Caractériser l’Histone modifications post-traductionnelles levure neurodégénératives Proteinopathy modèles
Summary
Ce protocole énonce les procédures expérimentales afin de caractériser le génome des changements dans les concentrations des modifications post-traductionnelles des histones (PTM) survenant dans le cadre de la surexpression de protéines associées à la SLA et la maladie de Parkinson dans Modèles de Saccharomyces cerevisiae . Après la séparation de SDS-PAGE, niveaux PTM histones individuelles sont détectés avec une modification spécifique des anticorps par Western Blot.
Abstract
Les maladies neurodégénératives, comme la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et de la maladie de Parkinson (MP), entraîner la perte de centaines de milliers de vies chaque année. Options de traitement efficaces capables de stopper la progression de la maladie ne manquent pas. Malgré les efforts de séquençage des grandes populations de patients, la plupart des cas de SLA et la MP demeure inexpliquée par des mutations génétiques. Mécanismes épigénétique, telles que la modification post-traductionnelle des protéines histones, pourraient être impliqués dans la progression et l’étiologie des maladies neurodégénératives et conduisent à de nouvelles cibles d’intervention pharmaceutique. Des modèles mammifères in vivo et in vitro de la SLA et la MP sont coûteuses et nécessitent souvent de longues et laborieuses des protocoles expérimentaux. Ici, nous présentons une méthode pratique, rapide et rentable pour déterminer pangénomique modifications dans les niveaux de modification d’histone utilisant Saccharomyces cerevisiae comme modèle. Ce protocole permet d’enquêtes approfondies dans les changements épigénétiques connectés à proteinopathies neurodégénérative que corroborent les conclusions antérieures dans des systèmes différents modèles tout en élargissant considérablement notre connaissance de la épigénome de maladies neurodégénératives.
Introduction
Les maladies neurodégénératives sont des maladies dévastatrices avec peu ou aucune option de traitement disponible. Parmi ceux-ci, la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie de Parkinson (MP) sont particulièrement horribles. Environ 90 % des cas de SLA et PD sont considérés comme sporadique, qui se produisent sans antécédents familiaux de la maladie, tandis que le reste des cas dans les familles et sont généralement liées à un gène spécifique mutation1,2. Fait intéressant, les deux de ces maladies sont associés à la protéine localisée et agrégation3,4,5,6. Par exemple, fondus dans le sarcome (FUS) et de protéines de liaison à l’ADN de goudron 43 (TDP-43) sont des protéines de liaison ARN qui mislocalize vers le cytoplasme et agrègent l’ALS7,8,9,10, 11,12, tandis que la synucléine α est le composant de principe des agrégats protéiques appelées corps de Lewy dans PD5,13,14,15.
Malgré les efforts d’une vaste association pangénomique dans grandes populations de patients, l’écrasante majorité des cas de SLA et la MP demeure inexpliquée génétiquement. Pouvez épigénétique jouent un rôle dans les maladies neurodégénératives ? Épigénétique compose de changements dans l’expression des gènes qui se produisent sans modifications sous-jacentes de séquence ADN16. Un mécanisme épigénétique principal implique des modifications post traductionnelle (PTMs) d’histone protéines16. Dans les cellules eucaryotes, le matériel génétique est emballer soigneusement dans la chromatine. L’unité de base de la chromatine est le nucléosome, composé de 146 paires de bases d’ADN enroulé autour d’un octamère d’histones, composé de quatre paires d’histones (deux copies chacun des histones H2A, H2B, H3 et H4)17. Chaque histone possède une queue de N-terminal qui fait saillie hors du nucléosome et peut être modifiée par l’addition des fractions chimiques diverses, généralement sur de résidus de lysine et arginine18. Ces Sptm est dynamiques, ce qui signifie qu’ils peuvent être facilement ajoutés et supprimés et comprennent des groupes tels que l’acétylation, méthylation et phosphorylation. Sptm contrôle l’accessibilité de l’ADN à la machinerie transcriptionnelle et aidera ainsi le contrôle gene expression18. Par exemple, l’acétylation des histones réduit la force de l’interaction électrostatique entre la protéine histone très basiques et l’échine d’ADN chargée négativement, ce qui permet des gènes emballés par les histones acétylées soit plus accessible et donc très a19. Plus récemment, la spécificité biologique remarquable de Sptm histone particulière et leurs combinaisons a conduit à l’histone code hypothèse20,21 dans lequel les protéines qui écrire, effacer et lire histone Sptm tous agir de concert pour moduler l’expression des gènes.
La levure est un modèle très utile pour étudier la neurodégénérescence. Important, nombreuses voies cellulaires neuronales sont conservés de la levure à l’homme22,23,24. Levure récapituler les phénotypes de la cytotoxicité et inclusions de protéine sur la surexpression de FUS, TDP-43 ou α-synucléine22,23,24,25,26. En fait, modèles Saccharomyces cerevisiae de la SLA ont été utilisés pour identifier les facteurs de risque génétiques humains27. En outre, levure surexprimant la synucléine α humain autorisé pour la caractérisation du réseau Rsp5 comme cible thérapeutiques pour atténuer la toxicité de la synucléine α en neurones28,29.
Nous décrivons ici un protocole exploitant Saccharomyces cerevisiae pour détecter les modifications PTM pangénomique histone associées neurodégénératives proteinopathies (Figure 1). L’utilisation de S. cerevisiae est très attrayante en raison de sa facilité d’utilisation, faible coût et de la vitesse par rapport aux autres modèles in vitro et animaux de la neurodégénérescence. Harnessing précédemment développé ALS et PD modèles22,23,25,26, nous avons surexprimé humaines FUS, TDP-43 et α-synucléine dans les levures et changements PTM histone distincts non couverts dans connexion avec chaque proteinopathy30. Le protocole que nous décrivons ici peut être complété en moins de deux semaines d’une transformation à l’analyse des données.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici offre un moyen simple, rapide et rentable de catégoriser les changements PTM pangénomique histone corrélées avec neurodégénératives proteinopathies. Bien qu’il existe d’autres modèles de la SLA et la MP, tel que in vitro murin et des lignées cellulaires humaines modèles32, S. cerevisiae reste attractif en raison de sa facilité d’utilisation. Par exemple, les modèles de levure ne nécessitent pas l’utilisation d’une hotte stérile, ni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Royena Tanaz, Huda Yousuf et Sadiqa Taasen pour l’aide technique. Nous sommes très reconnaissants à Prof. James Shorter pour la prestation généreuse de réactifs et d’assistance intellectuelle dans la conception d’expériences tuning de saccharose. Plasmides de levure ont été un don généreux de Prof. Aaron Gitler (y compris 303Gal-FUS ; Addgene plasmidique 29614 #). Brooklyn College et de l’Advanced Science Research Center (CUNY), mais aussi un NIH NINDS Advanced Transition bourse postdoctorale (K22NS09131401) prise en charge M.P.T.
Materials
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
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