Summary
Burada, hayatta kalma tek hücre olarak izlemek ve önemli ölçüde hücre ölümünü tahmin değişkenleri tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Lysates veya birden fazla zaman noktalarda sabit hücreler topluluğu gerektiren standart sitotoksisite deneyleri, duyarlılık ve nöronal kaderini etkileyen faktörleri değerlendirmek için kapasitesi sınırlıdır. Bu deneyleri hücre ayrık zaman noktalarda ayrı nüfus gözlenmesi gerekir. Sonuç olarak, tek tek hücreleri prospektif ciddi puncta oluşumu veya protein mislocalization, gibi hücre altı olaylar hastalığın patojenik sürücüleri homeostatik yanıt olup ayrımcılık yeteneği sınırlı zaman içinde izlenemiyor, ya da sadece tesadüfi olaylar. Tek hücreli boyuna mikroskobu araştırmacı hayatta kalma nüfus arasındaki farklılıkları belirlemek ve nedensel ilişkileri gelişmiş hassasiyeti ile çizmek izin bu sınırlamalar üstesinden gelir. Bu video rehber tek hücreli hayatta kalma bir floresan protein marker ifade sıçan birincil kortikal nöronların ölçme deneyleri için temsil edici bir iş akışı açıklayacağım. Görüntüleyiciyi yüksek verimli transfections elde etmek, toplamak ve tek tek hücreler potansiyel izlemeyi etkinleştirme görüntüleri işlemek nasıl öğrenin ve nöron popülasyonları Cox orantılı tehlikeler analizi kullanarak göreli yaşama karşılaştırın.
Introduction
Anormal hücre ölümü kanser, ateş ve kontur1de dahil olmak üzere birçok hastalığın sürüş bir faktördür. Hücre ölümü için güçlü ve hassas deneyleri genişleterek veya daraltarak hücresel hayatta kalmak için bu bozuklukların karakterizasyonu yanı sıra tedavi stratejilerinin geliştirilmesi gereklidir. Şu anda hücre ölümü, doğrudan veya vekil işaretleri2Ölçme teknikleri düzinelerce vardır. Örneğin, hücre ölümü görsel yardımıyla seçerek ölü veya canlı hücre3leke hayati boyalar veya plazma zarı4,5,6 belirli fosfolipitler görünümünü izleme tarafından tespit edilebilir . Hücre içi bileşenleri veya hücresel metabolitleri hücresel dağılması üzerine medya içine serbest ölçülerini, hücre ölüm7,8için proxy olarak da kullanılabilir. Alternatif olarak, hücre canlılığı metabolik aktivite9,10değerlendirmek tarafından yaklaşık. Bu yöntemleri hücre survival değerlendirirken bir hızlı yol sağlar rağmen onlar uyarılar değildir. Her teknik kültürü tek tek hücreler ve hayatta kalma kendi benzersiz oranları arasında ayırt etmek imkansız rendering tek bir nüfus olarak gözlemler. Ayrıca, bu tür nüfus tabanlı deneyleri hücresel morfoloji, protein ifade veya yerelleştirme dahil olmak üzere hücre ölümü için önemli olabilir faktörler ölçmek mümkün değildir. Birçok durumda, bu deneyleri ayrık zaman puan için sınırlıdır ve hücreler sürekli gözlem altında zaman içinde izin vermez.
Buna ek olarak, boyuna floresans mikroskobu doğrudan ve sürekli olarak bir tek hücre olarak11ölüm riski izler son derece esnek bir metodoloji var. Kısacası, boyuna floresans mikroskobu düzenli aralıklarla uzun bir süre hücre ölümü ve geliştirmek veya hücre ölümü bastırmak faktörler kesin tespitler izin, için izlenmesi gereken tek tek hücreleri binlerce sağlar. Kaidesi Yöntem geçici transfection veya hücre iletim flüoresan protein kodlama vektörleri ile içerir. Benzersiz yediemin ardından kurulan ve bu simgesel yapı ile ilgili olarak transfected her hücrenin konumu görüntü ve tek tek hücreler saat, gün veya hafta boyunca izlemek Kullanıcı sağlar. Bu görüntüleri ardışık olarak görüntülendiğinde, hücre ölümü floresan, Morfoloji ve parçalanma her hücre için ölüm zamanını atanması olanaklı kılmak hücre vücudun karakteristik değişiklikler tarafından işaretlenir. Hazard fonksiyonu tarafından belirlenen ölüm, hesaplanan oranı daha sonra nicelik arasında koşulları karşılaştırıldığında veya tekdeğişirli veya çok değişkenli Cox orantılı tehlikeler analiz12kullanarak hücresel özellikleri seçmek için ilgili. Birlikte, bu yaklaşımların oranları hücresel popülasyonlar arasında hücre ölümü ve hücre ölümü ve/veya hayatta kalma (Şekil 1) önemli ölçüde tahmin değişkenleri tanımlaması doğru ve objektif ayrımcılık etkinleştirin.
Bu yöntem her sonrası Mitotik hücre tür biçimleri kaplama çeşitli ve hayatta kalma izlemek için kullanılabilmesine rağmen bu iletişim kuralını transfecting ve fare kortikal nöronlar kültürlü bir 96-şey tabak içinde görüntüleme için koşullar anlatacağız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm omurgalı hayvan iş kullanımı ve bakımı hayvanlar Michigan Üniversitesi (iletişim kuralı # PRO00007096) Komitesi tarafından kabul edildi. Deneyleri dikkatle hayvanlar kurban sayısını en aza indirmek için planlanmaktadır. Hamile kadın vahşi tipi (WT), transgenik olmayan uzun Evans fareler (Rattus norvegicus) ev sahipliği yaptığı tek başına çevre zenginleştirme ile donatılmış ve Michigan Üniversitesi'nde Laboratuvar hayvan Tıp (ULAM) için birimi tarafından yapılan bakım odalarında NIH destekli Rehberi uygun bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları. Bütün fareler için ötenazi, ötenazi Amerikalı hayvan hastalıklarıyla ilgili tıbbi kurum ve Michigan Üniversitesi yönergeler önerileri ile tutarlı önce mümkün olduğunca az zaman tarafından ötanazi yöntemleri konut rutin tutuldu Türler yönergeleri.
1. malzeme hazırlama
- 19 – 20 fare pups ve kültür için 4 gün vitro, poli-D-lizin kaplamalı plakalar üzerinde mililitre başına 106 hücre x 0.5, kortikal nöronlar13,14daha önce açıklandığı gibi fare embriyonik günden kortikal nöronlar incelemek, 15,16,17,18,19.
- Plazmid DNA bir endotoksin-Alerjik plazmid DNA izolasyon tarafından anlatılan adımları takip ilgi hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) kit. Bir spektrofotometre kullanarak sonuç DNA ölçmek.
- 4 (DIV4), aliquot, filtre sterilize ve 37 ° c 6 mL, aşağıdaki ortam kuluçkaya tüp bebek günde 25 mL nöronal serum medya (RSM; örneğin., OptiMEM), düşük bazal medya (Koyulmus), 40 mL NBKY (Koyulmus + 1 mM kynurenic asit + 10 mM MgCl27 pH için ayarlanabilir,. 4), 10 mL NBC (Koyulmus + 1 x nöronal hücre kültür özel sayı + 1 L-glutamin takviyesi x + 1 kalem Strep x).
Not: Listelenen birimler transfecting bir 96-şey plaka için yeterlidir. Malzemeler tablo belirli reaktifler için başvurun.
2. sıçan kortikal nöronların transfection
- Sağlanan örnek transfection sayfası değiştirmek (bkz. ek dosya 1) plaka tipi, plaka harita, DNA'lar, sayısını ayarlayarak DNA konsantrasyon ve wells (yeşil kutuları) sayısı.
Not: Toplam DNA özetliyor şey, başına 0.2 µg için ne olursa olsun, ister bir (e.g., DNA'a) veya daha fazla (örneğin, DNA B ve C) DNA yapıları eklenir her şey için. - Elektronik tablodan çalışan, RSM ve DNA uygun miktarda bir tüp içinde birleştirmek. RSM ve transfection reaktifi (örneğin, Lipofectamine) ayrı bir tüp uygun miktarda birleştirin.
- Oda sıcaklığında (RT) 5 min için kuluçkaya.
- DNA ve transfection reaktif RSM karışımları birleştirin ve RT 20 dk için kuluçkaya.
- Bu kuluçka adımı sırasında bir çok kanallı pipet kullanın ve yıkamak için steril plastik kaplar hücreleri 2 x 100 µL Koyulmus kuyu başı ile. Klimalı ortam (CM) ayırma ve 37 ° C'de depolayın Bu ve aşağıdaki adımları için nöronlar havaya maruz zamanı en aza indirmek için özen gösterin.
- Koyulmus medyayı çıkarın ve NBKY kuyu başına 100 µL yerine.
- 20 dk geçti sonra transfection reaktif/DNA karışımdan 50 µL dropwise her şey için ekleyin.
- Transfection reaktif/DNA komplekslerinde 37 ° C'de 20 dk için hücrelerle kuluçkaya
- 2 x NBKY ile durulayın ve cm 100 µL ve NBC 100 µL iyi ücret ile değiştirin.
- Başarılı bir şekilde transfected hücreleri floresan mikroskopi transfection 16-24 h içinde tarafından görünür olmalıdır. Verimliliği ölçmek için floresan mikroskop transfection 37 ° C'de gecede kuluçka sonra denetlemek için kullanın.
Not: Bu teknik bir genel transfection verimlilik % 5-10 içinde sonuçlanır.
3. görüntüleme
- Plaka motorlu bir sahne ile floresan mikroskop yer ve plaka yansıma her zaman hizalamak kullanıcının izin verir (örneğin, kalenin dibinde bir işareti) bir güvene kurmak. Bu başvuru için Mütevelli görüntüsünü kaydedin.
- İlgi alanına gidin ve x-y koordinatları göreli olarak güvene dikkat edin.
- Transfected hücreleri floresan bir etiket ifade üzerinde odaklanın.
- Floresan görüntü uygun kanal veya kanalları (örneğin, kırmızı floresan protein [RFP], yeşil flüoresan protein [GFP], ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), el ile veya otomatik bir şekilde alabilir. Düzenli aralıklı aralıklarla birkaç görüntü alarak, iyi bir montaj görüntü işleme sırasında birleştirilebilecek (bkz. Adım 4).
Not: Boşluğu büyütme, optik mikroskop ve dedektör boyutu da dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Genel olarak, optik aralığı bitişik görüntüler arasında arasında 90 – 95 oranında görüntü örtüşme küçük bir derece için izin ve hizalama özelliği için tek tek her görüntünün boyutunu olacak. - Bu gerekli, özgün güvene kaydırılmasını sıklıkta her zaman adımları tekrarlayın. Sağkalım analizi için hücre tipi ve deneme amacı bağlı olarak her 6-24 h görüntüleme gerçekleşir.
4. görüntü işleme
Not: Resim alma, işleme adımları bir dizi görüntü analizi önce gerekli. Bunlar, bunlarla dikiş, istifleme ve arka plan çıkarma (Şekil 1) için sınırlı değildir. Bir görüntü yığını veya hücreleri açıkça ayırt kendi arka plan ve birden çok kez puan üzerinden takip edilmesi kolay olan saat serisi oluşturmak için aşağıdaki adımları hedefidir. Adanmış bir FIJI makro (Image_Processing.ijm, ek dosya 2' ye bakın), temel dikiş, istifleme, gerçekleştirir ve arka plan çıkarma. Her adım ve görüntü işleme işlemi sırasında göz önünde bulundurulacak parametreleri açıklaması tartışma bölümünde sağlanmıştır.
- Ham veriler veya Şekil 2' de gösterilen biçimlendirmesiyle eşleşecek şekilde giriş dizini ayarlayın.
- Eğer zaman puan bitişik olmayan (örneğin, T1, T2, T3), klasörü yeniden adlandırın bu böylece bunlar olur. Image_Processing makro kaza değil emin olmak için kritik bir adımdır yığınlama sırasında.
- Açık bilgisayar programı, o zaman'ı tıklatın ve Image_Processing makro Fiji çubuğuna sürükleyin için Fiji simgesini çift tıklatın. Bu makro Fiji içinde açılacaktır.
- Giriş dizini içeren görüntüleri, istenen çıkış dizinini dikişli ve yığılı karakterler görüntüler için görüntüleme timepoints sayısı, floresan kanalları ve plaka biçimi belirtmek için Image_Processing makro 2-7 satırlık ayarlayın.
- Görüntüleri elde sırasını belirler. Bu test etmek için el ile bir montaj FIJI görüntülerin eklentileri damla aşağı yemek listesi | manevra tarafından dikiş Dikiş | Kılavuzu/koleksiyonunda dikiş. Doğru bir şekilde dikişli görüntü üretilen kadar açılan menüleri türü ve Düzen içinde ayarları.
- 8 ve 9 bu seçimleri eşleşecek şekilde Image_Processing makro hatlarında GRID_TYPE ve STITCH_ORDER değişkenleri ayarlayın.
- İyi başına çekilen fotoğraf sayısı hat 10 Image_Processing makrosunda ayarlayarak belirtin.
Not: Görüntüleri için bir 2 x 2 Montaj DIM bu satırı okur musunuz = 2. - Arka plan çıkarma gerekiyorsa, satır 14 BGSUB Image_Processing makrosunda ayarlamak = true.
- Image_Processing makro içini kaplamak 15 ayarlayarak haddeleme topu yarıçapı ayarlayın.
Not: En iyi sonuçlar için yarıçapı için en az ayarlayın çapı görüntüdeki en büyük ön plan nesnesinin. - Image_Processing makro başlatmak için Çalıştır ' ı tıklatın. Bir kez başladı, Image_Processing otomatik olarak dikiş, istifleme ve arka plan çıkarma ilerler.
5. hücre ölümü Puanlama
Not: Tartışma bölümünde daha fazla bilgi için bkz: skor hücre ölümü ve sansür üzerinde.
- Görüntü yığınları Image_Processing komut dosyası tarafından üretilen bulun. Bunlar Fiji'de açın.
- Aracı gelin FIJI içindeki tek tek her hücre bir sayı ile etiketlemek için kullanın. Her noktası hücre tanımlayıcı ROI (bölge ilgi) Yöneticisi için katacak sonunda t tuşuna basın.
Not: Tanımlayıcılar için etiketleri ve Tümünü göster onay kutularını ROI Yöneticisi'nde tıklatarak görüntülenmeyecektir. -
Her görüntü yığını ve kaydına her hücre zaman ya ölür ya da Survival_spreadsheet.csv (bakınız ek dosya 3) dosyasında sansür gerekiyor timepoint timepoints yoluyla ilerleme.
- Her hücre nerede onun de karşılık gelen ve yatırım getirisi sayısı o kadar iyi içinde her hücre için benzersiz bir tanımlayıcı (kimlik) oluşan elektronik tablo, tek bir satır kaplar. tp_death bir hücre ölüm saat içinde gerçek zaman time_death temsil ederken yaşadığın için gözlenen son saat noktasıdır. Her hücre için bu veri girişi. Hayatta kalma kullanarak daha sonraki analiz için bu yapısını korumak için çok önemlidir. R (bkz. ek dosya 4).
Not: hücre ölümü belirlemek için ölçütleri açısından büyük önem taşıyor ve hücre türüne bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Üç ana kriterler ölü nöronlar11,20 (Şekil 3) tanımlaması kullanılır: floresan yoğunluğu (örneğin, 69 s nöron 1) kaybı hücre vücut (örneğin, 188 s nöron 2) ve neurite kaybı yuvarlama bütünlüğü veya blebbing (örneğin, 188 s nöron 2).
- Her hücre nerede onun de karşılık gelen ve yatırım getirisi sayısı o kadar iyi içinde her hücre için benzersiz bir tanımlayıcı (kimlik) oluşan elektronik tablo, tek bir satır kaplar. tp_death bir hücre ölüm saat içinde gerçek zaman time_death temsil ederken yaşadığın için gözlenen son saat noktasıdır. Her hücre için bu veri girişi. Hayatta kalma kullanarak daha sonraki analiz için bu yapısını korumak için çok önemlidir. R (bkz. ek dosya 4).
- Kaydı son sütununda hücreyi sansür durumunu.
Not: Burada, kendine özgü biçimi nedeniyle sansür ele alınır sansürsüz hücreleri 1tarafından işaretlenmiş ise R, 0tarafından sansürlü hücreleri işaretlenir. Son zaman noktası yaşamak tüm hücreleri sansür ve bu nedenle 0işaretlenmiş unutmayın.
6. Cox orantılı performans analizi ve görselleştirme sonuçları tehlikeleri
- Gerekirse, https://cran.r-project.org/mirrors.html, R studio indirin.
- R studio açın ve hayatta kalmak için simgesini çift tıklatın. R komut dosyası.
- İmleci hayatta kalma hat 2. R ve hayatta kalma kütüphane yüklemek için ana R studio penceresinde Çalıştır düğmesini tıklatın.
- Hat 5 hayatta kalma değiştirin. R dosyasının konumunu eşleşmesi için komut dosyasını Survival_spreadsheet.csv. Bir dataframe olarak hayatta kalma verileri yüklemek için Çalıştır ' ı tıklatın.
- 8 ve 9 satırları vurgulamak ve Cox orantılı tehlikeler analiz gerçekleştirmek için R studio konsol penceresinde Çalıştır düğmesini tıklatın. Sonuçları ve çıkış istatistik R studio konsol penceresinde görünür.
- Satırları 12-16 hayatta kalma vurgulamak. R ve R Studio araziler sekmesinde görünür ölüm Arsa toplu riski üretmek için çalıştırma düğmesine basın. Bu dosyayı arsa üzerinde Aktar düğmesini tıklayarak kaydedilebilir.
- Bu bir Kaplan-Meier eğrisi olarak hayatta kalma verileri çizmek için arzu edilir eğer hatları 19-24 hayatta kalma vurgulayın. R ve çalıştırma düğmesine basın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan transfection yordamı kullanarak, DIV4 sıçan kortikal nöronlar floresan protein mApple kodlama bir plazmid ile transfected. 24 saat sonrası transfection başlayarak, hücreleri floresan mikroskopi her 24 h 10 gün üst üste görüntüsü. Sonuç görüntüleri Şekil 2' de gösterildiği gibi düzenlenen sonra dikişli, yığılmış ve hücre ölümü (Şekil 1) attı. Şekil 3 gösterir bir zaman ders 3 temsilcisi nöronlar için iki üçüncü sırasında (nöronlar 1 ve 2) deney süresince hangi Die (nöron 3) hayatta kalır.
Hayatta kalma veri (hayatta kalma. sağlanan R komut dosyası kullanarak analiz edildi R) ve sonuçları Şekil 4' te özetlenmiştir. Satır 7 ve 8 hayatta kalma çalışan üzerine oluşturulan tablo. R kod orantılı tehlikeler analiz Cox bir özetini sağlar. Dört özellikle önemli istatistik tablo Şekil 4Avurgulanır. Kutu 1 rakam grubu "WT" göre "Mutant" için tehlike oranı gösterir. "WT" grup değil listelendiğine dikkat edin. Bu çünkü "WT" Grup başvuru nüfus hizmet vermektedir - diğer gruplarında gözlenen ölüm riski bu tehlike oranı hesaplamak için başvuru nüfus karşılaştırılır. Bu nedenle, tehlike oranları 1 ölüm başvuru nüfus ile karşılaştırıldığında daha hızlı bir oranını gösterir ve 1'den küçük değerler daha büyük indirimli ölüm temsil eder. Sağlanan örnekte, mutasyona uğramış hücreler 2.2, 2.2 x WT hücreleri daha hızlı öldükleri anlamına gelen tehlike oranında görüntüler. Varsayılan olarak, R başvuru nüfus hizmet veren en iyi grup da alfasayısal düzende, gruplarla ayarlayacaktır. Grup adlarının önünde numaraları onlar değerlendirilme düzeni kurmak için kolay bir yol çiziyor. Değerler kutularını 2 ve 3 ' te p değerleri ile % 95 güven aralıkları tehlike oranları için sırasıyla, Cox orantılı tehlikeler analiz tarafından hesaplanan temsil eder. Kutusu 4' te, günlük-rank testi sonuçlarını rapor edilir. Hayatta kalma test ediliyor, nüfus arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olup bu test değerlendirir ama hangi grupları diğerlerinden farklıdır ve gözlenen fark için bir büyüklük hesaplamaz açıklanmaz.
Kaplan-Meier eğrileri (Şekil 4B) hastanın hayatta kalma bir müdahale etkilerini değerlendirmek için klinik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, birçok araştırmacı bu şekilde görselleştirildiği hayatta kalma veri yorumlama ile tanıdık geliyor. Tek hücreli yaşam bağlamında, bu araziler her grupta zamanla hücreleri hayatta kısmını tasvir. Çizdirme hücre sağkalım yerine, hücre ölüm ölüm Arsa (Şekil 4 c) toplu riski ile her grupta oranı tasvir alternatif bir yaklaşımdır. Çoğu hayatta kalma çalışmalarda, olayların sayısını doğrusal bir ilerleme takip etmez; Bunun yerine, ölüm belirli bir oranı için önceki zamanlarda olaylar daha fazla sayıda görülmektedir. Örneğin, bir nüfus 100 hücreleri, hücrelerinin % 20 arasındaki aralıkları, ölürsen sonra 20 hücreleri ilk aralığında, 16 ikinci Aralık 13 üçüncü Aralık sırasında sırasında ölecek ve benzeri. Bu Logaritmik eğilim kavramsal olarak negatif günlük dönüşüm hücresel hayatta kalma y ekseni temsil ettiği toplu ölüm araziler, riski kullanarak görselleştirmek kolaydır. Alternatif olarak, ölüm Arsa toplu riskini y ekseni 1-1/etoplu ölüm riskiolarak hesaplanan % hücre ölümü olarak da sunulabilir. Bu araziler de nüfus arasında ölüm riski basit karşılaştırma etkinleştirin. Tehlike oranı büyüklüğü her nüfus, göreli başvuru grubu, ölüm Arsa toplu riskini eğimi yansıtır.
Şekil 1: şema tipik bir hayatta kalma deneme için. Sıçan kortikal nöronlar DIV4 transfected Bu makalede özetlenen yordamı kullanarak. 24 saat sonrası transfection başlayarak, hücreleri denemenin belirli ihtiyaçlarına göre düzenli aralıklı aralıklarla görüntüsü. Görüntüleri dikişli ve hücre ölümü attı ve Cox orantılı Tehlike Analizi nüfus arasında ölüm riski karşılaştırmak için kullanılan önce yığılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: gerekli dosya yapısı. Sağlanan FIJI makro ham verileri belirli bir şekilde biçimlendirilmiş gerektirir. Kullanmak için Image_Processing, organize ham veri solda gösterildiği gibi. Bir örnek deney ve dosya yapısı eşlik eden sağ tarafta gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: hücre ölümü transfected sıçan kortikal nöronların Puanlama. Bu makalede açıklanan yöntemleri kullanarak, sıçan kortikal nöronlar floresan protein mApple kodlama bir plazmid ile transfected. Hücreleri sonra yaklaşık her 24 h görüntüsü, görüntüleri dikişli ve yığılmış ve sağlanan ölçütler kullanarak hücre ölümü attı. Hücre ölümü için nöron 1, 69 h, floresans kaybı kanıtladığı olarak belirtilir. Nöron 2 188 s hızla parçalanma süreçleri ve hücre gövdesi yuvarlama tarafından belirtildiği şekilde ölür. Nöron 3 deneme süresi için hayatta kalır. Not olarak 235 h adlı yeni bir hücrenin görünümünü kanıtladığı bazı hücreler yalnızca geç denemede, görünür olacaktır. Daha sonraki analizler içinde görüntüleme ilk anda görülebilen tek hücreler dikkate alınır. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Cox orantılı Tehlike Analizi yorumu. (A)çıkış Özeti bu şekilde vurgulanır dört önemli istatistikleri içerir. Kutu 2 ve 3. kutuya her tehlike oranı % 95 güven aralığı ve p-değerlerini sırasıyla gösterirken kutusu 1 tehlike oranı kontrol grubuna göre deney grubu içerir. Kutusu 4 günlük-rank testi sonucunu vurgulamaktadır. Bu veriler de görülen üzerinden bir Kaplan-Meier eğrisi (B) ve ölüm Arsa (C) toplu riski vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, doğrudan tek hücre olarak nöronal hayatta kalma izlemek için metodoloji sunulur. Ayrık zaman puan ve hücre tüm nüfus için sınırlı olan geleneksel deneyleri aksine hücre ölümü için çeşitli faktörlere hücresel morfoloji, protein ifade veya yerelleştirme, gibi sürekli değerlendirilmesi için bu yöntem sağlar ve nasıl her faktörü hücresel hayatta kalma ileriye dönük bir şekilde etkilediği belirleyebilirsiniz.
Bu metodoloji deneysel ihtiyaçlarını geniş bir dizi uyacak şekilde değiştirilebilir. Sıklığı ve süresi, görüntüleme kolaylıkla ayarlanabilir ve ilgi herhangi bir protein-ebilmek var olmak hastalık durumlarında model veya protein işlevi13,14,15araştırmak için floresan marker ile birlikte transfected, 16,17,18,19. Sıçan kortikal nöronlar transfecting en uygun yordamı bu makalede rağmen deneysel şema herhangi bir sonrası Mitotik hücre türüne uygulanabilir. Ancak, en iyi transfection koşulları bir hücre başına satır olarak optimize edilmiş olması gerekebilir ve yüzeylerde topaklanma veya güvenilir bir şekilde izlemek çok fazla hareketli hücreleri önlemek için ayarlanması gerekebilir.
Görüntü işleme ve analiz gereksinimleri her boyuna mikroskobu deney belirli parametrelere bağlı olarak değişir. Her kritik adım kısa bir açıklaması aşağıda daha iyi uyum Protokolü deney'nın talepleri özelleştirmek amacıyla bulunmaktadır.
Dikiş: görüntülerin montaj alınırsa, dikiş görüş her alan için tek ve daha büyük bir görüntü oluşturmak için gerçekleştirilebilir. Çoğu uygulama için yığın önce dikiş gerçekleştirmek için tercih edilir. Eğer sadece bir görüntü iyi alınır, bu adımı gerçekleştirmek için gerek yoktur.
İstifleme: Hücreler zamanla ayrı görüntü dosyaları arasında izleme yerine, istifleme stop çerçeve animasyon için benzer bir seferinde dizisine ardışık görüntüleri hizalamak için gerçekleştirilebilir. Başarılı güvene dayalı hizalama ile yığılmış görüntü oluşan tek tek kare yakından hizalanır. Ancak, fark vardiya veya rotasyonlar çerçeveler arasında varsa, görüntü kayıt gereklidir. Image_Processing makro otomatik olarak "MultiStackReg." FIJI eklentisi kullanarak kayıt yapar Bu eklenti görüntüleme çalıştırma arasında küçük misalignments azaltılmasına yardımcı olur. Ancak, önemli vardiya ile el ile kırpma ve resim yeniden gerekebilir.
Arka plan çıkarma (isteğe bağlı): resim alma sırasında ortaya çıkabilecek olası bir sorunu olduğunu düzensiz aydınlatma. Bu tahminleri floresans yoğunluk şaşkın bir görüntü arasında sinyal şiddeti farklılığı neden olur. Bu durumda, yoğunluk varyasyonları arka plan çıkarma teknikleri ile ortadan kaldırılabilir. Bunlar nereye yoğunluğu vardiya nedeniyle düzensiz aydınlatma-ebilmek var olmak karşılaştırılabilir büyüklükte fluorophore kendisi sinyal noise oranları için düşük sinyal ile özellikle ilgilidir. Hangi birkaç FIJI eklentileri ilişkilendirilmiş olan birçok arka plan çıkarma algoritması vardır. Seçim hangi algoritması kullanmak için kendisi ve ölçülen sinyal görüntü özelliklerine bağlıdır. Image_Processing, FIJI makro içinde Kullanıcı "haddeleme topu" gerçekleştirmek için seçeneği verilir arka plan çıkarma görüntüleri (hat 14) yığılmış bir dizi. Bu yöntemde, yerel bir arka plan o pikselin çevreleyen bir daire ortalama yoğunluğuna göre her piksel için belirlenir. Bu değer daha sonra pikselin ilk değerden çıkarılır. Optimal değeri tahminleri farklı olacak yerel arka planı için kullanılan dairenin yarıçapı için çapı görüntüdeki en büyük ön plan nesnesinin temel.
Hücre ölümü Puanlama: Nüfus arasında doğru karşılaştırmalar için ölü nöronlar tanımlamak için yukarıda belirtilen kriterleri tüm veri kümesini tutarlı bir şekilde uygulanması esastır. Ayrıca, bireylerin kör Puanlama hücre ölümüne soruşturma altında deneysel grupları için önyargı potansiyel kaynakları ortadan kaldırır. Belirli bir ölçüte uyan ve onların generalizability bağlı olarak, onlar tarafsız değerlendirme hücresel hayatta kalma15,16,17,18, için otomatik algoritmalar dahil 19.
Sağkalım Analizi bağlamında ve diğer zaman olay analizleri, üç olası sonuç vardır. İlk olarak, olay (hücre ölümü) oluştu ve olayın oluştuğu saat kaydedilir. İkinci olarak, olay gözlem zaman dilimi içinde meydana gelmedi. Bu gözlemler deney bitiminde sansür. Çünkü hücre görüş alanı dışına taşınmış veya yakındaki hücreleri tarafından kapatmamasını üçüncü olarak, olay toplam değil. Bu durumda, ne zaman doğru bir şekilde artık izlenebilir hücre sansür. İlk sonuç hücre ölümü hassas zamanlama görüntüleme aralığı temel belirlemek zor olabilir. Örneğin, başlangıçta yaşıyor ama ölü 24 saat sonra işaretlenmiş bir hücreye 24 saat süre içinde herhangi bir noktada ölmüş olabilir. Muhafazakar olmak gibi bir hücre güvenle canlı (sol sansür olarak) tanımlanabilir en son ne zaman ölüm zamanını kaydetmek için yararlı olur.
Performans Cox orantılı tehlikeler analiz ve sonuçları görselleştirme: nüfus ve Cox orantılı tehlikeler kullanarak kendi istatistiksel anlamlılık arasında ölüm riskini karşılaştırılması eşlik eden Survival.R komut sağlar analiz (Şekil 4A) ve aynı zamanda Arsa sonuçları bir Kaplan-Meier eğrisi (Şekil 4B) ya da ölüm Arsa (Şekil 4 c) toplu riski olarak. Sağkalım analizi, Cox orantılı tehlikeler analiz ve R "hayatta kalma" paketinde Christensen12 ve https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Burada açıklanan yordamları adapte tarafından çeşitli nöronal Özellikler hayatta kalması için ilgili olabilir. Hücre gövdesi ve/veya çekirdeği etrafına bir yatırım getirisi nesil boyuna hücre boyutu ve morfoloji, protein ifade düzey ve yerelleştirme veya puncta gibi hücre altı yapıların oluşumu izlemek için kullanıcı sağlayan veya protein13 toplar , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. bu faktörlerin her biri hücre ölümü ile ilgili olarak görülmektedir çünkü önemlisi, kantitatif bireysel faktörler hücresel hayatta kalma ya da belirli zaman dilimi boyunca ölüm ne kadar iyi tahmin belirlemek mümkün. Protein metabolizması ve hücresel yollar de denetlesinler temel Hücresel Fizyoloji gerçek zamanlı ölçümler sağlamak floresan gazetecilere ifade ederek (e.g., gCaMP6f etkinliği tahlil). Bu güçlü yaklaşım istihdam ederek, hücresel bakım, işlev ve disfonksiyon sürücü faktörler ele geçen ve okudu içinde ayrıntı, böylece soruşturma yeni yollar ilham verici olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Steve Finkbeiner ve üyeleri Finkbeiner lab robot mikroskobu öncü için teşekkür ederim. Biz de ilk yazılım görüntü işleme için gerekli ve sağkalım Analizi otomatik bina için Dan Peisach teşekkür ederim. Bu eser nörolojik bozukluklar ve kontur (NINDS) R01-NS097542, Michigan Üniversitesi'nde Protein katlanır hastalığı girişimi ve Ann Arbor etkin ALS karşı için Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
