Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle
Summary
Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren zur Charakterisierung von genomweiten Änderungen in der Höhe von Histon post-translationalen Modifikationen (PTM) in Verbindung mit der Überexpression der Proteine zugeordnet ALS und Parkinson in auftretenden Saccharomyces Cerevisiae Modelle. Nach der Trennung der SDS-PAGE werden einzelne Histon PTM Ebenen mit Modifikation-spezifische Antikörper über Western blotting erkannt.
Abstract
Neurodegenerative Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und der Parkinson-Krankheit (PD), verursachen den Verlust von Hunderten von Tausenden von Menschenleben pro Jahr. Es fehlen wirksame Behandlungsmöglichkeiten in der Lage, das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen. Trotz der umfangreichen Sequenzierung Bemühungen in großen Patientenkollektiven sind zum Großteil ALS auch PD durch eine genetische Mutation allein ungeklärt. Epigenetik-Mechanismen, wie die Post-translationale Modifikation der Histonproteine, können bei neurodegenerativen Krankheit Ätiologie und Progression einbezogen werden und führen zu neuen Zielen für pharmazeutische Intervention. Säugetieren in vivo und in vitro-Modelle ALS auch PD sind teuer und erfordern oft langen und mühsamen experimentelle Protokolle. Hier beschreiben wir einen praktische, schnellen und kostengünstigen Ansatz zur Bestimmung der genomweiten Veränderungen in Histon Modifikation Ebenen mit Saccharomyces Cerevisiae als Modellsystem. Dieses Protokoll ermöglicht umfassende Untersuchungen in epigenetische Veränderungen verbunden, Neurodegenerative Proteinopathies, die bisherigen Ergebnisse in verschiedenen Modellsysteme bestätigen, während deutlich erweitern unser Wissen der Neurodegenerative Krankheit Epigenom.
Introduction
Neurodegenerative Krankheiten sind verheerende Krankheiten mit wenig bis keine Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung. Unter diesen sind die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und der Parkinson-Krankheit (PD) besonders schrecklich. Etwa 90 % der Fälle ALS und PD gelten nur sporadisch, auftritt ohne Familiengeschichte der Krankheit, während die übrigen Fälle in der Familie und sind in der Regel auf ein bestimmtes Gen Mutation1,2verbunden. Interessanterweise sind beide dieser Krankheiten verbunden mit Protein Mislocalization und Aggregation3,4,5,6. Zum Beispiel in Sarkom (FUS) verschmolzen und TAR DNA-bindendes Protein 43 (TDP-43) sind RNA-bindende Proteine, die mislocalize, Zytoplasma und aggregieren ALS7,8,9,10, 11,12, während α-Synuclein das Prinzip Komponente proteinhaltige Aggregate Lewy-Körper in PD5,13,14,15bezeichnet.
Trotz der umfangreichen genomweite Bemühungen in großen Patientenkollektiven sind die überwiegende Mehrheit der Fälle ALS und PD genetisch ungeklärt. Kann Epigenetik Neurodegenerative Erkrankung eine Rolle? Epigenetik umfasst Änderungen im Genausdruck auftritt ohne Änderungen auf zugrunde liegende DNA-Sequenz16. Ein wichtigste epigenetischer Mechanismus beinhaltet die post-translationalen Modifikationen (PTMs) Histon-Proteine-16. In eukaryotischen Zellen ist genetisches Material in Chromatin fest gewickelt. Die Basiseinheit von Chromatin ist das Nukleosom, bestehend aus 146 Basenpaare der DNA umwickelt ein Histon-Octamer, bestehend aus vier Paare von Histonen (jeweils zwei Kopien der Histone H2A, H2B, H3 und H4)17. Jedes Histon hat eine N-terminale Endstück, das ragt aus dem Nukleosom und kann durch die Zugabe von verschiedenen chemischen Moieties, in der Regel auf Lysin und Arginin Rückstände18geändert werden. Diese PTMs sind dynamisch, d.h. sie können leicht hinzugefügt und entfernt und gehören Gruppen wie Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung. PTMs die Zugänglichkeit der DNA auf die transkriptionelle Maschinen zu kontrollieren, und damit Kontrolle gen Ausdruck18. Z. B. Histon Acetylierung verringert die Festigkeit der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen dem stark grundlegende Histon Protein und negativ geladenen DNA Rückgrat, so dass die Gene verpackt durch acetylierte Histone mehr zugänglich zu machen und damit hoch 19ausgedrückt. Vor kurzem hat die bemerkenswerte biologische Besonderheit des bestimmten Histon PTMs und deren Kombinationen führten zu die Histon-Code-Hypothese20,21 in welche Proteine, die schreiben, löschen und lesen Histon PTMs alle an einem Strang zu ziehen Genexpression zu modulieren.
Hefe ist ein sehr nützliches Modell Neurodegeneration zu studieren. Wichtig ist, sind viele neuronale zelluläre Signalwege von Hefe zu Menschen22,23,24konserviert. Hefe rekapitulieren Zytotoxizität Phänotypen und Protein Einschlüsse bei Überexpression von FUS, TDP-43 oder α-Synuclein22,23,24,25,26. In der Tat wurden Saccharomyces Cerevisiae Modelle Alsen zur genetischen Risikofaktoren im Menschen27zu identifizieren. Darüber hinaus Hefe-überexprimierenden menschlichen α-Synuclein erlaubt für die Charakterisierung des Rsp5-Netzwerks als druggable Ziel, α-Synuclein Toxizität in Neuronen28,29zu verbessern.
Hier beschreiben wir ein Protokoll Nutzung von Saccharomyces Cerevisiae um genomweite Histon PTM Veränderungen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Proteinopathies (Abbildung 1) zu erkennen. Die Verwendung von S. Cerevisiae ist höchst attraktiv wegen seiner Mühelosigkeit, niedrige Kosten und Geschwindigkeit im Vergleich zu anderen in-vitro- und tierischen Modellen der Neurodegeneration. Nutzung der zuvor entwickelten ALS auch PD Modelle22,23,25,26, wir haben überexprimiert menschlichen FUS, TDP-43 und α-Synuclein in Hefe und ungedeckten unterschiedliche Histon PTM Veränderungen in Verbindung mit jedem Proteinopathy30. Das Protokoll, die wir hier beschreiben, kann in weniger als zwei Wochen von Transformation zur Datenanalyse abgeschlossen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll bietet eine einfache, sinnvolle und kostengünstige Möglichkeit kategorisieren genomweite Histon PTM Veränderungen korreliert mit Neurodegenerative Proteinopathies. Zwar gibt es andere Modelle ALS auch PD, z. B. in-vitro- humanen Zelllinien und Murine Modelle32, S. Cerevisiae bleibt attraktiv wegen seiner einfachen Handhabung. Zum Beispiel Hefe Modelle benötigen keine Verwendung von sterilen Kapuze, noch benötigen sie das Intensive training, da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Royena Tanaz, Huda Yousuf und Sadiqa Taasen für technische Hilfe. Wir sind sehr dankbar für die großzügige Bereitstellung von Reagenzien und geistige Unterstützung bei der Gestaltung von Saccharose tuning Experimente Prof. James Shorter. Hefe-Plasmide wurden ein großzügiges Geschenk von Prof. Aaron Gitler (einschließlich 303Gal-FUS; Addgene Plasmid # 29614). Brooklyn College und der Advanced Science Research Center (CUNY) sowie ein NIH NINDS Advanced Postdoc Übergang Award (K22NS09131401) unterstützt M.P.T
Materials
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
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