Detta protokoll beskriver experimentella procedurer för att karakterisera genome-wide förändringar i nivåerna av Histon post-translationella modifieringar (PTM) som förekommer i samband med överuttryck av proteiner associerade med ALS och Parkinsons sjukdom i Saccharomyces cerevisiae modeller. Efter SDS-PAGE separation upptäcks enskilda Histon PTM halter med modifiering-specifika antikroppar via Western blotting.
Neurodegenerativa sjukdomar, såsom amyotrofisk lateralskleros (ALS) och Parkinsons sjukdom (PD), orsaka förlusten av hundratusentals liv varje år. Effektiva behandlingsalternativ kunna stoppa sjukdomsprogression saknas. Trots de omfattande sekvensering ansträngningarna i stora patientgrupper förblir merparten av ALS och PD fall oförklarad av genetiska mutationer ensam. Epigenetik mekanismer, såsom posttranslationella modifieringen av Histon proteiner, kan vara inblandade i neurodegenerativa sjukdomen etiologi och progression och leda till nya mål för farmaceutiska intervention. Från däggdjur in vivo och in vitro-modeller av ALS och PD är kostsamma och kräver ofta långvarig och mödosam experimentella protokoll. Här beskriver vi en praktisk, snabb och kostnadseffektiv metod att fastställa genome-wide förändringar i Histon modifiering nivåer med hjälp av Saccharomyces cerevisiae som modellsystem. Detta protokoll möjliggör omfattande utredningar av epigenetiska förändringar ansluten till neurodegenerativa proteinopathies som styrker tidigare fynd i olika modellsystem samtidigt avsevärt utvidga vår kunskap om den neurodegenerativa sjukdomen epigenomet.
Neurodegenerativa sjukdomar är förödande sjukdomar med liten eller ingen behandlingsalternativ som är tillgängliga. Bland dessa är amyotrofisk lateralskleros (ALS) och Parkinsons sjukdom (PD) särskilt fruktansvärda. Cirka 90% av ALS och PD fall anses sporadisk, som inträffar utan hereditet för sjukdomen, medan de återstående fallen köras i familjer och allmänhet är kopplade till en specifik gen mutationen1,2. Intressant, är båda dessa sjukdomar associerade med protein mislocalization och aggregering3,4,5,6. Till exempel säkrade i sarkom (FUS) och tjära DNA-bindande protein 43 (TDP-43) är RNA-bindande proteiner som mislocalize till cytoplasman och aggregera i ALS7,8,9,10, 11,12, medan α-synuclein är komponenten principen av proteinhaltiga aggregat kallas Lewy organ i PD5,13,14,15.
Trots de omfattande genome-wide association ansträngningarna i stora patientgrupper förblir den överväldigande majoriteten av ALS och PD fall oförklarad genetiskt. Epigenetik kan spela en roll i neurodegenerativ sjukdom? Epigenetik består av förändringar i genuttryck som inträffar utan ändringar till underliggande DNA sekvens16. En huvudsakliga epigenetisk mekanism innebär de inlägget translationella modifieringar (PTMs) Histon proteiner16. I eukaryota celler, är genetiskt material tätt insvept i kromatin. Basenheten kromatin är den nukleosomens, som består av 146 baspar av DNA lindad runt en Histon octamer, består av fyra par histoner (två kopior varje av histoner H2A, H2B, H3 och H4)17. Varje Histon har en N-terminal svans som sticker ut ur nukleosomens och kan ändras genom tillägg av olika kemiska beståndsdelarna, oftast på lysin och arginin rester18. Dessa PTMs är dynamiska, vilket innebär att de kan enkelt läggas till och tas bort och inkluderar grupper såsom Acetylering, metylering och fosforylering. PTMs styr tillgängligheten av DNA på transkriptionell maskinen och därmed hjälpa kontroll gen uttryck18. Till exempel Histon Acetylering minskar styrkan av elektrostatiska samverkan mellan mycket grundläggande Histon proteinet och negativt laddade DNA ryggraden, så att de gener som packad av Acetylerade histoner vara mer tillgängliga och därmed mycket uttryckte19. Mer nyligen, anmärkningsvärda biologiska specificiteten av viss Histon PTMs och deras kombinationer har lett till Histon kod hypotes20,21 i vilka proteiner som skriva, radera och läsa Histon PTMs alla agera i samförstånd för att modulera genuttryck.
Jäst är en mycket användbar modell för att studera neurodegeneration. Ännu viktigare, bevaras många neuronala cellulära vägar från jäst till människor22,23,24. Jästen recapitulate cytotoxicitet fenotyper och protein inneslutningar vid överuttryck av FUS, TDP-43 eller α-synuclein22,23,24,25,26. I själva verket har Saccharomyces cerevisiae modeller av ALS använts för att identifiera genetiska riskfaktorer i människor27. Dessutom jäst överuttryck mänskliga α-synuclein tillåtet för karakterisering av Rsp5 nätverket som ett druggable mål att lindra α-synuclein toxicitet i nervceller28,29.
Här beskriver vi ett protokoll som utnyttjar Saccharomyces cerevisiae för att upptäcka genome-wide Histon PTM förändringar i samband med neurodegenerativa proteinopathies (figur 1). Användning av S. cerevisiae är mycket attraktiva på grund av dess användarvänlighet, låga kostnader, och hastighet jämfört med andra in vitro och djur modeller för neurodegeneration. Utnyttja tidigare utvecklat ALS och PD modeller22,23,25,26, vi har i ökad utsträckning mänskligt FUS, TDP-43 och α-synuclein i jäst och avtäckta distinkta Histon PTM förändringar som sker i i samband med varje proteinopathy30. Det protokoll som vi beskriver här kan utföras i mindre än två veckor från omvandling till dataanalys.
Protokollet beskrivs här ger ett okomplicerat, ändamålsenligt och kostnadseffektivt sätt att kategorisera genome-wide Histon PTM förändringar korrelerade med neurodegenerativa proteinopathies. Medan det finns andra modeller av ALS och PD, exempelvis in vitro- modeller mänskliga cellinjer och murint32, S. cerevisiae förblir attraktiva på grund av dess användarvänlighet. Till exempel jäst modeller kräver inte användning av en steril huva, inte heller behöver de den i…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Royena Tanaz, Huda Yousuf och Sadiqa Taasen för teknisk hjälp. Vi är mycket tacksamma mot Prof. James Shorter för generösa tillhandahållande av reagenser och intellektuella hjälp i utformningen av sackaros trim experiment. Jästen plasmider var en generös gåva från Prof. Aaron Gitler (inklusive 303Gal-FUS; Addgene plasmid # 29614). Brooklyn College och den avancerade Science Research Center (CUNY) samt en NIH NINDS avancerad postdoktorala övergången Award (K22NS09131401) stöds M.P.T.
-His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |