Denne protokollen skisserer eksperimentelle prosedyrer for å karakterisere genomet-omfattende endringer i nivåer av histone post-translasjonell endringer (PTM) oppstår i forbindelse med overuttrykte proteiner knyttet ALS og Parkinsons Saccharomyces cerevisiae modeller. Etter SDS side separasjon oppdages personlige histone PTM nivåer med endring-spesifikke antistoffer via Western blotting.
Nevrodegenerative sykdommer, slik som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sykdom (PD), føre til tap av hundretusener av liv hvert år. Effektive behandlingstilbud kunne stoppe sykdomsprogresjon mangler. Til tross for omfattende sekvensering i store pasientgrupper forbli fleste ALS og PD tilfeller uforklarlig av genetiske mutasjoner alene. Epigenetics mekanismer, som den post-translasjonell modifikasjonen av histone proteiner, kan være involvert i neurodegenerative sykdom etiologien og progresjon og føre til nye mål for farmasøytiske intervensjon. Pattedyr i vivo og in vitro modeller av ALS og PD er kostbare og ofte krever langvarig og arbeidskrevende eksperimentelle protokoller. Her skissere vi en praktisk, rask og kostnadseffektiv tilnærming til å bestemme genomet-omfattende endringer i histone endring nivåer ved hjelp av Saccharomyces cerevisiae som modellsystem. Denne protokollen gir omfattende etterforskning epigenetic endringer koblet til nevrodegenerative proteinopathies som bekrefte tidligere funn i annen modellsystemer samtidig betydelig utvide vår kunnskap om den neurodegenerative sykdom epigenome.
Nevrodegenerative sykdommer er ødeleggende sykdommer med liten eller ingen behandlingstilbud tilgjengelig. Blant disse er amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sykdom (PD) spesielt forferdelig. Ca 90% av ALS og PD anses sporadisk, skjer uten familiehistorie med sykdommen, mens de resterende kjøre i familier og er vanligvis knyttet til et bestemt gen mutasjon1,2. Interessant, er begge disse sykdommer assosiert med protein mislocalization og aggregering3,4,5,6. For eksempel smeltet i sarkomspesialitet (FUS) og TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) er RNA bindende proteiner som mislocalize til cytoplasma og samlet i ALS7,8,9,10, 11,12, mens α-synuclein er komponenten prinsippet av proteinaceous aggregater kalt Lewy organer i PD5,13,14,15.
Til tross for omfattende genomet hele association i store pasientgrupper forbli det overveldende flertallet av ALS og PD uforklarlig genetisk. Kan epigenetics spille en rolle i neurodegenerative sykdom? Epigenetics omfatter endringer i genuttrykk oppstår endringer i underliggende DNA sekvens16. En viktigste epigenetic mekanisme innebærer innlegg translasjonsforskning endringene (PTMs) av histone proteiner16. I eukaryote celler, er genetisk materiale tett pakket inn i chromatin. Lagerenheten chromatin er nucleosome, består av 146 base par DNA pakket rundt en histone octamer, består av fire histones (to eksemplarer hvert av histones H2A, H2B H3 og H4)17. Hver histone har en N-terminal hale som stikker ut av nucleosome og kan bli endret med tillegg av ulike kjemiske moieties, vanligvis på lysin og arginin rester18. Disse PTMs er dynamisk, som betyr at de enkelt kan legges og fjernet, og inkluderer grupper som acetylation og metylering fosforylering. PTMs kontrollere tilgjengeligheten av DNA til transcriptional maskiner, og dermed hjelpe kontroll gene expression18. For eksempel histone acetylation reduserer styrken på elektrostatisk samspillet mellom svært grunnleggende histone protein og negativt ladde DNA ryggraden, slik at genene pakket acetylated histones å være mer tilgjengelig og dermed svært uttrykt19. Flere nylig, bemerkelsesverdig biologisk spesifisiteten av bestemt histone PTMs og kombinasjoner har ført til histone koden hypotesen20,21 i som proteiner som skrive, slette og lese histone PTMs alle handle sammen slik modulere genuttrykk.
Gjær er et svært nyttig eksempel å studere neurodegeneration. Viktigere, er mange neuronal mobilnettet baner bevart fra gjær til mennesker22,23,24. Gjær recapitulate cytotoksisitet fenotyper og protein inkluderinger på overuttrykte Fu, TDP-43 eller α-synuclein,22,,23,,24,,25,,26. Faktisk har Saccharomyces cerevisiae modeller av ALS blitt brukt til å identifisere genetiske risikofaktorer i mennesker27. Videre gjær overexpressing menneskelige α-synuclein tillatt for karakterisering av Rsp5 nettverket som druggable mål å forbedre α-synuclein toksisitet i neurons28,29.
Her beskriver vi en protokoll utnytte Saccharomyces cerevisiae å oppdage genomet hele histone PTM filendringer tilknyttet nevrodegenerative proteinopathies (figur 1). Bruk av S. cerevisiae er meget attraktivt på grunn av dens lette av bruk, lave kostnader, og hastighet i forhold til andre in vitro og dyr modeller av neurodegeneration. Utnytte tidligere utviklet ALS og PD modeller22,23,25,26, vi har overexpressed menneskelige FUS TDP-43 og α-synuclein i gjær og avdekket distinkte histone PTM omveltningene i forbindelse med hver proteinopathy30. Protokollen som beskriver vi her kan gjennomføres på mindre enn to uker fra transformasjon til dataanalyse.
Protokollen beskrevet her gir en enkel, hensiktsmessig og kostnadseffektiv måte å kategorisere genomet hele histone PTM endringer korrelert med nevrodegenerative proteinopathies. Det finnes andre modeller av ALS og PD, som i vitro modeller humane cellelinjer og Trouble32, S. cerevisiae fortsatt attraktive på grunn av sin brukervennlighet. For eksempel gjær modeller krever ikke bruk av steril hette, eller de krever intensiv trening som går langs med celle kultur arbeid. Vider…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Royena Tanaz, Huda Yousuf og Sadiqa Taasen for teknisk hjelp. Vi er svært takknemlig til Prof James Shorter for sjenerøs levering av reagenser og intellektuell hjelp i utformingen av sukrose tuning eksperimenter. Gjær plasmider var en sjenerøs gave fra Prof Aaron Gitler (inkludert 303Gal-Fu; Addgene plasmider # 29614). Brooklyn College og den avanserte Science Research Center (CUNY) samt en NIH NINDS avansert postdoktor overgang Award (K22NS09131401) støttet M.P.T.
-His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |