Summary
Här presenterar vi en metod för att förbereda organotypic skiva kulturer från mus lillhjärnan och myelinskidan färgning av immunhistokemi lämpar sig för att undersöka mekanismer myelinisering och remyelination i centrala nervsystemet.
Abstract
Myelin ligger i nervsystemet, en komplex membranstruktur som genereras av myelinating glial celler, som ensheathes axoner och underlättar snabb elektrisk överledning. Myelin förändring har visat sig uppstå vid olika neurologiska sjukdomar, där det är associerade med funktionella underskott. Här, vi ger en detaljerad beskrivning av en ex vivo modell bestående av mus organotypic cerebellär skivor, som kan hållas i kultur för flera veckor och ytterligare märkas för att visualisera myelin.
Introduction
Nervceller är starkt polariserade celler, som omfattar ett somato-dendritiska fack som får indata från sin omgivning och en axon som säkerställer generering och spridning av elektriska impulser till andra celler. Forförökningen och snabb leverans av information är nödvändigt för att nervsystemet ska fungera korrekt. Hos ryggradsdjur underlättas det genom myelinisering, vilket gör att öka axonal överledning hastighet1. Myelin är en specialiserad struktur som bildas av kompakterade lager av plasmamembranet som genereras av den myelinating glia, nämligen oligodendrocyter i det centrala nervsystemet (CNS) och Schwann celler i det perifera nervsystemet (PNS). Både i CNS och PNS, axoglial interaktioner kör bildandet av specialiserade axonal domäner: de noder av Ranvier och deras omgivande domäner, paranodes och juxtaparanodes2. Segmenten axonal isolerade av myelin, eller internoder, suppleant med de noder av Ranvier, som motsvarar till små unmyelinated domäner anrikade med spänningskänsliga natriumkanaler (Nav). Hög koncentration och snabb aktivering av Nav kanaler på de noder av Ranvier tillåta förnyelse av handlingspänningar, och tillsammans med de isolerande egenskaperna hos de myelin slidor, säkerställa en effektiv och snabb saltatorisk överledning av den nervimpuls längs axonet3.
Utöver sin roll i accelererande överledning hastighet nervimpuls, ger myelinating glia metabolt stöd till axon, bevara dess långsiktiga integritet och deltar i dess överlevnad4,5. Dessutom har det klargjorts i senaste åren att myelinet moduleras dynamiskt under hela livet och således förmodligen deltar i reglering och plasticitet i olika nervsystemets funktioner. Justeringar av distribution, antal, längd och tjocklek av myelin slidor längs axoner kan således representera ett nytt sätt att fint ställa olika nätverk6,7,8. Evolutionära förvärvet av myelin är därför en viktig process för sensoriska, motoriska och kognitiva funktioner och störning i samspelet mellan axoner och glia är alltmer anses bidra till den fosterskadande eller förvärvade neurologiska sjukdomar9.
Myelin sammansättning har karakteriserats, med den specifika funktionen av en hög andel av lipider (70%) jämfört med proteiner (30%) i motsats till andra cellulära membran10. Men till skillnad från myelin lipider är de flesta av myelin protein specifika för myelin, inklusive myelin grundläggande protein (MBP), proteolipid protein (PLP), 2', 3'-cykliska nukleotid 3'-fosfodiesteras (CNP), myelin-associerade glykoprotein (MAG), myelin-oligodendrocyte glykoprotein (MOG), PMP-22 och P010. Det finns utifrån dess lipid sammansättning, såsom Luxol snabbt blå11, Sudan svart B12, Baker's acid hematin metod13, samt silver färgning14olika histologiska metoder att färga myelin. Dock möjliggör dessa metoder inte alltid en tillräcklig kontrast och upplösning att visualisera enskilda fibrer. En alternativ metod att upptäcka myelin är genom immunhistokemi mot myelin proteiner. Olika antikroppar rikta myelin-specifika antigener med en hög specificitet och kan rutinmässigt användas att upptäcka myeliniserade strukturer. Antikropp-antigen interaktionen kan avslöjas ytterligare med hjälp av en sekundär antikropp kopplat till en fluorophore riktad mot den primär antikroppen och visualiseras med adekvat fluorescensmikroskopi. Här beskriver vi ett immunokemisk protokoll för att färga myelin på ex vivo cerebellär skivor, en modell som möjliggör en bra bevarandet av nervvävnad arkitekturen. Dessutom organisation och storlek av Purkinje celler (enda myeliniserade neuron av lillhjärnan) gör dem en klassisk modell för elektrofysiologiska studier och de är lika idealiska fast eller live-imaging studier.
Cerebellär skivor genereras från P9-P10 möss, en tid som motsvarar den tidig debuten av Purkinje celler myelinisering, en process som uppnås främst genom en vecka ex vivo (6-7 dagar in vitro DIV)15. Dessutom, denna modell är anpassad att undersöka demyeliniserande störningar såsom multipel skleros (MS), som en omfattande demyelinisering kan induceras i lillhjärnan skivor med hjälp av myelinotoxic-förening lysofosfatidylkolin (eller lysolecithin, LPC), som följs av en spontan remyelination16,17. Endogena remyelination sker från två dagar efter LPC borttagning från odlingssubstratet och är nästan komplett en vecka efterbehandling.
Slutförandet av detta protokoll tar ungefär tre veckor, inklusive en halvdag för cerebellär slice kulturer förberedelse, en vecka för att få fullt myeliniserade skivor, följt av 2 dagar att nå toppen av demyelinisering och ytterligare en vecka för sin fulla remyelination. Immunohistokemi kan dessutom fyllas i 2 dagar. Protokollet beskrivs här är anpassad till en standard kull 6 möss valpar och behöver anpassas om antalet djur som används för planerade experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt arbete som involverar djur efterkom institutionella principer och riktlinjer som fastställts av UPMC, INSERM och de franska och Europeiska gemenskapen rådets direktiv 86/609/EEG.
1. beredning av odlingsmedium och kultur infogar (Hands-on tid ≈ 10 – 15 min)
Obs: Utföra detta steg i flödet kultur huva under sterila förhållanden
- Förbereda 40 mL odlingsmedium, som består av 50% BME, 25% Hanks balanserad saltlösning (1 x), 25% Värmeinaktiverade häst serum, kompletterat med 2 mM glutamin derivat, 100 IE/mL penicillin-streptomycin och 4,5 mg/mL D-glukos. Justera pH till 7,4.
- Filter-sterilisera medium genom ett 0,22 μm filter anpassas på en 50 mL spruta av plast.
Obs: Odlingsmedium kan lagras vid 4 ° C i minst en vecka. - För en standard kull på 6 ungar, Använd två sterila 6-väl plattor. För varje plåt, ta bort locket och tillsätt 1 mL odlingsmedium per brunn.
- Placera en kultur infoga i varje enskild brunn genom att hålla plast kanten med steril pincett. Sätt på locket tillbaka på plattan.
Obs: Cerebellär skivor som samlats in från en pup (6-8) kan skickas på två membran (3-4 cerebellär skivor per membran infoga).
2. beredning av dissektion Medium (Hands-on tid ≈ 5 min)
Obs: Utföra detta steg i flödet kultur huva under sterila förhållanden
- Bereda 100 mL dissektion medium, som består av Geys balanserad saltlösning kompletteras med 4,5 mg/mL D-glukos och 1 x penicillin – streptomycin (100 IE/mL).
- Filter-sterilisera medium genom ett 0,22 μm Filterenhet.
Obs: Dissektion mediet kan lagras vid 4 ° C i minst en månad. - Tillsätt 5 mL kall dissektion medium i 60 mm cell kultur rätter. Förbereda en 60 mm cell kultur maträtt för varje valp att vara dissekeras.
- Hålla de dissektion rätterna på is fram till användning.
3. beredning av dissektion material (Hands-on tid ≈ 15 min)
- Rengöra bänken med 100% etanol.
- Sterilisera alla dissektion verktyg, ett rakblad och vävnad chopper's plast plattform med 100% etanol.
- Fixa rakbladet och plast plattformen på vävnad helikoptern och justera tjockleken skärning till 300 µm.
- Kontrollera alla etanol har avdunstat innan dissektion.
4. CerebellumDissection och avsnitten förberedelser (Hands-on tid ≈ 15 – 20 min per djur)
- Placera en av de 60 mm cell kultur rätter som innehåller iskall dissektion mediet i binokulära Mikroskop och ta bort den övre plattan.
- Svabba huvud päls med 70% etanol (noga undvika att vidröra ögonen på djur) och halshugga djuret använder stora vass sax, enligt förfarandet som godkända.
Obs: Cerebellär skivor genereras från P9-P10 möss utan särskilda kön eller stam bias. - Använd liten sax för att klippa huden längs mittlinjen av huvudet från halsen och går upp till mus nosen.
- Vik tillbaka huden ventralt under huvudet för att hålla huvudet och exponera skallen, och nyp ihop huden mellan fingrarnas två veck.
- Infoga små saxen försiktigt i foramen magnum och skär skallen genom att göra en lateral incision mot sidan och sedan klippa runt huvudet skallen. Håll spetsen på saxen som parallell och nära skallen som möjligt medan skära, att undvika att skada hjärnvävnaden.
- Hämta den dorsala delen av skallen med böter-rak peang. Samtidigt försiktigt lyfta den dorsala delen av skallen, skär vidhängande hjärnhinnorna (genomskinlig bevattnade membranet som omger hjärnvävnad) om behövs med liten sax för att undvika att skada hjärnvävnaden.
- Försiktigt införa böter-rak peang (eller alternativt använda en spatel) mellan ventrala skallen och hjärnan, försiktigt fäll ut hjärnan och skär optik och trigeminal nerver med liten sax.
- Hjälper hjärnan att släppa självtryck i 60 mm cell kultur skålen som innehåller iskall dissektion medium genom att vrida huvudet upp och ner precis ovanför skålen och släppa de sista sammanväxningar med liten sax om det behövs.
- Med fin pincett, orientera hjärnan med ryggsidan inför forskaren och den ventral sidan liggande på botten av skålen.
- Under det binokulära mikroskopet, använda böter-straight tången att immobilisera hjärnan på framhjärnan sida och Undvik att röra hindbrain, som det kunde skadas. Separera hindbrain från resten av hjärnan (fore- och mellanhjärnan, se Schematisk figur 1Aa), med hjälp av fine-rak peang. För att separera lillhjärnan från resten av bakhjärnan, Använd fina tången för att skära de cerebellär stjälkar under lillhjärnan (se Schematisk på figur 1Aa').
- När lillhjärnan är isolerade, noggrant riva bort hjärnhinnor med böter-rak peang (se Schematisk på figur 1Aa').
- Håll lillhjärnan försiktigt med fina böjda pincetten och placera den med ryggsidan upp på plast plattformen vinkelrätt till chopper rakbladet (se Schematisk figur 1Bb).
- Sug ut eventuellt överskott av dissektion medium runt lillhjärnan med hjälp av en steril tunn-end pipettspetsen anpassas på en 1 mL Pipettera (se Schematisk figur 1Bb).
- Se till att lillhjärnan ligger plant, men är inte sträckt, en gång placeras på plattformen för att få optimal sagittala skivor under snittning (se Schematisk på figur 1Bb).
- Skiva 300 μm tjocka sagittala delar av lillhjärnan med vävnad helikoptern (se Schematisk på figur 1Bb'). Den kraft och hastighet av bladet måste optimeras på plats.
- Försiktigt lägga en droppe av dissektion medium på skivad lillhjärnan. Använda en wide-bore pipettspetsen placeras på 1 mL pipett, långsamt aspirera skivad lillhjärnan och överföra det tillbaka till 60 mm cell kultur skålen som innehåller iskall dissektion medium (se Schematisk på figur 1Bb'').
- Ren vävnad chopper's plast plattform med 100% etanol mellan varje lillhjärnan skivning. Låt etanolen avdunsta innan du lägger nästa lillhjärnan på plattformen.
- Använda två böter-rak peang (eller alternativt Titan nålar) för att separera enskilda sektorer och välj 6-8 skivor från vermis (se Schematisk figur 1 ml och 1 ml ').
- Ta en 6-well platta med kultur skär och överföra upp till 4 valda skivor på en kultur infoga tillsammans med några dissektion medium, använder en wide-bore pipettspetsen anpassas på 1 mL pipett (se Schematisk på figur 1 ml ').
- Placera skivor i mitten kultur skäret med dissektion medium eller pincett att trycka och dra dem försiktigt i rätt läge, för att undvika dem för att vara i kontakt med varandra (se Schematisk på figur 1 ml ').
- Ta bort eventuellt överskott av dissektion medium runt skivor med hjälp av en tunn-end pipettspetsen. Se till att skivorna ligga platt på membranet (se Schematisk på figur 1 ml ').
- Placera 6-väl plattan i inkubatorn omedelbart efter att ha lagt skivor på membranet.
5. skivor kultur och demyelinisering (Hands-on tid ≈ 15 – 20 min)
Obs: Utföra detta steg i flödet kultur huva under sterila förhållanden
- Ersätta odlingssubstratet med 1 mL per brunn som pre värmde och buffrad färskt odlingssubstrat varje 3 dagar efter slice förberedelse.
- För demyelinisering, ta bort alla odlingsmedium nedan kulturen infogas efter 6 dagar in vitro-(DIV) och ersätta den med 1 mL per brunn som pre värmde färskt odlingssubstrat som innehåller 0,5 mg/mL LPC. Inkubera i 15-17 h vid 37 ° C, 5% CO2.
- Efter inkubation, tvätta skär genom att placera dem i en 25 mm petriskål innehållande 1 mL före värmde odlingsmedium.
Obs: Mellanläggen bör vara i kontakt med mediet, men omfattas inte av den. - Omedelbart överföra kultur skären i en ny 6-well platta som innehåller färska pre värmde odlingsmedium.
- Byt ut odlingssubstratet med 1 mL som pre värmde färskt odlingssubstrat varje 2-3 dagar tills skivor fixering.
6. immunhistokemi (praktiska tid ≈ 1:30 – 2 h)
Obs: Utför steg 6.1. 6.3. under ett dragskåp. Undvika exposition till paraformaldehyd (PFA) och hänvisa till den produkten säkerhetsdatablad för adekvat manipulation och skydd.
- Använd tången hiss varje kultur skär genom att hålla plast kanten och ta bort odlingssubstratet under membranet infogar från varje brunn.
- Fixa cerebellär skivor för 30 min genom att lägga till 2 mL 4% PFA 1 x PBS pH 7,4 på membran skären.
Obs: Tidpunkten räntebindningstid beror på scenen av myelinisering studerade: 4 DIV motsvarar uppkomsten av myelinisering, 7 DIV till fullt myeliniserade skivor. Vid LPC behandling motsvarar 9 DIV toppen av demyelinisering, 11 DIV till uppkomsten av remyelination och 14 DIV till fullt remyelinated skivor. - Tvätta skären med skivor tre gånger med 2 mL 1 x PBS i 10 min.
- Separata skivor från membran skären i binokulärt Mikroskop med en 25 x till 30 x förstoring, genom att försiktigt trycka dem med en skalpell eller en borste. Alternativt, för att undvika risken för skadliga skivor medan du lossar dem från membranet, använda en skalpell skära membranet med skivor fortfarande ansluten.
- Överföra flytande skivor i brunnar 4-well platta som innehåller 1 x PBS, med en borste.
- Aspirera PBS från varje brunn och inkubera sektorerna i nedkylda 100% etanol vid-20 ° C i 15 till 20 min. Detta steg underlättar antikropp penetration i myeliniserade fibrer.
- Aspirera 100% etanol och tvätta en gång kort med 1 x PBS, sedan två gånger i 1 x PBS under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera PBS och inkubera skivor för 30 till 45 min med en lösning innehållande 1 x PBS, 5% NGS, 0,3% icke-joniskt rengöringsmedel vid rumstemperatur att blockera icke-specifik antikropp fixering platser.
- Aspirera blockerande lösningen. Ingen tvätt är nödvändigt.
- Inkubera skivor över natten med de primära antikroppar utspätt i blockering lösning vid 4 ° C. För att visualisera myelin på cerebellär organotypic skivor, använda MBP (kyckling, 1/150 eller mus IGg2b, Smi99, 1/200) eller PLP (råtta, Hybridomteknik, 1/5 till 1/10) antikroppar.
Obs: För att avslöja ett uttryck för mer än en antigen i samma segment, utföra en dubbel- eller trippel färgning förfarande (se figur 1 som exempel). För att utföra ruvning samtidigt, säkerställa primära antikroppar produceras i olika arter. Använd sedan deras motsvarande sekundära antikroppar kopplat till olika fluorophores (se Tabell av material för nodal och paranodal markör18 antikroppar). - Den andra dagen, tvätta skivor tre gånger i 1 x PBS i 10 min.
- Inkubera under 3h med de sekundära antikroppar utspätt i blockering lösning (1/500 utspädning) i mörker vid rumstemperatur.
Obs: Optimering av antikropp utspädning och inkubation tid kan krävas när du använder andra antikroppar än de som beskrivs här. - Tvätta skivor tre gånger i 1 x PBS i 10 min i mörker.
- Under ett binokulärt Mikroskop, montera skivor på en glasskiva. Placera 100 µL av 1 x PBS i bilden och överföra skivor i PBS med en borste. Veckla upp skivor om det behövs och platta till dem på bilden. Ta bort eventuellt överskott av PBS. Om immunolabeling utförs med skivor fortfarande kopplad till membran, montera med skivor inför täckglaset, med membranet i glas-bilden.
- Placera en droppe monteringsmedium direkt på täckglaset och försiktigt Täck brödskivorna. Monterade diabilder kan lagras i flera månader vid 4 ° C i mörker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exempel på representativa myelin immunostainings i organotypic cerebellär skivor erhållits från P9-P10 C57black6 vildtyp (WT) (figur 2A), samt PLP-GFP transgena möss (figur 2B), tillsammans med Purkinje celler färgning. Cerebellär skivor myelinate från den vita substansen spårar regionen skivor mot periferin av folia och myelinisering Purkinje celler är mestadels uppnås efter 6 till 7 DIV. På 7 DIV är induktion av en full demyelinisering möjligt genom LPC behandling (figur 2Ci-ii). Följande demyelinisering, skivor spontant remyelinate och är fullt remyelinated 6-7 dagar efter toppen av demyelinisering (figur 2Ciii).
Figur 1: Illustration av lillhjärnan skivor generation. Dissektion är uppdelad i tre steg. (A), lillhjärnan är isolerade och hjärnhinnorna bort (steg 4.10 och 4.11). (B), lillhjärnan överförs sedan till chopper-plattformen och skivade (steg 4.12 till 4.16). (C) Slutligen skivor är isolerade från vermis och placeras på ett membran infoga. Dissektion mediet överförs med skivor avlägsnas och 6-väl plattan placeras i inkubatorn (steg 4.18 och 4.22). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på myeliniserade cerebellär skivor odlade ex vivo. Bildstaplar (med ortogonal projektion) erhölls genom en upprätt confocal Mikroskop efter gratis flytande immunolabeling och platt montering som beskrivs i protokollet. Skivor är kraftfullt myeliniserade på 11 DIV (A, PLP; B, GFP i grönt) och axonal domäner är monterade som observerats i vivo med noder av Ranvier anrikade med spänningskänsliga natriumkanaler (Nav, i rött) som flankerad av paranodal axoglial junction domänen (Cecilia, i vitt) i C57black6 WT (A ) samt PLP-GFP (B) transgena möss skivor. (C), lillhjärnan cortex arkitekturen är bevarat i odlade skivor, som observerats på cerebellär skivor från PLP-GFP möss. (jag) Purkinje celler axon (Calbindin, Calb, i blått) är kraftfullt myeliniserade (GFP, i grönt) efter en vecka i kultur. (ii), LPC behandling fullt demyelinates skivor, som remyelinate spontant och är fullt remyelinated 6 dagar post demyelinisering (iii, 14 DIV). Skala barer = 20 µm (A, B). 100 µm (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här, vi detalj ett protokoll för att generera en ex vivo modell motsvarar mus cerebellär organotypic skiva kulturer, anpassat från tidigare publicerade metoder15,16,19 och efterföljande myelin immunfärgning av dessa preparat. Denna strategi erbjuder möjligheten att visualisera myelin komponenter med en hög upplösning i både friska och patologiska stater.
Cerebellär organotypic skiva kulturer tas från 10 dagar gamla möss är en väl etablerad experimentell modell att undersöka molekylära och cellulära mekanismer som ligger bakom myelinisering och remyelination processer, eftersom det tillåter för att reproducera mest anatomiska och funktionella egenskaper av motsvarande vävnad Invivo inklusive inte bara bevarandet av en väldefinierad cellulära arkitektur men också den mognad tidslinje17. Dessutom cerebellär skivor har en bevarad arkitektoniska organisation efter två veckor in vitro- (figur 1 c). Transgena PLP-GFP stammen är ett alternativ, att låta, i synnerhet för att iaktta myelinisering status under en fluorescerande binokulära Mikroskop på levande skivor, vilket är särskilt praktiskt för demyelinisering-remyelination studier (figur 1 c ).
Dessa preparat är av särskilt intresse som en snabb metod att bedöma myelinisering klassar med utvecklade automatiska kvantifiering, inklusive western-blot analys20, CNPase assay16 eller kvantifiering av PLP/Calbindin (eller MBP / Calbindin) färgning17,21, som alltså representerar en hög genomströmning-system som möjliggör provning av farmakologiska läkemedel i demyeliniserande störningar22,23.
En av de viktigaste kritiska frågorna när du utför dessa experiment kan vara relaterat till kvaliteten på cerebellär skivor. För det första är åldern av möss av betydelse för cerebellär organotypic skiva kulturer. Purkinje celler, för endast myeliniserade neuronen i lillhjärnan kulturer, överlevnad äventyras om kulturer är beredda från P2 till P7 gnagare eller med givare äldre än P1317. Mer allmänt är organotypic hjärnan slice kulturer svårt att få från vuxna djur. För det andra, varaktigheten av vävnad bearbetning under dissektion är kritisk, som en dissektion steg med mer än 15-20 minuter per djur leder till en nedgång i överlevnaden av skivor. Dessutom när du väljer skivor att vara odlade, är det bäst att undvika att använda de från vardera änden av lillhjärnan på grund av dålig överlevnad av nervceller och resulterande bristen på myeliniserade fibrer.
Andra parametrar såsom stabilitet temperatur och CO2 -koncentration medan i kultur är avgörande faktorer för slice hälsa. Slutligen påverkas kvaliteten på skivor av sammansättningen av häst serum, som inte kan kontrolleras av användarna. Därför rekommenderas det starkt att testa flera partier av serum.
För att erhålla en adekvat märkning, är vävnad fixering ett viktigt steg. För att underlätta penetration av antikropparna att nå myelin antigener, eftersom myelinet är en mycket kompakt struktur, rekommenderas skivor före behandling med absolut etanol efter fixering. En liknande protokoll av färgning kan ytterligare tillämpas på i vivo fasta vävnader, även om Triton koncentration kan behöva anpassas till tjockleken på vibratome eller kryostaten genereras i vivo sektioner. Tillgången till icke-kommersiella antikroppar bör också övervägas. Förbereda skivor från transgena möss som PLP-GFP24 eller CNP-GFP25 utgör därmed ett alternativ till visualisera processer myelin och oligodendrocyter.
Förutom de immunokemisk metoder som beskrivs i detta protokoll, används ofta andra metoder att studera myelin arkitektur. Det finns också kompletterande tekniker för att undersöka myelin ultrastruktur, med elektronmikroskopi som den gyllene standard26. Finns andra tekniker, såsom etikett-fria metoder inklusive optisk koherens tomografi27,28, Raman scattering28,29, tredje-harmoniska generation30 eller spektrala confocal reflektans mikroskopi31; dessa metoder har den extra fördelen att möjliggöra observation av dynamiska cellulära processer. Men några av dessa tekniker är komplexa och kräver ytterligare state-of-the-art mikroskopi uppställningar. Av dessa skäl förblir myelin studie av immunofluorescens märkning en standardmetod för att undersöka myelinisering och dess defekter i olika utvecklings eller förvärvade sjukdomar och deras modeller, samt för att bedöma potentialen för framtida terapeutiska behandlingar. Det kan vidare användas för att studera myelinisering i flera sammanhang, såsom lärande och plasticitet, som åldrande, depression eller autism där myelinet är kända för att vara förändrad32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har konkurrerande intressen eller motstridiga intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Sean Freeman, Dr Nathalie Sol-Foulon och Dr Thomas Roux för värdefulla synpunkter på manuskriptet. Detta arbete finansierades av INSERM, ICM, ARSEP bidrag R13123DD, ANR R17127DD (till e.Kr.) och FRM fellowship, SPF20110421435 (till e.Kr.), FDT20170437332 (till MT). Vi tackar CELIS cell kultur anläggningen och icm. Quant imaging plattform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60 mm and 100 mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 mm x 26 mm x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M. Molecular dissection of the myelinated axon. Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
