Summary

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Published: March 24, 2019
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren zur Charakterisierung von genomweiten Änderungen in der Höhe von Histon post-translationalen Modifikationen (PTM) in Verbindung mit der Überexpression der Proteine zugeordnet ALS und Parkinson in auftretenden Saccharomyces Cerevisiae Modelle. Nach der Trennung der SDS-PAGE werden einzelne Histon PTM Ebenen mit Modifikation-spezifische Antikörper über Western blotting erkannt.

Abstract

Neurodegenerative Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und der Parkinson-Krankheit (PD), verursachen den Verlust von Hunderten von Tausenden von Menschenleben pro Jahr. Es fehlen wirksame Behandlungsmöglichkeiten in der Lage, das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen. Trotz der umfangreichen Sequenzierung Bemühungen in großen Patientenkollektiven sind zum Großteil ALS auch PD durch eine genetische Mutation allein ungeklärt. Epigenetik-Mechanismen, wie die Post-translationale Modifikation der Histonproteine, können bei neurodegenerativen Krankheit Ätiologie und Progression einbezogen werden und führen zu neuen Zielen für pharmazeutische Intervention. Säugetieren in vivo und in vitro-Modelle ALS auch PD sind teuer und erfordern oft langen und mühsamen experimentelle Protokolle. Hier beschreiben wir einen praktische, schnellen und kostengünstigen Ansatz zur Bestimmung der genomweiten Veränderungen in Histon Modifikation Ebenen mit Saccharomyces Cerevisiae als Modellsystem. Dieses Protokoll ermöglicht umfassende Untersuchungen in epigenetische Veränderungen verbunden, Neurodegenerative Proteinopathies, die bisherigen Ergebnisse in verschiedenen Modellsysteme bestätigen, während deutlich erweitern unser Wissen der Neurodegenerative Krankheit Epigenom.

Introduction

Neurodegenerative Krankheiten sind verheerende Krankheiten mit wenig bis keine Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung. Unter diesen sind die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und der Parkinson-Krankheit (PD) besonders schrecklich. Etwa 90 % der Fälle ALS und PD gelten nur sporadisch, auftritt ohne Familiengeschichte der Krankheit, während die übrigen Fälle in der Familie und sind in der Regel auf ein bestimmtes Gen Mutation1,2verbunden. Interessanterweise sind beide dieser Krankheiten verbunden mit Protein Mislocalization und Aggregation3,4,5,6. Zum Beispiel in Sarkom (FUS) verschmolzen und TAR DNA-bindendes Protein 43 (TDP-43) sind RNA-bindende Proteine, die mislocalize, Zytoplasma und aggregieren ALS7,8,9,10, 11,12, während α-Synuclein das Prinzip Komponente proteinhaltige Aggregate Lewy-Körper in PD5,13,14,15bezeichnet.

Trotz der umfangreichen genomweite Bemühungen in großen Patientenkollektiven sind die überwiegende Mehrheit der Fälle ALS und PD genetisch ungeklärt. Kann Epigenetik Neurodegenerative Erkrankung eine Rolle? Epigenetik umfasst Änderungen im Genausdruck auftritt ohne Änderungen auf zugrunde liegende DNA-Sequenz16. Ein wichtigste epigenetischer Mechanismus beinhaltet die post-translationalen Modifikationen (PTMs) Histon-Proteine-16. In eukaryotischen Zellen ist genetisches Material in Chromatin fest gewickelt. Die Basiseinheit von Chromatin ist das Nukleosom, bestehend aus 146 Basenpaare der DNA umwickelt ein Histon-Octamer, bestehend aus vier Paare von Histonen (jeweils zwei Kopien der Histone H2A, H2B, H3 und H4)17. Jedes Histon hat eine N-terminale Endstück, das ragt aus dem Nukleosom und kann durch die Zugabe von verschiedenen chemischen Moieties, in der Regel auf Lysin und Arginin Rückstände18geändert werden. Diese PTMs sind dynamisch, d.h. sie können leicht hinzugefügt und entfernt und gehören Gruppen wie Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung. PTMs die Zugänglichkeit der DNA auf die transkriptionelle Maschinen zu kontrollieren, und damit Kontrolle gen Ausdruck18. Z. B. Histon Acetylierung verringert die Festigkeit der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen dem stark grundlegende Histon Protein und negativ geladenen DNA Rückgrat, so dass die Gene verpackt durch acetylierte Histone mehr zugänglich zu machen und damit hoch 19ausgedrückt. Vor kurzem hat die bemerkenswerte biologische Besonderheit des bestimmten Histon PTMs und deren Kombinationen führten zu die Histon-Code-Hypothese20,21 in welche Proteine, die schreiben, löschen und lesen Histon PTMs alle an einem Strang zu ziehen Genexpression zu modulieren.

Hefe ist ein sehr nützliches Modell Neurodegeneration zu studieren. Wichtig ist, sind viele neuronale zelluläre Signalwege von Hefe zu Menschen22,23,24konserviert. Hefe rekapitulieren Zytotoxizität Phänotypen und Protein Einschlüsse bei Überexpression von FUS, TDP-43 oder α-Synuclein22,23,24,25,26. In der Tat wurden Saccharomyces Cerevisiae Modelle Alsen zur genetischen Risikofaktoren im Menschen27zu identifizieren. Darüber hinaus Hefe-überexprimierenden menschlichen α-Synuclein erlaubt für die Charakterisierung des Rsp5-Netzwerks als druggable Ziel, α-Synuclein Toxizität in Neuronen28,29zu verbessern.

Hier beschreiben wir ein Protokoll Nutzung von Saccharomyces Cerevisiae um genomweite Histon PTM Veränderungen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Proteinopathies (Abbildung 1) zu erkennen. Die Verwendung von S. Cerevisiae ist höchst attraktiv wegen seiner Mühelosigkeit, niedrige Kosten und Geschwindigkeit im Vergleich zu anderen in-vitro- und tierischen Modellen der Neurodegeneration. Nutzung der zuvor entwickelten ALS auch PD Modelle22,23,25,26, wir haben überexprimiert menschlichen FUS, TDP-43 und α-Synuclein in Hefe und ungedeckten unterschiedliche Histon PTM Veränderungen in Verbindung mit jedem Proteinopathy30. Das Protokoll, die wir hier beschreiben, kann in weniger als zwei Wochen von Transformation zur Datenanalyse abgeschlossen werden.

Protocol

1. Umwandlung S. Cerevisiae mit Neurodegenerative Proteinopathy-assoziierten Protein Konstrukte Wachsen Sie Wildtyp (WT) 303 Hefe in Hefe Extrakt Pepton Traubenzucker (YPD) Brühe über Nacht mit schütteln (200 u/min) bei 30 ° C. Nach 12−16 h des Wachstums, verdünnen Hefe zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,25 mit YPD. Da 10 mL liquid Hefekultur für jede Transformation benötigt wird, bereiten Sie fünf Transformationen, FUS, TDP-43, a-Synuclein sowie Vektor nu…

Representative Results

Um diese Methode zu veranschaulichen, werden wir vor kurzem veröffentlichten Ergebnisse30nutzen. WT menschlichen FUS und TDP-43 wurden für 5 h überexprimiert, während für 8 h WT α-Synuclein überexprimiert wurde. Ein CcdB Konstrukt wurde als Vektor Negativkontrolle verwendet. Abbildung 2 zeigt Wachstum Unterdrückung in festen und flüssigen Kulturen. Hefe wurde geerntet, wie beschrieben und westliche Beflecken mit Modifikation-s…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine einfache, sinnvolle und kostengünstige Möglichkeit kategorisieren genomweite Histon PTM Veränderungen korreliert mit Neurodegenerative Proteinopathies. Zwar gibt es andere Modelle ALS auch PD, z. B. in-vitro- humanen Zelllinien und Murine Modelle32, S. Cerevisiae bleibt attraktiv wegen seiner einfachen Handhabung. Zum Beispiel Hefe Modelle benötigen keine Verwendung von sterilen Kapuze, noch benötigen sie das Intensive training, da…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Royena Tanaz, Huda Yousuf und Sadiqa Taasen für technische Hilfe. Wir sind sehr dankbar für die großzügige Bereitstellung von Reagenzien und geistige Unterstützung bei der Gestaltung von Saccharose tuning Experimente Prof. James Shorter. Hefe-Plasmide wurden ein großzügiges Geschenk von Prof. Aaron Gitler (einschließlich 303Gal-FUS; Addgene Plasmid # 29614). Brooklyn College und der Advanced Science Research Center (CUNY) sowie ein NIH NINDS Advanced Postdoc Übergang Award (K22NS09131401) unterstützt M.P.T

Materials

-His DO Supplement Clontech 630415
10x Running Buffer Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.
12% Polyacrylamide Gels BIO-RAD 456-1041
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody MilliporeSigma 07-353 (Lot No. 2762291) Dilution: 1/1000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody Abcam ab109463 (Lot No. GR187780) Dilution: 1/2000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody Abcam ab46983 (Lot No. GR71882) Dilution: 1/5000
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody Abcam ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) Dilution: 1/1000
Anti-Histone H3 Primary Antibody Abcam ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody Abcam ab188292 (Lot No. GR211874) Dilution: 1/1000
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody Abcam ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) Dilution: 1/1000
BioPhotometer D30 Eppendorf 6133000010
Cell Culture Dish (100 x 20 mm) Eppendorf 30702118
Cell Culture Plate, 96 well Eppendorf 30730011
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R Eppendorf 22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW LI-COR 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) Dilution: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD LI-COR 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) Dilution: 1/2500
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Extra thick blot paper (filter paper) BIO-RAD 1703968
Galactose Sigma-Aldrich G0750 Prepare 20% w/v stock solution.
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Prepare 20% w/v stock solution.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Prepare 50 % w/v solution.
Immobilon-FL Transfer Membranes MilliporeSigma IPFL00010
Lithium acetate dihydrate (LiAc) Sigma-Aldrich L4158 Prepare a 1 M solution.
Loading Dye Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.
Methanol ThermoFisher A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell BIO-RAD 1658004
Multichannel pipet Eppendorf 2231300045
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x New England Bio Labs 102855-152
Nhe I Restriction Enzyme New England Bio Labs 101228-710
Nuclease Free Water Qiagen 129114
Odyssey Fc Imaging System LI-COR Biosciences 2800-03
OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) ThermoFisher 165218
pAG303GAL-a-synuclein-GFP Gift from A. Gitler
pAG303GAL-ccdB Addgene 14133
pAG303Gal-FUS Addgene 29614
pAG303GAL-TDP-43 Gift from A. Gitler
Poly(ethylene glycol) (PEG) Sigma-Aldrich P4338 Prepare a 50% w/v solution.
Ponceau S Stain Sigma-Aldrich P3504 Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.
PowerPac Basic Power Supply BIO-RAD 164-5050
Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich R7630 Prepare 10% w/v stock solution.
Salmon Sperm DNA Agilent Tech 201190
SD-His plates Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.
SGal-His plates Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.
Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465 Prepare 0.2 M solution.
Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Prepare 20% w/v stock solution.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.
TBS Blocking Buffer LI-COR 927-5000
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD 170-3940
Transfer Buffer Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.
WT 303 S. cerevisiae yeast Gift from J. Shorter
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Sigma-Aldrich Y1375

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Bennett, S. A., Cobos, S. N., Meykler, M., Fallah, M., Rana, N., Chen, K., Torrente, M. P. Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models. J. Vis. Exp. (145), e59104, doi:10.3791/59104 (2019).

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