente roja [convocatoria], verde [GFP], 4′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), ya sea manualmente o de forma automatizada. Tomando varias imágenes a intervalos regularmente espaciados, un montaje del pozo puede ser montado durante el procesamiento de imágenes (ver paso 4).
Nota: El espacio depende de varios factores, incluyendo la ampliación, la óptica del microscopio y el tamaño del detector. En general, la distancia óptica entre imágenes adyacentes será entre 90 – 95% del tamaño de cada imagen individual, para permitir un pequeño grado de superposición de imagen y cuentan con la alineación. - Repetir este proceso tantas veces como sea necesario, alineando para el Fiduciario original cada vez. Para el análisis de supervivencia, proyección de imagen ocurre cada 6 – 24 h, dependiendo del tipo de célula y el propósito del experimento.
4. tratamiento de la imagen
Nota: Adquisición de la imagen, una serie de pasos de procesamiento se requiere antes de análisis de imagen. Éstos incluyen, pero no se limitan a, costura, apilado y sustracción de fondo (figura 1). El objetivo de estos pasos es producir una imagen pila o serie de tiempo, en el que las células son claramente discernibles desde sus antecedentes y fáciles de seguir sobre varios puntos del tiempo. Un macro dedicado de FIJI (Image_Processing.ijm, ver 2 archivos suplementarios), realiza costura básica, apilado y resta del fondo. Se presenta una explicación de cada paso y los parámetros a tener en cuenta al realizar procesamiento de imágenes en la sección de discusión.
- Ajustar los datos crudos o directorio de entrada para que coincida con el formato mostrado en la figura 2.
- Si los momentos no son contiguos (es decir, T1, T2, T3), cambiar el nombre de estas carpetas para que sean. Este paso es vital para que la macro Image_Processing chocar durante el apilado.
- Haga doble clic en el icono de Fiji para abrir el programa, a continuación, haga clic y arrastre la macro Image_Processing en la barra de Fiji. Esto abrirá la macro en Fiji.
- Ajustar líneas 2-7 de la macro Image_Processing para especificar el directorio de entrada que contiene imágenes, el directorio de salida deseado para cosido y apilados de imágenes, el número de puntos de imagen tiempo, número de canales fluorescentes y formato de placa.
- Determinar el orden en que fueron adquiridas las imágenes. Para probar esto, coser manualmente un montaje de imágenes en FIJI por maniobrar a lo Plugins desplegable menú | La costura | Rejilla/colección costura. Ajuste la configuración en el menú desplegable tipo y orden hasta que se produce una imagen exactamente cosida.
- Ajustar las variables GRID_TYPE y STITCH_ORDER en las líneas 8 y 9 de la macro Image_Processing para que coincida con estas selecciones.
- Especificar el número de imágenes por bien ajustando la línea 10 en la macro Image_Processing .
Nota: Para un montaje de 2 x 2 de imágenes, esta línea quedaría DIM = 2. - Si el fondo es necesario, ajustar la línea 14 en la macro Image_Processing a BGSUB = true.
- Establece el radio de la bola rodante ajustando la línea 15 en la macro Image_Processing .
Nota: Para obtener resultados óptimos, establezca el radio en por lo menos el diámetro del objeto más grande de primer plano en la imagen. - Haga clic en Ejecutar para iniciar la macro Image_Processing . Una vez iniciado, Image_Processing avanzará automáticamente a través de la costura, apilado y fondo.
5. anotar la muerte celular
Nota: Consulte la sección de discusión para obtener más información sobre puntuación muerte celular y datos de censura.
- Ubicar las pilas de la imagen producidas por la secuencia de comandos Image_Processing . Abrir estos en FIJI.
- Utilice la herramienta del punto dentro de FIJI para etiquetar individualmente cada célula con un número. Presionando t después de cada punto agrega el identificador de la célula a cargo ROI (región de interés).
Nota: Los identificadores se pueden visualizar haciendo clic en las casillas de las etiquetas y Mostrar todo en el ROI Manager. -
Progreso a través de los puntos de tiempo en cada pila de imagen y grabar el punto cuando cada célula muere o necesita ser censurado en el archivo Survival_spreadsheet.csv (ver archivo suplementario 3).
- Cada celda ocupa una sola fila en la hoja de cálculo, donde un identificador único (ID) para cada celda consiste en su correspondiente bien y número de retorno de la inversión dentro de ese pozo. tp_death es el último punto de tiempo que se observa una célula a estar vivos, mientras que time_death representa el tiempo real de la muerte en horas. Para cada celda, estos datos de entrada. Es fundamental para mantener esta estructura para el análisis posterior con supervivencia. R (ver 4 archivos suplementarios).
Nota: Los criterios para determinar la muerte de la célula son cruciales y pueden variar dependiendo del tipo de la célula. Tres criterios principales se utilizan en la identificación de las neuronas muertas11,20 (figura 3): pérdida de intensidad de fluorescencia (p. ej., 1 neurona en 69 h), redondeo del cuerpo de la célula (por ejemplo, la neurona 2 188 h) y la pérdida de neurita integridad o blebbing (por ejemplo, la neurona 2 188 h).
- Cada celda ocupa una sola fila en la hoja de cálculo, donde un identificador único (ID) para cada celda consiste en su correspondiente bien y número de retorno de la inversión dentro de ese pozo. tp_death es el último punto de tiempo que se observa una célula a estar vivos, mientras que time_death representa el tiempo real de la muerte en horas. Para cada celda, estos datos de entrada. Es fundamental para mantener esta estructura para el análisis posterior con supervivencia. R (ver 4 archivos suplementarios).
- Registrar el estado del censor de la célula en la última columna.
Nota: Aquí, debido a la peculiar forma de censura es manejada por R, células censuradas son marcadas por 0, mientras que las células sin censura están marcadas con 1. Tenga en cuenta que todas las células que viven hasta el último momento son censuradas y por lo tanto marcadas como 0.
6. realizar proporcional de Cox de riesgos análisis y visualización de resultados
- Si es necesario, descargar R studio en https://cran.r-project.org/mirrors.html.
- Abrir R studio y haga doble clic en el icono para la supervivencia de la . R secuencia de comandos.
- Coloque el cursor en la línea 2 de supervivencia . R y haga clic en el botón Ejecutar en la ventana principal de studio R para cargar la biblioteca de supervivencia.
- Cambiar la línea 5 de la supervivencia . R secuencia de comandos para que coincida con la ubicación del archivo Survival_spreadsheet.csv. Haga clic en Ejecutar para cargar los datos de supervivencia como una dataframe.
- Líneas 8 y 9 de resalte y haga clic en el botón Ejecutar en la ventana de la consola de R studio para realizar análisis de riesgos proporcionales de Cox. Resultados y estadísticas de salida aparecen en la ventana de la consola de R studio.
- Destacan líneas 12-16 de de supervivencia. R y presione el botón Ejecutar para producir un riesgo acumulado de trama de la muerte, que aparece en la ficha de parcelas en el estudio de R. Este archivo se puede guardar haciendo clic en el botón exportar por encima de la trama.
- Si es deseable para trazar los datos de supervivencia como una curva de Kaplan-Meier, destacan las líneas 19-24 de de supervivencia. R y presione el botón Ejecutar .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizando el procedimiento de transfección descrito aquí, DIV4 neuronas corticales de rata fueron transfectadas con un plásmido de codificación de la proteína fluorescente mApple. A partir de transfección después de 24 h, las células fueron reflejadas por microscopía de fluorescencia cada 24 h por 10 días consecutivos. Las imágenes resultantes fueron organizadas como se indica en la figura 2, luego cosidas apiladas y anotó para la muerte celular (figura 1). La figura 3 muestra un curso de tiempo de 3 neuronas representante, dos de los que mueren en el transcurso de la experiencia (las neuronas 1 y 2) mientras que la tercera sobrevive (neurona 3).
Datos de supervivencia se analizaron usando el script de R siempre (de supervivencia. R) y los resultados resumidos en la figura 4. La tabla generada en funcionando las líneas 7 y 8 de la supervivencia . R código proporciona un resumen de las Cox análisis de riesgos proporcionales. Cuatro estadísticas particularmente importantes en la tabla se resaltan en la Figura 4A. El número en el cuadro 1 representa el cociente de riesgo para el grupo "Mutante" en relación con el "Peso". Observe que el grupo "WT" no aparece. Esto es porque el grupo "WT" sirve como la población de referencia - el riesgo de muerte en todos los demás grupos se compara a la de la población de referencia para calcular el cociente de riesgo. Por lo tanto, peligro mayor que 1 indica un ritmo más rápido de la muerte en comparación con la población de referencia y valores de menos de 1 representa una tarifa reducida de la muerte. En el ejemplo, las células mutantes muestran una proporción de riesgo de 2.2, lo que significa que murieron 2.2 veces más rápido que las células de la WT. Por defecto, R encargará de los grupos en orden alfanumérico, con el grupo superior que sirve como la población de referencia. Colocando números delante de nombres de grupo es una manera fácil de establecer el orden en que se evalúan. Los valores en los cuadros 2 y 3 representan los valores de p e intervalos de confianza del 95% para los cocientes de riesgos instantáneos, respectivamente, calculado por análisis de riesgos proporcionales de Cox. En el cuadro 4, se reportan los resultados de la prueba de log-rank. Esta prueba evalúa si existe una diferencia estadísticamente significativa en la supervivencia entre las poblaciones que están probando, pero no describen qué grupos son diferentes de los demás y no calcula una magnitud de la diferencia observada.
Curvas de Kaplan-Meier (Figura 4B) son ampliamente utilizadas en los ensayos clínicos para evaluar los efectos de una intervención en la supervivencia de los pacientes. Por esta razón, muchos investigadores están familiarizados con la interpretación de datos de supervivencia visualizados de esta manera. En el contexto de la sola célula de supervivencia, estas parcelas representan la fracción de células vivas con el tiempo en cada grupo. En lugar de trazar la supervivencia celular, un enfoque alternativo es representar la tasa de muerte celular en cada grupo, a través un riesgo acumulado de trama de la muerte (figura 4). En la mayoría de los estudios de supervivencia, el número de eventos no sigue una progresión lineal; más bien, para una tasa dada de la muerte se observa un mayor número de eventos en épocas anteriores. Por ejemplo, en una población de 100 células, si el 20% de las células mueren entre intervalos, entonces 20 células que mueren dentro del primer intervalo, 16 en el segundo intervalo, 13 durante el intervalo de tercera y así sucesivamente. Esta tendencia logarítmica es conceptualmente fácil de visualizar con riesgo acumulado de parcelas de la muerte, ya que el eje y representa la transformación log negativo de la supervivencia celular. Alternativamente, también puede presentarse el eje y el riesgo acumulativo de trama de la muerte como la muerte celular %, calculada como 1-1/eriesgo acumulado de muerte. Estas parcelas permiten comparaciones directas del riesgo de muerte entre poblaciones. La magnitud de la proporción de riesgo refleja la pendiente de riesgo acumulado de trama de la muerte para cada población, en relación con el grupo de referencia.
Figura 1: esquema de un experimento típico supervivencia. Neuronas corticales de rata son transfectadas en DIV4 utilizando el procedimiento descrito en este artículo. A partir de transfección después de 24 h, las células son reflejadas a intervalos regularmente espaciados según los requisitos específicos del experimento. Las imágenes son cosidas y apiladas antes de la muerte celular se anotó, y análisis de riesgos proporcionales de Cox se utilizan para comparar el riesgo de muerte entre poblaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: necesaria estructura de archivos. La macro provista de FIJI requiere formatean de los datos en bruto en forma específica. Para utilizar Image_Processing, organizar los datos en bruto como se muestra a la izquierda. Un experimento de ejemplo y que acompaña la estructura de archivos se muestra a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: anotando la muerte de la célula en neuronas corticales de rata transfected. Mediante los métodos descritos en este artículo, las neuronas corticales de rata fueron transfectadas con un plásmido de codificación de la proteína fluorescente mApple. Las células fueron entonces reflejadas aproximadamente cada 24 h, las imágenes cosidas y apiladas, y muerte celular anotó con los criterios previstos. La muerte celular está indicada para la neurona 1 a 69 h, evidenciada por la pérdida de fluorescencia. Neurona 2 muere en 188 h, como se indica por la fragmentación de los procesos y redondeo del cuerpo celular. Neurona 3 sobrevive durante la duración del experimento. Tenga en cuenta que algunas células se hacen visibles solamente tarde en el experimento, según lo evidenciado por la aparición de una nueva célula en h 235. Solamente las células que son visibles en el momento inicial de la proyección de imagen están incluidas en los análisis posteriores. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: interpretación de análisis de riesgos proporcionales de Cox. (A) el Resumen de la salida incluye cuatro estadísticas importantes que destacan en esta figura. Cuadro 1 incluye el cociente de riesgo del grupo experimental en relación con el grupo control, mientras que el cuadro 2 y cuadro 3 muestran los valores de p y el intervalo de confianza del 95% para cada relación de riesgo, respectivamente. Cuadro 4 resumen los resultados de la prueba de log-rank. Estos datos también son representados a través de una Kaplan-Meier de la curva (B) y un riesgo acumulado de trama de la muerte (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí, se presenta la metodología para monitorear directamente la supervivencia neuronal en forma unicelular. En contraste con los ensayos tradicionales de muerte celular que se limitan a puntos de tiempo discretos y poblaciones enteras de las células, este método permite la evaluación continua de una variedad de factores como la morfología celular, expresión de la proteína o localización, y puede determinar cómo cada factor influye en la supervivencia celular en forma prospectiva.
Esta metodología puede modificarse para adaptarse a una amplia gama de necesidades experimentales. La frecuencia y duración de la proyección de imagen pueden ajustarse fácilmente, y alguna proteína de interés se puede Co transfected con el marcador fluorescente modelo Estados de enfermedad o proteína función13,14,15, 16,17,18,19. Aunque este artículo describe el procedimiento óptimo para transfectar las neuronas corticales de rata, el esquema experimental puede aplicarse a cualquier tipo de poste-mitotic de la célula. Sin embargo, las condiciones óptimas de la transfección deba ser optimizada en una base de línea por celda, y sustratos pueden necesitar ser ajustado para evitar que las células de agrupar o mover demasiado para realizar un seguimiento confiable.
Requisitos de procesamiento y análisis de la imagen variará dependiendo de los parámetros específicos de cada experimento de microscopía longitudinal. Una breve explicación de cada paso crítico se incluye a continuación para ayudar a personalizar el protocolo mejor las demandas de un experimento.
Costura: si se toma un montaje de imágenes, la costura se puede realizar para crear una imagen única y más grande para cada campo de visión. Para la mayoría de las aplicaciones es preferible realizar la costura antes de apilar. Si sólo se toma una imagen por bien, no hay que realizar este paso.
Apilado: En lugar de seguimiento de las células con el tiempo a través de archivos de imagen independientes, apilado puede realizarse para alinear imágenes consecutivas en una serie de tiempo único, análoga a una película de animación stop frame. Con la exitosa alineación fiduciaria, los marcos individuales que comprende la imagen apilada se alinean estrechamente. Sin embargo, si hay notables cambios o rotaciones entre frames, es necesario registro de la imagen. La macro de Image_Processing realiza automáticamente el registro usando el plugin de FIJI "MultiStackReg." Este plugin ayuda a reducir pequeños desalineamientos entre imágenes. Sin embargo, con cambios importantes, manual cultivo y realinear las imágenes pueden requerir.
Sustracción de fondo (opcional): un posible problema que pueda surgir durante la adquisición de la imagen es iluminación desigual. Esto resultará en variaciones en la intensidad de la señal a través de una imagen que puede confundir las estimaciones de intensidad de fluorescencia. En estos casos, las variaciones de intensidad pueden eliminarse mediante técnicas de sustracción de fondo. Éstos son particularmente relevantes con señal baja proporción de ruido, donde cambios de intensidad debido a la iluminación desigual pueden ser comparables en magnitud a la señal del fluoróforo sí mismo. Hay muchos algoritmos de resta de fondo, varios de los cuales han asociado plugins de FIJI. La elección de qué algoritmo utilizar depende de las propiedades de la imagen de sí mismo y la señal de ser medido. Dentro de la macro de FIJI Image_Processing, el usuario se da la opción de realizar "bolas rodantes" fondo resta sobre un conjunto apilado de imágenes (línea 14). En este método, se determina un fondo local para cada pixel basado en la intensidad media de un círculo alrededor de ese píxel. Entonces, este valor se resta del valor del píxel inicial. El valor óptimo para el radio del círculo usado para el fondo local estimaciones serán diferente dependiendo el diámetro del objeto más grande de primer plano en la imagen.
Puntuación muerte celular: Comparaciones precisas entre poblaciones, es esencial que los criterios mencionados anteriormente para identificar neuronas muertas aplicarse constantemente a través del conjunto de datos completo. Además, cegar a los individuos puntuación muerte celular a los grupos experimentales bajo investigación elimina posibles fuentes de sesgo. Dependiendo de los criterios específicos y su generalización, pueden ser incorporados en algoritmos automatizados para la evaluación objetiva de supervivencia celular15,16,17,18, 19.
En el contexto de análisis de supervivencia y otros análisis de tiempo para el evento, hay tres resultados posibles. En primer lugar, ha producido el evento (muerte celular), y se registra el momento en que se produjo el evento. En segundo lugar, el evento no ocurrió durante el período de tiempo de observación. Estas observaciones son censuradas en la realización del experimento. En tercer lugar, el evento no podría ser anotó porque la célula se movió fuera del campo de visión, o fue oscurecida por las células cercanas. En este caso, la célula es censurada cuando ya no puede ser exactamente seguido. Para el primer resultado, el momento exacto de la muerte celular puede ser difícil determinar basado en el intervalo de imagen. Por ejemplo, una célula que está viva al principio pero marcado como muerto 24 horas después puede haber muerto en cualquier momento dentro de ese plazo de 24 h. Para ser conservador, es buena práctica para registrar la hora de la muerte como la última vez que una célula puede identificarse con seguridad como vivo (censura izquierda).
Análisis de riesgos proporcionales de Cox realización y visualización de resultados: la secuencia de comandos Survival.R que permite la comparación del riesgo de muerte entre poblaciones y su significación estadística mediante riesgos proporcionales de Cox Análisis (Figura 4A) y también los resultados de la parcela como una curva de Kaplan-Meier (Figura 4B) o un riesgo acumulado de trama de la muerte (figura 4). Análisis de supervivencia, análisis de riesgos proporcionales de Cox y el paquete de "supervivencia" en R se describen con más detalle por Christensen12 y en https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf.
Mediante la adaptación de los procedimientos descritos aquí, una variedad de funciones neuronales puede atribuirse a la supervivencia. Generación de un retorno de la inversión en el cuerpo de la célula o núcleo permite al usuario monitorizar longitudinalmente tamaño y morfología, nivel de expresión de la proteína y localización o la formación de estructuras subcelulares como orificio o agregados de proteína13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. lo que es importante, porque cada uno de estos factores se observa en relación con la muerte de la célula, es posible determinar cuantitativamente cómo los factores individuales predicen supervivencia celular o muerte durante el período de tiempo dado. Vías de metabolismo y celular de proteínas pueden ensayarse también expresando reporteros fluorescentes que proporcionan mediciones en tiempo real de la fisiología celular subyacente (por ejemplo., gCaMP6f a la actividad del análisis). Mediante el empleo de este enfoque de gran alcance, factores que impulsan el mantenimiento celular, la función y la disfunción pueden ser descubierto y estudiado en detalle, inspirando así a nuevas vías de investigación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Steve Finkbeiner y miembros del laboratorio de Finkbeiner pionera en microscopía robotizada. También agradecemos a Dan Peisach edificio el software inicial había requerida para el procesamiento de imágenes y había automatizado de análisis de supervivencia. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y Stroke (NINDS) R01-NS097542, la Universidad de Michigan proteína plegable enfermedad la iniciativa y activa contra ALS de Ann Arbor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
