Dit protocol beschrijft experimentele procedures karakteriseren van genoom-brede veranderingen in de niveaus van Histon posttranslationele modificaties (PTM) die zich voordoen in verband met de overexpressie van eiwitten ALS en Parkinson in zijn gekoppeld Saccharomyces cerevisiae modellen. Na SDS-pagina de scheiding, worden individuele Histon PTM niveaus gedetecteerd met wijziging-specifieke antilichamen via het westelijke bevlekken.
Neurodegeneratieve ziekten, zoals Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de ziekte van Parkinson (PD), leiden tot het verlies van honderden duizenden levens per jaar. Effectieve behandelingsopties kunnen stoppen progressie van de ziekte ontbreken. Ondanks de inspanningen van de uitgebreide rangschikken in grote populaties van de patiënt blijven de meeste ALS en PD gevallen onverklaarbare door genetische mutaties alleen. Epigenetica mechanismen, zoals de posttranslationele wijziging van Histon eiwitten, kunnen worden betrokken in de etiologie van neurodegeneratieve ziekte en de progressie en leiden tot nieuwe streefcijfers voor farmaceutische interventie. Zoogdieren in vivo en in vitro modellen van ALS en PD zijn duur en vereisen vaak langdurige en moeizame experimentele protocollen. We schetsen hier, een praktische, snelle en kosteneffectieve aanpak bij de vaststelling van genoom-brede wijzigingen in Histon wijziging niveaus met behulp van Saccharomyces cerevisiae als een modelsysteem. Dit protocol voorziet in uitgebreide onderzoeken naar de epigenetische veranderingen verbonden met neurodegeneratieve proteinopathies die eerdere bevindingen in verschillende modelsystemen bevestigen terwijl aanzienlijk uitbreiden van onze kennis van de neurodegeneratieve ziekte epigenome.
Neurodegeneratieve ziekten zijn verwoestende ziekten met weinig tot geen behandelingsopties beschikbaar. Onder deze zijn Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de ziekte van Parkinson (PD) bijzonder verschrikkelijk. Ongeveer 90% van de gevallen van ALS en PD worden beschouwd als sporadisch, die zich zonder familiegeschiedenis van de ziekte, terwijl de resterende gevallen uitgevoerd in gezinnen en in het algemeen zijn gekoppeld aan een specifiek gen mutatie1,2. Interessant, zijn beide van deze ziekten geassocieerd met de eiwitten mislocalization en aggregatie3,4,5,6. Bijvoorbeeld, gesmolten in Sarcoom (FUS) en TAR DNA-bindende eiwit 43 (TDP-43) zijn RNA-bindende proteïnen die mislocalize naar het cytoplasma en samen te voegen in ALS7,8,9,10, 11,12, terwijl α-synuclein het principe onderdeel van eiwithoudende aggregaten Lewy organen genoemd in PD5,13,14,15 is.
Ondanks de inspanningen van de uitgebreide genoom-brede vereniging in grote populaties van de patiënt blijven de overgrote meerderheid van ALS en PD gevallen onverklaarbare genetisch. Epigenetica een rol kan spelen in neurodegeneratieve ziekte? Epigenetica omvat wijzigingen in genexpressie voorkomen zonder veranderingen aan onderliggende DNA-sequentie16. Een belangrijkste epigenetische mechanisme omvat de post-vertalende wijzigingen (PTMs) van Histon eiwitten16. In eukaryote cellen, is genetisch materiaal strak verpakt in chromatine. De basiseenheid van de chromatine is de nucleosoom, bestaande uit 146 basenparen van DNA gewikkeld rond een Histon octamer, bestaande uit vier paar histonen (in tweevoud elke histonen H2A, H2B, H3 en H4)17. Elke Histon heeft een N-terminal staart dat steekt uit de nucleosoom en kan worden gewijzigd door de toevoeging van verschillende chemische wordt, meestal op lysine en arginine residuen18. Deze PTMs zijn dynamisch, wat betekent dat zij gemakkelijk kunnen worden toegevoegd en verwijderd en groepen zoals acetylation, methylering en fosforylering. PTMs controle van de toegankelijkheid van DNA voor de transcriptionele machines, en aldus bijdragen tot het besturingselement gen expressie18. Bijvoorbeeld, histone acetylation vermindert de sterkte van de elektrostatische interactie tussen het eiwit zeer fundamentele histone en de negatief geladen DNA ruggengraat, waardoor de genen ingepakt door geacetyleerd histonen meer toegankelijk te maken en dus zeer 19uitgedrukt. Meer recentelijk, de opmerkelijke biologische specificiteit van bepaalde Histon PTMs en combinaties daarvan heeft geleid tot de Histon code hypothese20,21 in welke eiwitten die schrijven, wissen en lezen Histon PTMs alle in concert handelen moduleren genexpressie.
Gist is een handig model te bestuderen neurodegeneratie. Nog belangrijker is, zijn veel neuronale cellulaire routes bewaard uit gist tot mens22,23,24. Gist recapituleren cytotoxiciteit fenotypes en eiwit insluitsels op overexpressie van FUS, TDP-43 of α-synuclein22,23,24,25,26. In feite, hebben Saccharomyces cerevisiae modellen van ALS zijn gebruikt ter identificatie van de genetische risicofactoren in mens27. Bovendien, gist menselijke α-synuclein toegestaan voor de karakterisatie van het Rsp5-netwerk als een druggable doel om te verzachten van α-synuclein toxiciteit in neuronen28,29overexpressing.
Hier beschrijven we een protocol exploitatie van Saccharomyces cerevisiae voor het detecteren van genoom-brede Histon PTM wijzigingen neurodegeneratieve proteinopathies (Figuur 1) is gekoppeld. Het gebruik van S. cerevisiae is zeer aantrekkelijk vanwege zijn gebruiksgemak, lage kosten, en snelheid in vergelijking met andere modellen van het in vitro en dierlijk van neurodegeneratie. Gebruik te maken van eerder ontwikkeld ALS en PD modellen22,23,25,26, we hebben overexpressie menselijke FUS TDP-43 en α-synuclein in gist en ongedekte verschillende Histon PTM veranderingen in verbinding met elke proteinopathy30. Het protocol dat wij hier beschrijven kan worden afgerond in minder dan twee weken van transformatie tot data-analyse.
Het protocol hier beschreven biedt een eenvoudige, doelmatige en kosteneffectieve manier van het categoriseren van genoom-brede Histon PTM wijzigingen gecorreleerd met neurodegeneratieve proteinopathies. Hoewel er andere modellen van ALS en PD, zoals in vitro modellen menselijke cellijnen en RattenUitrustingen32, S. cerevisiae blijft aantrekkelijk vanwege haar gebruiksgemak. Bijvoorbeeld, gist modellen vereisen geen gebruik van een steriele kap, noch hoeven zij de intensieve ople…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Royena Tanaz Huda Yousuf en Sadiqa Taasen voor technische hulp. We zijn zeer dankbaar aan Prof. James Shorter royale voordelevering van reagentia en intellectuele bijstand bij het ontwerpen van sacharose tuning experimenten. Gist plasmiden waren een gulle gift van Prof. Aaron Gitler (met inbegrip van 303Gal-FUS; Addgene plasmide # 29614). Brooklyn College en de Advanced Science Research Center (CUNY) evenals een NIH NINDS geavanceerde postdoctorale overgang Award (K22NS09131401) ondersteund M.P.T.
-His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |