Este protocolo describe procedimientos experimentales para caracterizar el genoma cambios en los niveles de modificaciones post-traduccionales de las histonas (PTM) que ocurre en relación con la sobreexpresión de proteínas relacionadas con la ELA y la enfermedad de Parkinson en Modelos de Saccharomyces cerevisiae . Después de la separación de SDS-PAGE, se detectan niveles PTM de las histonas individuales con anticuerpos específicos a la modificación mediante Western blot.
Enfermedades neurodegenerativas, como esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y enfermedad de Parkinson (EP), causan la pérdida de cientos de miles de vidas cada año. Se carecen de opciones de tratamiento efectivo capaces de detener la progresión de la enfermedad. A pesar de los esfuerzos extensos de la secuencia en grandes poblaciones de pacientes, la mayoría de los casos de ELA y PD siguen siendo inexplicable por mutaciones genéticas solo. Mecanismos de epigenética, como la modificación poste-de translación de proteínas histonas, pueden estar involucrados en la progresión y la etiología de la enfermedad neurodegenerativa y conducen a nuevas dianas de intervención farmacéutica. Mamíferos modelos in vivo e in vitro de ALS y PD son costosos y a menudo requieren protocolos experimentales prolongados y laboriosos. Aquí describiremos un enfoque práctico, rápido y rentable para determinar alteraciones del genoma en los niveles de modificación de las histonas mediante Saccharomyces cerevisiae como sistema modelo. Este protocolo permite investigaciones integrales sobre cambios epigenéticos conectadas proteinopatías neurodegenerativas que corroboran los resultados anteriores en sistemas modelo diferentes al mismo tiempo ampliar significativamente nuestro conocimiento de la epigenoma de enfermedades neurodegenerativas.
Las enfermedades neurodegenerativas son devastadoras enfermedades con poca o ninguna opción de tratamiento disponible. Entre estos, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y enfermedad de Parkinson (EP) son particularmente terrible. Aproximadamente el 90% de casos de ALS y PD se considera esporádico, que ocurre sin antecedentes familiares de la enfermedad, mientras que el resto de los casos se presentan en familias y generalmente está ligado a una mutación gen específico1,2. Curiosamente, dos de estas enfermedades se asocian con proteínas mislocalization y agregación3,4,5,6. Por ejemplo, fundido en el sarcoma (FUS) y proteína de unión a ADN TAR 43 (TDP-43) son proteínas de unión de la RNA que mislocalize al citoplasma y agregan en ALS7,8,9,10, 11,12, mientras que α-sinucleína es el componente del principio de agregados proteicos llamados cuerpos de Lewy en PD5,13,14,15.
A pesar de los esfuerzos de asociación amplia del genoma en grandes poblaciones de pacientes, la inmensa mayoría de casos de ALS y PD siendo inexplicable genéticamente. ¿Puede epigenética juega un papel en enfermedades neurodegenerativas? Epigenética comprende cambios en la expresión génica que ocurren sin cambios a subyacente DNA secuencia16. Un principal mecanismo epigenético implica las modificaciones post traslacionales (PTMs) de histona proteínas16. En células eucarióticas, el material genético es tapado en cromatina. La unidad básica de la cromatina es el nucleosoma, que consta de 146 pares de bases del ADN envuelto alrededor de un octámero de histonas, compuesto por cuatro pares de histonas (dos copias de cada de las histonas H2A, H2B, H3 y H4)17. Cada histona tiene una cola N-terminal que sobresale fuera del nucleosoma y puede ser modificada por la adición de grupos químicos diversos, generalmente en residuos de lisina y arginina18. Estos MPa es dinámicas, que significa que se pueden fácilmente agregar y quitaron e incluyen grupos como acetilación, metilación y fosforilación. PTMs controlan la accesibilidad de la DNA a la maquinaria transcripcional y así ayudar a control gene expresión18. Por ejemplo, la acetilación de histonas reduce la fuerza de la interacción electrostática entre la proteína histona muy básico y la columna vertebral carga negativa de ADN, permitiendo que los genes embalados por acetilado histonas sea más accesible y altamente expresó el19. Más recientemente, la notable especificidad biológica del PTMs histonas particulares y sus combinaciones ha conducido a la histona código hipótesis20,21 en que las proteínas que escribir, borrar y leer PTMs histonas actúan en concierto para modulan la expresión génica.
La levadura es un modelo muy útil para el estudio de neurodegeneración. Lo importante, se conservan muchos caminos celulares neuronales de la levadura a los seres humanos22,23,24. Levadura recapitular fenotipos citotoxicidad e inclusiones de proteína a sobreexpresión de FUS, TDP-43 o α-sinucleína22,23,24,25,26. De hecho, se han utilizado modelos de Saccharomyces cerevisiae de la ELA para identificar factores de riesgo genético en los seres humanos27. Además, la levadura overexpressing α-sinucleína humana permitida la caracterización de la red Rsp5 como objetivo druggable mejorar la toxicidad de la α-sinucleína en neuronas28,29.
Aquí, describimos un protocolo explotación de Saccharomyces cerevisiae para detectar genoma histona PTM cambios neurodegenerativos proteinopatías (figura 1). El uso de S. cerevisiae es muy atractivo debido a su facilidad de uso, bajo costo y la velocidad en comparación con otros modelos in vitro y animales de neurodegeneración. Aprovechamiento previamente desarrollado ELA y PD modelos22,23,25,26, hemos overexpressed humanos FUS, TDP-43 y α-sinucleína en levadura y descubierto distintos histona PTM cambios que ocurren en conexión con cada proteinopathy30. El protocolo que se describe aquí puede completarse en menos de dos semanas de la transformación para análisis de datos.
El protocolo descrito aquí proporciona una manera sencilla, conveniente y rentable de la categorización de cambios PTM genoma histona con neurodegenerativas proteinopatías. Mientras que hay otros modelos de ALS y PD, como en vitro líneas celulares humanas y murinas modelos32, restos de S. cerevisiae atractivos debido a su facilidad de uso. Por ejemplo, modelos de levadura no requieren el uso de una capucha estéril, ni necesitan el intensivo entrenamiento va junto con el trab…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Royena Tanaz, Huda Yousuf y Sadiqa Taasen ayuda técnica. Estamos muy agradecidos con el Prof. James Shorter por la generosa provisión de reactivos y ayuda intelectual en el diseño de los experimentos de afinación de sacarosa. Plásmidos de la levadura fueron una generosa donación de la Prof. Aaron Gitler (incluyendo 303Gal-FUS; Plásmido Addgene # 29614). Brooklyn College y la avanzada ciencia investigación centro (CUNY) así como un NIH NINDS avanzado Postdoctoral transición Premio (K22NS09131401) admite M.P.T.
-His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |