Summary
כאן אנו מציגים שיטה להכין organotypic פרוסה תרבויות מן המוח הקטן העכבר מיאלין, צביעת על-ידי אימונוהיסטוכימיה מתאים לחקור מנגנונים של myelination ו- remyelination במערכת העצבים המרכזית.
Abstract
המיאלין במערכת העצבים, הוא מבנה הממברנה מורכבות שנוצרו על-ידי myelinating גליה תאים, אשר אקסונים ensheathes ומקל מהר וההולכה. שינוי המיאלין הוכח להופיע במחלות נוירולוגיות שונות, איפה היא מזוהה עם גירעונות פונקציונלי. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של אקסית vivo דגם המורכב העכבר organotypic אסטרוציטומה פרוסות, אשר יכול להישמר בתרבות במשך מספר שבועות, עוד יותר להיקרא להמחיש מיאלין.
Introduction
הנוירונים הם תאים מאוד מקוטב, המהווים תא somato-דנדריטים שמקבל קלט מן הסביבה של האקסון המבטיחה את יצירתם והובלתם של דחפים חשמליים לתאים אחרים. התפשטות מהירה ומדויקת של מידע חיוני לתפקוד תקין של מערכת העצבים. גולגולת, זה בהנחייתם של myelination, אשר מאפשר הגדלת מהירות הולכה עצב1. המיאלין הוא מבנה מיוחדים הנוצרת על-ידי שכבות הדחוס של קרום פלזמה שנוצר על ידי myelinating עכשיו, דונלד, כלומר oligodendrocytes להפוך במערכת העצבים המרכזית (CNS) ותאי שוואן במערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית). גם מערכת העצבים וגם את מערכת העצבים ההיקפית, axoglial אינטראקציות לנהוג היווצרות של תחומים עצב מיוחדים: את Ranvier של צמתי ו שלהם שמסביב תחומים, paranodes ו juxtaparanodes2. הקטעים עצב מבודדים על ידי המיאלין, או פרקי הגבעולים, לסירוגין עם Ranvier של צמתים, המקבילים לתחומים unmyelinated קטן מועשר בערוצים ממותגת מתח נתרן (Nav). ריכוז גבוה של הפעלה מהירה של ערוציv נה Ranvier של צמתי לאפשר לרגנרציה של פוטנציאל פעולה, ויחד עם המאפיינים בידוד של עטיפות המיאלין, להבטיח את הולכה saltatory מהיר ויעיל של הדחף העצבי לאורך האקסון3.
בנוסף לתפקידה ב מאיצה את מהירות הולכה של הדחף העצבי, עכשיו, דונלד myelinating מספק תמיכה מטבולית הדנדריטי לאקסון, שמירה על שלמותה לטווח ארוך והשתתפות שלה4,של הישרדות5. יתר על כן, כבר ברור בבשנים האחרונות שהמיאלין הזה הוא מווסת באופן דינמי לאורך החיים, ולכן יש להניח המשתתפים תקנה הפלסטיות של פונקציות שונות של מערכת העצבים. התאמות של ההתפלגות, מספר, האורך, עובי של עטיפות המיאלין לאורך אקסונים ובכך עשוי לייצג דרך מקורית לכוון דק שונים רשתות6,7,8. לכן, רכישת המיאלין האבולוציוני הוא תהליך מפתח עבור פונקציות חושית, מוטורי, קוגניטיבי, ההפרעות של אינטראקציה בין אקסונים עכשיו, דונלד יותר ויותר נחשב לתרום התפתחותי או רכשה נוירולוגיות מחלות9.
קומפוזיציה מיאלין מלווה, עם תכונה ספציפית של שיעור גבוה של שומנים (70%) בהשוואה חלבונים (30%) בניגוד ממברנות הסלולר10. עם זאת, בניגוד המיאלין שומנים, רוב החלבונים המיאלין הן ספציפיות המיאלין, כולל חלבון המיאלין הבסיסי (MBP), חלבון proteolipid (פיפ), 2', נוקלאוטיד 3'-מחזורית 3'-phosphodiesterase (CNP), הקשורים המיאלין גליקופרוטאין (מג), מיאלין-אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א), PMP-22, P010. שיטות שונות היסטולוגית כתם המיאלין קיים המבוסס על הרכב השומנים שלה, כגון Luxol מהר כחול11, סודאן שחור B12, של בייקר חומצה ותקיזו את דמה שיטת13, וכן כסף מכתים14. למרות זאת, גישות אלה אינם תמיד מאפשרים עבור ניגודיות הולמת וגם רזולוציה להמחיש סיבים בודדים. גישה חלופית לזהות המיאלין היא דרך אימונוהיסטוכימיה נגד חלבונים מיאלין. נוגדנים שונים יעד ספציפי המיאלין אנטיגנים עם ירידה לפרטים גבוה והוא יכול לשמש באופן שגרתי כדי לזהות מבנים סיבי העצב. האינטראקציה נוגדן-אנטיגן אשר ניתן עוד יותר לגילוי באמצעות נוגדנים משניים מצמידים fluorophore נגד נוגדן ראשוני, דמיינו פלורסצנטיות נאותה מיקרוסקופ. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול immunochemical כתם מיאלין ב- ex-vivo אסטרוציטומה פרוסות, מודל המאפשר לשימור טוב הארכיטקטורה רקמות עצבים. בנוסף, הארגון ואת גודל של תאי Purkinje (הנוירון סיבי העצב הבלעדית של הצרבלום) לגרום להם מודל קלאסי ללימודי אלקטרופיזיולוגיות, הם אידיאליים באופן דומה לביצוע מחקרים קבוע או הדמיה לחיות.
הפרוסות אסטרוציטומה נוצרים מן P9-P10 עכברים, זמן המתאים תחילת מוקדם Purkinje תא myelination, תהליך זה מושגת בעיקר בשבוע אחד ex-vivo (6-7 ימים במבחנה, DIV)15. יתר על כן, המודל הזה הוא מותאם כדי לחקור את המיאלין הפרעות כגון טרשת נפוצה (MS), כפי demyelination נרחבת יכולה להיגרם אסטרוציטומה פרוסות באמצעות myelinotoxic המורכב lysophosphatidylcholine (או lysolecithin, LPC), אשר ואחריו16,remyelination ספונטנית17. Remyelination אנדוגני מתקיים בין יומיים לאחר הסרת LPC של המדיום תרבות והוא כמעט מוחלט של שבוע לאחר הטיפול.
השלמתו של פרוטוקול זה לוקח 3 שבועות שנהנתם, כולל חצי יום הכנה תרבויות פרוסה אסטרוציטומה, שבוע כדי לקבל פרוסות מלא סיבי העצב, ואחריו 2 ימים כדי להגיע לשיא של demyelination, עוד שבוע עבור שלהם מלא remyelination. בנוסף, ניתן להשלים אימונוהיסטוכימיה 2 ימים. הפרוטוקול המתואר כאן מותאם בהמלטה סטנדרטי של 6 הגורים עכברים וצריך להתאים בנוגע למספר בעלי החיים שבהם משתמשים עבור הניסוי המתוכנן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העבודה המערבות בעלי חיים תאמו מדיניות מוסדית המנחים שקבע את UPMC, INSERM ואת צרפתית הקהילה האירופית םיאנתל 86/609/EEC.
1. הכנת בינוני תרבות ותרבות מוסיף (תרגולים זמן ≈ 10-15 דקות)
הערה: לבצע שלב זה בשכונה תרבות זרימה בתנאים סטריליים
- להכין 40 מ של תרבות בינוני, אשר מורכב של 50% BME, של 25% האנק מאוזנת תמיסת מלח (1 x), 25% חום-לא פעיל סוס סרום, בתוספת נגזרות גלוטמין 2 מ מ, 100 IU/mL פניצילין-סטרפטומיצין, 4.5 מ"ג/מ"ל D-גלוקוז. להתאים את ה-pH ל 7.4.
- מסנן-לעקר את המדיום דרך מסנן μm 0.22 הותאם על מזרק פלסטיק 50 מל.
הערה: תרבות בינוני ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות שבוע. - לשימוש רגיל המליטה גורים 6, שתי צלחות 6-ובכן סטרילי. על כל צלחת, להסיר את המכסה ומוסיפים 1 מ"ל של תרבות בינוני לכל טוב.
- הוספה תרבות המקום לבאר כל בודדים על-ידי החזקת הקצה פלסטיק עם מלקחיים סטרילי. שים את המכסה בחזרה על הצלחת.
הערה: הפרוסות אסטרוציטומה שנאסף גור אחד (6-8) יכול ישוגר על שתי ממברנות (3-4 פרוסות אסטרוציטומה לכל ממברנה הוספה).
2. הכנת לנתיחה בינוני (תרגולים זמן ≈ 5 דקות)
הערה: לבצע שלב זה בשכונה תרבות זרימה בתנאים סטריליים
- הכן 100 מ של דיסקציה בינוני, אשר מורכב של Gey מאוזנת תמיסת מלח בתוספת פניצילין D-גלוקוז ו- 1 x 4.5 מ"ג/מ"ל – סטרפטומיצין (100 IU/mL כל).
- מסנן-המדיום דרך יחידת מסנן μm 0.22 לחטא.
הערה: ניתן לאחסן המדיום לנתיחה ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש לפחות. - הוסף 5 מ של ניתוח קר בינונית 60 מ מ תא תרבות מנות. להכין צלחת תרבות תא 60 מ"מ אחת עבור כל pup ניסויים.
- לשמור את הכלים לנתיחה על הקרח עד השימוש.
3. הכנת חומר לנתיחה (≈ הידיים על הזמן 15 דקות)
- לנקות את הספסל עם 100% אתנול.
- לעקר כל כלי חיתוך, סכין גילוח, פלטפורמה המסוק רקמות פלסטיק עם 100% אתנול.
- לתקן את להתגלח, פלטפורמת פלסטיק על המסוק רקמות ולהתאים את עובי חיתוך מיקרומטר 300.
- ודא כי כל האתנול התאדו לפני שמתחילים את הקרע.
4. CerebellumDissection והכנות מקטעים (≈ זמן הידיים על 15-20 דקות לכל בעל חיים)
- הציבו אחד של 60 מ מ תא תרבות מאכלים המכילים המדיום לנתיחה כקרח תחת המיקרוסקופ המשקפת ולהסיר את הפלטה.
- לנקות את הראש הפרווה עם 70% אתנול (בזהירות הימנעות נוגע בעיניים של בעל החיים), לערוף את החיה באמצעות מספריים חדות גדול, על פי הנוהל שאושר.
הערה: הפרוסות אסטרוציטומה נוצרים של עכברים P9-P10 ללא מין ספציפי או זן הטיה. - השתמש מספריים קטנות כדי לחתוך את העור לאורך הקו האמצעי של הראש מתחיל מהצוואר, עומד המחסום העכבר.
- . תחזיק את הראש ולחשוף את הגולגולת, מקפלים בחזרה את העור ventrally מתחת לראש, צבוט שני קפלי העור בין אצבעותיו.
- הכנס בעדינות את המספריים קטן מאגנום נקב וחותכים את הגולגולת על-ידי הפיכת אחד לרוחב החתך לכיוון הצד ולאחר מכן לחתוך סביב הגולגולת ראש. שמור את קצה המספריים כמו במקביל וקרוב הגולגולת ככל האפשר תוך כדי חיתוך, כדי למנוע נזק לרקמת המוח.
- אחזר את החלק הגבי של הגולגולת באמצעות מלקחיים בסדר-ישר. כשאתם מרימים בזהירות את החלק הגבי של הגולגולת, לחתוך את קרומי המוח adhering (שקוף שלחין ממברנה מסביב לרקמת המוח) במידת הצורך עם מספריים קטנות כדי למנוע נזק לרקמת המוח.
- בזהירות להציג בסדר-ישר מלקחיים (או לחלופין להשתמש במרית) בין הגולגולת הגחוני של המוח, בעדינות להעיף המוח, לחתוך את הראייה ואת העצבים המשולש עם מספריים קטנות.
- לעזור למוח לשחרר על-ידי כוח המשיכה לתוך המנה תרבות תא 60 מ מ המכיל ניתוח קר כקרח בינוני על-ידי הפעלת הראש הפוך בדיוק מעל המנה ולשחרר את ההדבקויות האחרון עם מספריים קטנות, במידת הצורך.
- בעזרת מלקחיים בסדר, להתמצא המוח עם הצד הגבי בפני החוקר, הצד הבטני שוכב על החלק התחתון של המנה.
- תחת המיקרוסקופ דו-עינית, השתמש המלקחיים בסדר-ישר כדי לשתק את המוח על הצד הקדמי ואת להימנע מלגעת hindbrain את, כמו זה יכול להיפגע. להפריד את hindbrain משאר חלקי המוח (קידמה - ו המוח האמצעי, ראה מפרטים טכניים על דמות 1Aa), באמצעות מלקחיים בסדר-ישר. להפרדת המוח הקטן משאר hindbrain, השימוש המלקחיים בסדר לחתוך את peduncles אסטרוציטומה מתחת המוח הקטן (ראה מפרטים טכניים על איור 1Aa').
- ברגע המוח הקטן הוא מבודד, בזהירות תקרע מעליך קרומי המוח באמצעות מלקחיים בסדר-ישר (ראה מפרטים טכניים על איור 1Aa').
- החזק את המוח הקטן בעדינות עם המלקחיים מעוקל בסדר ומניחים אותו עם הצד הגבי למעלה על הפלטפורמה פלסטיק בניצב המסוק גילוח (ראה מפרטים טכניים על דמות 1Bb).
- תשאף כל עודף של דיסקציה בינונית סביב המוח הקטן באמצעות טיפ פיפטה דק-end סטרילי הותאם על 1 מ"ל פיפטה (ראה מפרטים טכניים על דמות 1Bb).
- ודא כי המוח הקטן מניח שטוח, אבל היא לא מתוח, מהרגע ששמים על הפלטפורמה כדי לקבל פרוסות הסאגיטלי אופטימלית במהלך אופטים (ראה סכמטית על איור 1Bb).
- פורסים μm בעובי 300 הסאגיטלי מקטעים של הצרבלום עם המסוק רקמות (ראה מפרטים טכניים על איור 1Bb'). הכוח ואת המהירות של הלהב חייב להיות מותאם על האתר.
- בעדינות להוסיף טיפה של דיסקציה בינוני על גבי פרוסות המוח הקטן. באמצעות טיפ רחב נשא פיפטה ממוקמת על פיפטה 1 מ"ל, לאט תשאף המוח הקטן הפרוס ולהעביר אותו בחזרה לתוך המנה תרבות תא 60 מ מ המכיל ניתוח קר כקרח בינוני (ראה מפרטים טכניים על איור 1Bb ').
- לנקות פלטפורמה רקמות. המסוק פלסטיק עם 100% אתנול בין כל המוח הקטן עם פרוסות. תן האתנול מתאדים לפני הצבת הקטן הבא על הפלטפורמה.
- להשתמש שני פיין-ישר מלקחיים (או לחלופין טיטניום מחטים) להפריד את הפרוסות הנפרדות, לבחור 6-8 פרוסות vermis (ראה מפרטים טכניים על דמות 1Cc ו 1Cc').
- לקחת צלחת 6-ובכן עם תרבות מוסיף ולהעביר ל-4 פרוסות שנבחרו על תרבות אחת הוספה יחד עם כמה בינוני לנתיחה, באמצעות טיפ רחב נשא פיפטה הותאם על פיפטה 1 מ"ל (ראה מפרטים טכניים על 1Cc דמות ').
- מניחים את הפרוסות באמצע תותב תרבות באמצעות ניתוח בינוני או מלקחיים כדי לדחוף ולמשוך אותם בעדינות לתוך במיקום הנכון, הימנעות להם להיות בקשר עם אחד את השני (ראה מפרטים טכניים על 1Cc דמות ').
- הסר כל עודף של דיסקציה בינונית סביב פרוסות באמצעות טיפ דק-end פיפטה. להבטיח הפרוסות להשתטח על הקרום (ראה מפרטים טכניים על 1Cc דמות ').
- מקם את הצלחת 6-ובכן לתוך החממה מיד לאחר שיש להוסיף את הפרוסות על הקרום.
5. פרוסות תרבות, Demyelination (תרגולים זמן ≈ 15-20 דקות)
הערה: לבצע שלב זה בשכונה תרבות זרימה בתנאים סטריליים
- החלף את המדיום תרבות 1 מ"ל לכל טוב של טרום ומחוממת ו במאגר בינוני תרבות טריים כל 3 ימים לאחר הכנה פרוסה.
- עבור demyelination, הסר כל תרבות בינוני שלהלן מוסיפה התרבות אחרי 6 ימים במבחנה (DIV) ולהחליף אותו עם 1 מ"ל לכל טוב של טרום ומחוממת בינוני תרבות טריים המכילים 0.5 מ"ג/מ"ל LPC. תקופת דגירה של 15-17 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- לאחר דגירה, לשטוף את המכסים על-ידי הצבתם בצלוחית 25 מ מ המכיל 1 מ"ל של מדיום תרבות ומחוממת מראש.
הערה: השרוול צריך להיות בקשר עם המדיום, אבל שלא יהיה מכוסה על-ידי אותו. - להעביר מיד את הכיסויים תרבות בצלחת 6-ובכן חדש המכיל טרי בינוני תרבות ומחוממת מראש.
- החלף את המדיום תרבות 1 מ"ל של מדיום תרבות מתוקים ומחוממת מראש כל 2-3 ימים עד פרוסות קיבעון.
6. אימונוהיסטוכימיה (הפעם תרגולים ≈ 1:30 – 2 h)
הערה: לבצע את השלבים 6.1. ל 6.3. ברדס fume. להימנע תערוכות כדי paraformaldehyde (PFA) ולהפנות גליון הנתונים של המוצר בטיחות נאותה מניפולציה והגנה.
- שימוש מלקחיים להרים כל תרבות מוסיף על-ידי החזקת הקצה פלסטיק ולהסיר את המדיום תרבות מתחת הכיסויים קרום מכל קידוח.
- לסדר את פרוסות אסטרוציטומה במשך 30 דקות על-ידי הוספת 2 מ של 4% PFA 1 x PBS pH 7.4 על התוספות ממברנה.
הערה: נקודת הזמן של קיבעון תלויה השלב של myelination למד: 4 DIV המתאים תחילתה של myelination, DIV 7 פרוסות מלא סיבי העצב. במקרה של טיפול LPC, מקביל 9 DIV פסגת demyelination, DIV 11 תחילתה של remyelination ו- DIV 14 פרוסות remyelinated באופן מלא. - לשטוף את הכיסויים עם הפרוסות שלוש פעמים עם PBS 1 x 2 מ ל 10 דקות.
- להפריד את הפרוסות הכיסויים קרום מתחת למיקרוסקופ המשקפת באמצעות סימן x 25 עד 30 x הגדלה, על-ידי בעדינות דוחף אותם בעזרת איזמל או מברשת. לחלופין, כדי למנוע את הסיכון של פגיעה הפרוסות תוך ניתוק אותם מן הקרום, להשתמש באזמל לחתוך את הקרום עם הפרוסות עדיין מחוברת.
- להעביר את הפרוסות צף לתוך הבארות של צלחת 4-ובכן המכיל 1 x PBS, בעזרת מברשת.
- האחות של PBS מכל קידוח, דגירה הפרוסות טרום מקורר 100% אתנול ב-20 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות. שלב זה מאפשר חדירה נוגדן של סיבי סיבי העצב.
- האחות האתנול 100%, לשטוף פעם בקצרה עם 1 x PBS ולאחר מכן פעמיים ב- PBS 1 x 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- האחות של PBS, דגירה את פרוסות למשך 30 עד 45 דקות עם פתרון המכיל 1 x PBS, 5% המיתרים, דטרגנט ללא יונית 0.3% בטמפרטורת החדר כדי לחסום אתרים שאינם ספציפיים נוגדן קיבעון.
- האחות הפתרון חסימה. כביסה לא הכרחי.
- דגירה הפרוסות בין לילה עם נוגדנים העיקרי מעורבבת עם חסימת פתרון ב 4 º C. כדי להמחיש את המיאלין על פרוסות organotypic אסטרוציטומה, השתמש MBP (עוף, 1/150 או בעכבר IGg2b, Smi99, 1/200) או פיפ (עכברוש, ליפידים, 1/5-1/10) נוגדנים.
הערה: כדי לחשוף את הביטוי של אנטיגן אחד או יותר בתוך הפרוסה אותו, לבצע כפול - או של טריפל מכתים ההליך (ראו איור 1 כדוגמה). כדי לבצע בו זמנית הדגירה, ודא נוגדנים העיקרי מיוצרים מינים שונים. לאחר מכן השתמש שלהם נוגדנים משניים המתאימים מצמידים fluorophores שונים (ראה טבלה של חומרים עבור קטרי, paranodal סמן18 נוגדנים). - ביום השני, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים ב- PBS 1 x 10 דקות.
- תקופת דגירה של 3 שעות עם נוגדנים משניים מעורבבת עם חסימת פתרון (1/500 דילול) בחושך בטמפרטורת החדר.
הערה: אופטימיזציה של דילול נוגדן וזמן הדגירה עלול להיות נדרש בעת שימוש נוגדנים אחרים מאלה המתוארים כאן. - לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים ב- PBS 1 x 10 דקות בחושך.
- תחת מיקרוסקופ דו-עינית, לטעון את הפרוסות על זכוכית. מקום µL 100 ל- PBS 1 x בשקופית ולהעביר את הפרוסות לתוך מגניב בעזרת מברשת. לגולל את הפרוסות במידת הצורך ולשטח אותם בשקופית. הסר כל עודף של PBS. במקרה immunolabeling מבוצע עם הפרוסות עדיין מחובר ממברנות, הר עם הפרוסות מול coverslip, עם הקרום על השקופית זכוכית.
- מקום טיפה של הרכבה בינונית ישירות על גבי coverslip זכוכית ומכסים בעדינות את הפרוסות. השקופית הממוסגרת ניתן לאחסן במשך כמה חודשים ב 4 ° C בחושך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמאות המיאלין נציג immunostainings לפרוסות אסטרוציטומה organotypic המתקבל P9-P10 C57black6 פראי-סוג (WT) (איור 2 א), כמו גם פיפ-GFP העכברים הטרנסגניים (איור 2B), יחד עם תאי Purkinje מכתים. שעוטף מן החומר הלבן אסטרוציטומה פרוסות מסלולים באזור הפרוסות לעבר הפריפריה הנמצא בניהול ו myelination של תאי Purkinje מושגת בעיקר לאחר 6-7 DIV. ב- 7 DIV, אינדוקציה של demyelination מלאה אפשרי דרך הטיפול LPC (איור 2Ci-ii). Demyelination הבאים, את הפרוסות באופן ספונטני המיאלין הן באופן מלא remyelinated 6-7 ימים לאחר פסגת demyelination (איור 2Ciii).
איור 1: איור של המוח הקטן פרוסות הדור. . הקרע מחולקת לשלושה שלבים עיקריים. (א) המוח הקטן הוא מבודד והוסרו קרומי המוח (שלבים 4.10 ו- 4.11). (B) המוח הקטן מועברת, פלטפורמת המסוק, חתוכים (שלבים 4.12 כדי 4.16). (ג) ולבסוף, הפרוסות מבודדים מן vermis והניח על הוספה הממברנה. המדיום לנתיחה הועבר עם הפרוסות יוסר ולא הצלחת 6-ובכן ימוקם החממה (שלבים 4.18 ו 4.22). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: דוגמה לפרוסות אסטרוציטומה סיבי העצב תרבותי ex-vivo. אוספי תמונות (עם הקרנה orthogonal) התקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף בעקבות חינם immunolabeling צף, שטוח הרכבה כמפורט בפרוטוקול. הפרוסות הן robustly ו- DIV 11 (A, פיפ; B, GFP בצבע ירוק), התחומים עצב הם התאספו כפי שנצפה ויוו עם צמתים של Ranvier מועשר ערוצים ממותגת מתח נתרן (Nav, באדום) ולצדו paranodal axoglial צומת התחום (Caspr, לבן) ב- C57black6 WT (A ) כמו גם פרוסות העכברים הטרנסגניים פיפ-GFP (B). (ג) קליפת אסטרוציטומה אדריכלות נשמרת ב- הפרוסות בתרבית, כפי שנמדדו על אסטרוציטומה פרוסות עכברים פיפ-GFP. (אני) Purkinje תאים האקסון (Calbindin, Calb, בצבע כחול) הם robustly סיבי העצב (GFP, בירוק) לאחר שבוע אחד בתרבות. (ii) LPC טיפול מלא demyelinates הפרוסות, אילו המיאלין באופן ספונטני, הינם remyelinated-6 ימים-פוסט-demyelination (iii, 14 DIV). גודל ברים = 20 מיקרומטר (A, B); 100 מיקרומטר (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנחנו פירוט פרוטוקול ליצירת אקסית vivo מודל המתאים התרבויות פרוסה organotypic אסטרוציטומה העכבר, המותאם ממשחק בעבר שיטות שפורסמו15,16,19 ו את המיאלין עוקבות immunostaining של ההכנות הללו. אסטרטגיה זו מציעה את האפשרות לדמיין המיאלין רכיבים עם ברזולוציה גבוהה מדינות גם בריא וגם פתולוגיים.
Organotypic אסטרוציטומה פרוסה שנלקחו בן יום-10 עכברים שהתרבויות דגם ניסיוני ומבוססת לחקור מנגנונים תאית המולקולריים שבבסיס תהליכים myelination ו- remyelination, שכן היא מאפשרת לשחזר ביותר אנטומי ו תכונות פונקציונליות של הרקמה המתאימה ויוו כולל לא רק שמירה על ארכיטקטורת הסלולר מוגדרים היטב, אלא גם את ציר הזמן של התבגרות17. יתר על כן, פרוסות אסטרוציטומה יש ארגון אדריכליים שהשתמרו לאחר הפריה שבועיים (איור 1C). המתח פיפ-GFP הטרנסגניים היא חלופה, המאפשרת, בפרט, לראות את מצב myelination תחת מיקרוסקופ דו-עינית פלורסנט על פרוסות בשידור חי, אשר נוח במיוחד ללימודי demyelination-remyelination (איור 1C ).
הכנות אלה הם מעניינים במיוחד כמו בגישה מהירה כדי להעריך את קצב myelination עם כימות ממוכנות מפותחות, כולל ניתוח המערבי-כתם20, CNPase assay16 או כימות של פיפ/Calbindin (או MBP / Calbindin) צביעת17,21, ובכך מייצג מערכת תפוקה גבוהה המאפשר בדיקה של תרופות תרופתי demyelinating הפרעות22,23.
אחד הנושאים הקריטיים העיקרי בעת ביצוע ניסויים אלה עשוי להיות קשור לאיכות הפרוסות אסטרוציטומה. ראשית, הגיל של עכברים יש חשיבות עבור organotypic אסטרוציטומה פרוסה תרבויות. הישרדותם של תאי Purkinje, נוירון רק סיבי העצב בתרבויות אסטרוציטומה, בסכנה אם תרבויות מוכנות של P2 P7 מכרסמים או עם תורמים שגילם P1317. באופן כללי יותר, organotypic המוח פרוסה תרבויות קשים להשיג של מבוגרים בעלי חיים. שנית, משך הזמן של עיבוד רקמות במהלך ניתוח הוא קריטי, כמו ניתוח אורך יותר מ 15-20 דקות לכל חיה מוביל לירידה שיעור הישרדות של הפרוסות. יתר על כן, בעת בחירת הפרוסות כדי להיות תרבותי, עדיף להימנע משימוש אלה מקצה של הצרבלום עקב הישרדות המסכן של הנוירונים ואת תוצאות של סיבי סיבי העצב.
פרמטרים נוספים כגון יציבות טמפרטורה וריכוז2 CO בעוד בתרבות קביעת הגורמים כדי להבטיח בריאות פרוסה. לבסוף, האיכות של הפרוסות מושפעת ההרכב של הסרום הסוס, אשר לא יכול להיות נשלט על ידי המשתמשים. לכן, בדיקת מספר אצוות של נסיוב מומלץ מאוד.
כדי לקבל נאותה של תיוג, קיבוע הרקמה היא צעד המפתח. על מנת להקל על החדירה של נוגדנים כדי להגיע אנטיגנים המיאלין, כפי המיאלין היא מבנה קומפקטי מאוד, מומלץ טיפול קדם פרוסות עם אתנול מוחלטת לאחר קיבוע. בהמשך ניתן להחיל פרוטוקול דומה של צביעת ויוו קבוע רקמות, למרות הריכוז טריטון ייתכן שיהיה צורך להתאים העובי של vibratome או cryostat שנוצר מקטעים ויוו. יש גם לשקול את הזמינות של נוגדנים מסחרי. הכנת פרוסות של העכברים הטרנסגניים כגון פיפ-GFP24 או CNP-GFP25 ובכך מייצג חלופה להמחיש המיאלין ו אוליגודנדרוציטים תהליכים.
בנוסף immunochemical בשיטות המתוארות פרוטוקול זה, גישות אחרות משמשות ללמוד אדריכלות מיאלין. טכניקות המשלימה קיימים גם לחקור ultrastructure מיאלין, עם מיקרוסקופ אלקטרונים להיות תקן זהב26. קיימות טכניקות אחרות, כגון גישות ללא תווית כולל27,טומוגרפיה אופטית קוהרנטית28,28,של פיזור ראמאן29, דור שלישי-הרמוני30 או ספקטרלי קונפוקלי השתקפות מיקרוסקופ31; גישות אלה יש יתרון נוסף המאפשר התבוננות תהליכים תאיים דינמי. עם זאת, כמה טכניקות אלה מורכבים ודורשים עוד המדינה-of-the-art מיקרוסקופ set-ups. מסיבות אלו, מחקר המיאלין על ידי תיוג immunofluorescence נשאר בגישה סטנדרטית לחקור myelination ו שלה פגמים מחלות התפתחותיות או נרכשות שונות ודגמים שלהם, כמו גם כדי להעריך את הפוטנציאל של העתיד טיפולית טיפולים. זה יכול לשמש עוד יותר ללמוד myelination בהקשרים מרובים, כגון למידה, פלסטיות, כמו גם הזדקנות, דיכאון או אוטיזם שבו המיאלין ידוע להיות שונה32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אף אחד מחברי יש אינטרסים מתחרים או האינטרסים המתנגשים.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר שון פרימן, ד ר נטלי סול-Foulon, ד ר תומס רו להערות יקר על כתב היד. עבודה זו מומן על ידי INSERM, ICM, מענקים ARSEP R13123DD, R17127DD ANR (כדי לספירה) ואחווה עקרות, SPF20110421435 (כדי לספירה) FDT20170437332 (ל. מ. ת). אנו מודים המתקן תרבות תא CELIS, את icm. פלטפורמת הדמיה חשבים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60 mm and 100 mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 mm x 26 mm x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M.
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
