Summary

Karakterisere Histone post-translasjonell modifikasjon endringer i gjær nevrodegenerative Proteinopathy modeller

Published: March 24, 2019
doi:

Summary

Denne protokollen skisserer eksperimentelle prosedyrer for å karakterisere genomet-omfattende endringer i nivåer av histone post-translasjonell endringer (PTM) oppstår i forbindelse med overuttrykte proteiner knyttet ALS og Parkinsons Saccharomyces cerevisiae modeller. Etter SDS side separasjon oppdages personlige histone PTM nivåer med endring-spesifikke antistoffer via Western blotting.

Abstract

Nevrodegenerative sykdommer, slik som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sykdom (PD), føre til tap av hundretusener av liv hvert år. Effektive behandlingstilbud kunne stoppe sykdomsprogresjon mangler. Til tross for omfattende sekvensering i store pasientgrupper forbli fleste ALS og PD tilfeller uforklarlig av genetiske mutasjoner alene. Epigenetics mekanismer, som den post-translasjonell modifikasjonen av histone proteiner, kan være involvert i neurodegenerative sykdom etiologien og progresjon og føre til nye mål for farmasøytiske intervensjon. Pattedyr i vivo og in vitro modeller av ALS og PD er kostbare og ofte krever langvarig og arbeidskrevende eksperimentelle protokoller. Her skissere vi en praktisk, rask og kostnadseffektiv tilnærming til å bestemme genomet-omfattende endringer i histone endring nivåer ved hjelp av Saccharomyces cerevisiae som modellsystem. Denne protokollen gir omfattende etterforskning epigenetic endringer koblet til nevrodegenerative proteinopathies som bekrefte tidligere funn i annen modellsystemer samtidig betydelig utvide vår kunnskap om den neurodegenerative sykdom epigenome.

Introduction

Nevrodegenerative sykdommer er ødeleggende sykdommer med liten eller ingen behandlingstilbud tilgjengelig. Blant disse er amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sykdom (PD) spesielt forferdelig. Ca 90% av ALS og PD anses sporadisk, skjer uten familiehistorie med sykdommen, mens de resterende kjøre i familier og er vanligvis knyttet til et bestemt gen mutasjon1,2. Interessant, er begge disse sykdommer assosiert med protein mislocalization og aggregering3,4,5,6. For eksempel smeltet i sarkomspesialitet (FUS) og TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) er RNA bindende proteiner som mislocalize til cytoplasma og samlet i ALS7,8,9,10, 11,12, mens α-synuclein er komponenten prinsippet av proteinaceous aggregater kalt Lewy organer i PD5,13,14,15.

Til tross for omfattende genomet hele association i store pasientgrupper forbli det overveldende flertallet av ALS og PD uforklarlig genetisk. Kan epigenetics spille en rolle i neurodegenerative sykdom? Epigenetics omfatter endringer i genuttrykk oppstår endringer i underliggende DNA sekvens16. En viktigste epigenetic mekanisme innebærer innlegg translasjonsforskning endringene (PTMs) av histone proteiner16. I eukaryote celler, er genetisk materiale tett pakket inn i chromatin. Lagerenheten chromatin er nucleosome, består av 146 base par DNA pakket rundt en histone octamer, består av fire histones (to eksemplarer hvert av histones H2A, H2B H3 og H4)17. Hver histone har en N-terminal hale som stikker ut av nucleosome og kan bli endret med tillegg av ulike kjemiske moieties, vanligvis på lysin og arginin rester18. Disse PTMs er dynamisk, som betyr at de enkelt kan legges og fjernet, og inkluderer grupper som acetylation og metylering fosforylering. PTMs kontrollere tilgjengeligheten av DNA til transcriptional maskiner, og dermed hjelpe kontroll gene expression18. For eksempel histone acetylation reduserer styrken på elektrostatisk samspillet mellom svært grunnleggende histone protein og negativt ladde DNA ryggraden, slik at genene pakket acetylated histones å være mer tilgjengelig og dermed svært uttrykt19. Flere nylig, bemerkelsesverdig biologisk spesifisiteten av bestemt histone PTMs og kombinasjoner har ført til histone koden hypotesen20,21 i som proteiner som skrive, slette og lese histone PTMs alle handle sammen slik modulere genuttrykk.

Gjær er et svært nyttig eksempel å studere neurodegeneration. Viktigere, er mange neuronal mobilnettet baner bevart fra gjær til mennesker22,23,24. Gjær recapitulate cytotoksisitet fenotyper og protein inkluderinger på overuttrykte Fu, TDP-43 eller α-synuclein,22,,23,,24,,25,,26. Faktisk har Saccharomyces cerevisiae modeller av ALS blitt brukt til å identifisere genetiske risikofaktorer i mennesker27. Videre gjær overexpressing menneskelige α-synuclein tillatt for karakterisering av Rsp5 nettverket som druggable mål å forbedre α-synuclein toksisitet i neurons28,29.

Her beskriver vi en protokoll utnytte Saccharomyces cerevisiae å oppdage genomet hele histone PTM filendringer tilknyttet nevrodegenerative proteinopathies (figur 1). Bruk av S. cerevisiae er meget attraktivt på grunn av dens lette av bruk, lave kostnader, og hastighet i forhold til andre in vitro og dyr modeller av neurodegeneration. Utnytte tidligere utviklet ALS og PD modeller22,23,25,26, vi har overexpressed menneskelige FUS TDP-43 og α-synuclein i gjær og avdekket distinkte histone PTM omveltningene i forbindelse med hver proteinopathy30. Protokollen som beskriver vi her kan gjennomføres på mindre enn to uker fra transformasjon til dataanalyse.

Protocol

1. transformere S. cerevisiae med nevrodegenerative proteinopathy-assosiert protein konstruksjoner Vokse vill type (WT) 303 gjær i gjær ekstrakt pepton druesukker (YPD) buljong natten med risting (200 rpm) på 30 ° C. Etter 12−16 h vekst, fortynne gjær til en optisk tetthet på 600 nm (OD600) på 0,25 med YPD. 10 mL av gjær flytende kultur vil være nødvendig for hver transformasjon forberede 50 mL av gjær flytende kultur fem transformasjoner tilsvarer Fu, TDP-43, en synuc…

Representative Results

Illustrere denne metoden, vil vi dra nytte av nylig publiserte resultatene30. WT menneskelige Fu og TDP-43 var overexpressed 5 h, mens WT α-synuclein var overexpressed 8 h. En ccdB konstruksjon ble brukt som en vektor negativ kontroll. Figur 2 viser vekst undertrykkelse i faste og flytende kulturer. Gjær ble slaktet som beskrevet og vestlige blotting med endring-spesifikke antistoffer ble utført. Anti-totalt H3 ble brukt som en last…

Discussion

Protokollen beskrevet her gir en enkel, hensiktsmessig og kostnadseffektiv måte å kategorisere genomet hele histone PTM endringer korrelert med nevrodegenerative proteinopathies. Det finnes andre modeller av ALS og PD, som i vitro modeller humane cellelinjer og Trouble32, S. cerevisiae fortsatt attraktive på grunn av sin brukervennlighet. For eksempel gjær modeller krever ikke bruk av steril hette, eller de krever intensiv trening som går langs med celle kultur arbeid. Vider…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Royena Tanaz, Huda Yousuf og Sadiqa Taasen for teknisk hjelp. Vi er svært takknemlig til Prof James Shorter for sjenerøs levering av reagenser og intellektuell hjelp i utformingen av sukrose tuning eksperimenter. Gjær plasmider var en sjenerøs gave fra Prof Aaron Gitler (inkludert 303Gal-Fu; Addgene plasmider # 29614). Brooklyn College og den avanserte Science Research Center (CUNY) samt en NIH NINDS avansert postdoktor overgang Award (K22NS09131401) støttet M.P.T.

Materials

-His DO Supplement Clontech 630415
10x Running Buffer Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.
12% Polyacrylamide Gels BIO-RAD 456-1041
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody MilliporeSigma 07-353 (Lot No. 2762291) Dilution: 1/1000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody Abcam ab109463 (Lot No. GR187780) Dilution: 1/2000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody Abcam ab46983 (Lot No. GR71882) Dilution: 1/5000
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody Abcam ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) Dilution: 1/1000
Anti-Histone H3 Primary Antibody Abcam ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody Abcam ab188292 (Lot No. GR211874) Dilution: 1/1000
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody Abcam ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) Dilution: 1/1000
BioPhotometer D30 Eppendorf 6133000010
Cell Culture Dish (100 x 20 mm) Eppendorf 30702118
Cell Culture Plate, 96 well Eppendorf 30730011
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R Eppendorf 22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW LI-COR 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) Dilution: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD LI-COR 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) Dilution: 1/2500
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Extra thick blot paper (filter paper) BIO-RAD 1703968
Galactose Sigma-Aldrich G0750 Prepare 20% w/v stock solution.
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Prepare 20% w/v stock solution.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Prepare 50 % w/v solution.
Immobilon-FL Transfer Membranes MilliporeSigma IPFL00010
Lithium acetate dihydrate (LiAc) Sigma-Aldrich L4158 Prepare a 1 M solution.
Loading Dye Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.
Methanol ThermoFisher A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell BIO-RAD 1658004
Multichannel pipet Eppendorf 2231300045
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x New England Bio Labs 102855-152
Nhe I Restriction Enzyme New England Bio Labs 101228-710
Nuclease Free Water Qiagen 129114
Odyssey Fc Imaging System LI-COR Biosciences 2800-03
OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) ThermoFisher 165218
pAG303GAL-a-synuclein-GFP Gift from A. Gitler
pAG303GAL-ccdB Addgene 14133
pAG303Gal-FUS Addgene 29614
pAG303GAL-TDP-43 Gift from A. Gitler
Poly(ethylene glycol) (PEG) Sigma-Aldrich P4338 Prepare a 50% w/v solution.
Ponceau S Stain Sigma-Aldrich P3504 Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.
PowerPac Basic Power Supply BIO-RAD 164-5050
Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich R7630 Prepare 10% w/v stock solution.
Salmon Sperm DNA Agilent Tech 201190
SD-His plates Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.
SGal-His plates Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.
Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465 Prepare 0.2 M solution.
Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Prepare 20% w/v stock solution.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.
TBS Blocking Buffer LI-COR 927-5000
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD 170-3940
Transfer Buffer Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.
WT 303 S. cerevisiae yeast Gift from J. Shorter
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Sigma-Aldrich Y1375

References

  1. Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).
  2. Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
  3. Beitz, J. M. Parkinson’s Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
  4. Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
  5. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).
  6. Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), 248-264 (2013).
  7. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  8. Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
  9. Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
  10. King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
  11. Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
  12. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
  13. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
  14. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson’s disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
  15. Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
  16. Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
  17. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  18. Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
  19. Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
  20. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
  21. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  22. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  23. Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112 (1990).
  24. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772 (2003).
  25. Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).
  26. Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).
  27. Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
  28. Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
  29. Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979 (2013).
  30. Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
  31. Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).
  32. Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).
  33. Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
  34. Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
  35. Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
  36. Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
  37. Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).

Play Video

Cite This Article
Bennett, S. A., Cobos, S. N., Meykler, M., Fallah, M., Rana, N., Chen, K., Torrente, M. P. Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models. J. Vis. Exp. (145), e59104, doi:10.3791/59104 (2019).

View Video