Summary
Burada fare serebellum ve miyelin kılıf immünhistokimya tarafından myelination ve remyelination merkezi sinir sisteminde mekanizmaları araştıran için uygun boyama dilim kültürler organotypic hazırlamak için bir yöntem mevcut.
Abstract
Sinir sisteminde miyelin gliyal myelinating tarafından oluşturulan bir karmaşık membran yapısı hücreleri, hangi ensheathes akson ve hızlı elektrik iletim kolaylaştırır var. Miyelin değişiklik fonksiyonel açıkları ile ilişkili nerede çeşitli nörolojik hastalıklarda ortaya göstermiştir. Burada, eski bir ayrıntılı bir açıklama sağlamak vivo modeli kültür için birkaç hafta ve daha fazla miyelin görselleştirmek için etiketli muhafaza fare organotypic serebellar dilim, oluşan.
Introduction
Neurons girdileri çevresi ve üretimi ve elektrik darbeleri diğer hücrelere yayılmasını sağlar bir akson alır bir somato-dendritik bölme oluşturan çok polarize hücrelerdir. Hızlı yayılma ve bilgilerin zamanında teslim sinir sisteminin düzgün çalışması için önemlidir. Omurgalılar, aksonal iletim hızı1artan sağlayan myelination tarafından yönetilir. Miyelin sıkıştırılmış katmanları plazma zarı myelinating glia tarafından oluşturulan Merkezi sinir sistemi (MSS), yani oligodendrocytes ve periferik sinir sistemi (PNS) Schwann hücreleri tarafından kurulan özel bir yapıdır. Hem MSS ve PNS, axoglial etkileşimler özel aksonal etki oluşumu sürücü: of Ranvier düğümleri ve onların çevre etki alanları, paranodes ve juxtaparanodes2. Aksonal kesimi miyelin veya internodes, diğer voltaj Kapılı sodyum kanallarının (Nav) zenginleştirilmiş küçük unmyelinated etki alanlarına karşılık gelen düğümü of Ranvier ile izole edilmiş. Yüksek konsantrasyon ve Nav kanal düğümleri of Ranvier adlı hızlı aktivasyon rejenerasyon aksiyon potansiyelleri ve miyelin kılıf yalıtım özellikleri ile birlikte izin, verimli ve hızlı saltatory iletim sağlamak sinir impuls3akson boyunca.
Sinir impuls iletim hızı hızlandırılması rolüne ek olarak, myelinating glia uzun vadeli bütünlüğünü koruyarak ve onun hayatta kalma4,5' te katılan axon metabolik destek sağlar. Ayrıca, bu son yıllarda bu miyelin dinamik olarak böylece muhtemelen yönetmelik ve çeşitli sinir sistemi fonksiyonları plastisite katılan hayatı boyunca modülasyonlu anlaşılır bir hizmet haline gelmiştir. Dağıtım, sayısını, uzunluğu ve akson boyunca miyelin kılıf kalınlığını ayarlar böylece ince çeşitli ağlar6,7,8ayarlamak için yeni bir yol gösterebilir. Bu nedenle, miyelin evrimsel edinimi duyusal, motor ve Bilişsel işlevler için anahtar bir süreçtir ve akson ve glia arasındaki etkileşimi pertürbasyon giderek gelişimsel için katkı olarak kabul veya nörolojik elde hastalıklar9.
Miyelin kompozisyon, lipitler (% 70) yüksek oranda belirli özelliği ile karakterize proteinler (% 30) ile karşılaştırıldığında diğer hücresel zarları10aksine. Ancak, miyelin lipidler, miyelin proteinler miyelin temel protein (MBP), proteolipid protein (PIP), 2', 3'-döngüsel nükleotit 3'-miyelin ilişkili fosfodiesteraz (CNP), glikoprotein (MAG), dahil olmak üzere miyelin için belirli çoğu miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG), PMP-22 ve P010. Miyelin leke çeşitli histolojik yöntemlerle temel alınarak Luxol hızlı mavi11gibi onun lipit bileşimi, Sudan Siyah B12, Baker'ın asit hematin yöntemi13yanı sıra14boyama gümüş adlı biri yok. Yine de, bu yaklaşımlar her zaman bir yeterli kontrast ve bireysel lifleri görselleştirmek için çözünürlük için izin vermez. Miyelin algılamak için alternatif bir yaklaşım miyelin proteinler karşı yönetmen immünhistokimya geçer. Çeşitli antikor miyelin özgü antijenlere yüksek özgüllük ile hedef ve düzenli olarak myelinated yapıları algılamak için kullanılabilir. Antikor-antijen etkileşim daha da bir fluorophore karşı birincil antikor yönettiği ve yeterli Floresans mikroskobu ile görüntülenmeyecektir için ikincil bir antikor kullanarak birleştiğinde ile açığa çıkarılabilir. Burada, immunochemical bir protokol üzerinde miyelin ex vivo serebellar dilimleri, sinir dokusu mimari iyi korunması için izin veren bir model leke açıklayın. Buna ek olarak, organizasyon ve boyutu Purkinje hücre (beyincik tek myelinated nöron) onlara Elektrofizyolojik çalışmalar için klasik bir model ve benzer şekilde sabit veya canlı görüntüleme çalışmaları gerçekleştirmek idealdir.
Serebellar dilimleri P9-P10 fareler Purkinje hücre myelination, çoğunlukla bir hafta ex vivo (6-7 gün in vitro DIV)15elde edilir bir süreç erken başlangıçlı karşılık gelen bir kez oluşturulur. Ayrıca, bu modeli geniş bir demiyelinizasyon myelinotoxic bileşik lysophosphatidylcholine (veya lysolecithin, LPC) kullanarak serebellar dilimler halinde indüklenen gibi multipl skleroz (MS), gibi demiyelinizan hastalıkları araştırmak için adapte hangi bir spontan remyelination16,17tarafından takip edilir. Endojen remyelination iki gün kültür ortamdan LPC çıkarıldıktan sonra gerçekleşir ve neredeyse bir hafta sonrası tedavi tamamlamak olduğunu.
Approximatively 3 hafta serebellar dilim kültürler hazırlık, tam myelinated dilimleri, demiyelinizasyon ulaşmak için 2 gün tarafından takip elde etmek için bir hafta ve onların tam bir hafta için yarım gün de dahil olmak üzere, bu protokolün tamamlanmasından alır remyelination. Buna ek olarak, immünhistokimya 2 gün içinde tamamlanabilir. Burada açıklanan protokol 6 fare pups standart bir çöp için uyarlanmış ve planlı deneme için kullanılan hayvan sayısı ile ilgili adapte gerekiyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren tüm iş kurumsal politikalarımızı ve yönergelerimizi UPMC, INSERM ve Fransız ve Avrupa Topluluğu Konsey Direktifi 86/609/EEC tarafından kurulan karşılanmış.
1. hazırlanması kültür orta ve kültür ekler (Uygulamalı zaman ≈ 10-15 dk)
Not: Bir akış kültür başlıklı steril koşullarda bu adımı gerçekleştirin
- 40 mL % 50'si oluşan kültür ortamının hazırlamak BME, % 25 Hank'in dengeli tuz solüsyonu (1 x), ısı inaktive % 25 at serum, 2 mM glutamin Türev, 100 IU/mL penisilin-streptomisin ve 4.5 mg/mL D-glukoz ile desteklenmiştir. PH 7.4 için ayarlayın.
- Filtre-orta bir 50 mL plastik şırıngayı uyarlanmış bir 0,22 mikron filtre aracılığıyla sterilize.
Not: Kültür orta 4 ° C'de en az bir hafta boyunca saklanır. - 6 pups standart çöp iki steril 6-şey tabak kullanın. Her plaka için kapağı çıkarın ve kültür ortamı Yani başına 1 mL ekleyin.
- Bir kültür Ekle steril Forseps ile plastik kenar tutarak her bireysel kuyunun içine yerleştirin. Kapağı geri tabağa koy.
Not: Bir yavru (6-8) toplanan serebellar dilimleri iki membranlar (3-4 serebellar dilim başına membran Ekle) üzerinde sevk.
2. diseksiyon orta hazırlanması (Uygulamalı zaman ≈ 5 dk)
Not: Bir akış kültür başlıklı steril koşullarda bu adımı gerçekleştirin
- Gey'nın tuz solüsyonu dengeli 4.5 mg/mL D-glukoz ve 1 x penisilin-streptomisin (100 IU/mL her) ile desteklenmiş oluşur diseksiyon orta 100 mL hazırlayın.
- Filtre-Orta 0,22 mikron filtre ünitesi aracılığıyla sterilize.
Not: Diseksiyon orta 4 ° C'de en az bir ay boyunca saklanır. - 5 mL soğuk diseksiyon orta de 60 mm hücre kültür yemekleri ekleyin. Bir 60 mm hücre kültür yemek disseke her yavru için hazırlamak.
- Diseksiyon yemekler buz üzerinde kullanımda kadar devam.
3. diseksiyon malzeme hazırlanması (Uygulamalı zaman ≈ 15 dk)
- Kürsüye % 100 etanol ile temizleyin.
- Tüm diseksiyon araçları, jilet ve doku helikopter plastik platformu % 100 etanol ile sterilize.
- Tıraş bıçağı ve plastik platform doku helikoptere düzeltmek ve kesme kalınlığı 300 µm için ayarlayın.
- Tüm etanol diseksiyon başlamadan önce buharlaşıp vardır emin olun.
4. CerebellumDissection ve bölümler hazırlık (Uygulamalı zaman ≈ hayvan başına 15-20 dk)
- Bir buz gibi diseksiyon orta Binoküler mikroskop altında içeren 60 mm hücre kültür yemekleri yerleştirin ve üst plaka kaldırmak.
- Baş kürk (dikkatle hayvanın gözleri dokunmaktan kaçınarak) % 70 etanol ile temizle ve onaylanmış prosedüre göre büyük keskin makas kullanarak hayvan başını kesmek.
Not: Serebellar dilimleri P9-P10 fareler herhangi bir belirli seks ya da zorlanma önyargı olmadan oluşturulur. - Boynundan başladı ve fare namlu kadar gidiş kafanın orta çizgi boyunca deriyi kesme küçük makas kullanın.
- Kafa tutun ve kafatası ortaya çıkarmak için geri ventrally baş altında deri kat ve iki kişinin parmak arasında deri kıvrımları çimdik.
- Küçük makas yavaşça deliği magnum yerleştirin ve kafatası bir kesi doğru yan yan ve kafa kafatasının kesim yaparak kesti. Ucu makas ile kesme beyin dokusuna zarar görmesini önlemek için süre mümkün olduğunca paralel olarak ve kafatası yakın tutun.
- Fine-düz forseps kullanarak kafatası dorsal parçası almak. Dikkatle kafatası dorsal parçası kaldırma sırasında yapışan meninkslerde (beyin dokusu çevreleyen saydam sulu membran) kesilmiş küçük makasla beyin dokusuna zarar vermemek için gerekirse.
- Dikkatle fine-düz forseps tanıtmak (veya alternatif olarak bir spatula kullanın) ventral kafatası-beyin arasındaki yavaşça beyin flip ve optik ve trigeminal sinir küçük makasla kesip.
- Buz gibi diseksiyon orta baş baş aşağı sadece çanak üzerinde çevirerek içeren 60 mm hücre kültür çanak içine yerçekimi tarafından bırakmak için beyin yardım ve son yapışıklıklar küçük makasla gerekirse bırakın.
- İyi forseps kullanarak, beyin dorsal yüzü araştırmacı bakacak ve çanak altta yatan ventral yan ile yönlendirmek.
- Bu zarar olabilir gibi Binoküler mikroskop altında güzel-düz forseps beyin ön tarafında hareketsiz ve arka beyin, dokunmaktan kaçının için kullanın. Arka beyin beyin (ön - ve orta, şematik resim 1Aaüzerinde görmek), geri kalanından ayrı güzel-düz forseps kullanarak. Beyincik arka beyin diğerlerinden ayırmak için iyi forseps beyincik altında serebellar peduncles kesmek için kullanın (Şematik bakın şekil 1Aa').
- Beyincik izole olduğunda, dikkatlice uzakta fine-düz forseps kullanarak meninkslerde gözyaşı (Şematik bakın şekil 1Aa').
- Beyincik yavaşça ince kavisli Forseps ile tutun ve dorsal yanında kadar dik helikopter jilet için plastik platformu üzerine yerleştirin (Şematik bkz: şekil 1Bbüzerinde).
- Herhangi bir aşırı Aspire diseksiyon orta 1 mL uyarlanmış bir steril ince uçlu pipet ucu kullanarak beyincik çevresinde pipet (Şematik bkz: şekil 1Bbüzerinde).
- Beyincik düz bırakır ama olduğunu emin değil gergin, bir kez optimum sagittal dilimleri parça (bakınız şekil 1Bbşematik) sırasında almak için platformu üzerine yerleştirilir.
- 300 mikron kalınlığında beyincik sagittal bölümlerini doku helikopter ile dilim (Şematik bakın şekil 1Bb'). Güç ve hız Blade site optimize edilmiş olması gerek.
- Yavaşça diseksiyon orta dilimlenmiş serebellum üzerine bir damla ekleyin. 1 mL pipet yerleştirilen bir geniş-geçişli pipet ucu kullanarak, yavaş yavaş dilimlenmiş beyincik Aspire edin ve buz gibi diseksiyon orta içeren geri 60 mm hücre kültür çanak aktar (Şematik bakın şekil 1Bb'').
- Doku helikopter plastik platformu her beyincik Dilimleme arasında % 100 etanol ile temizleyin. Sonraki beyincik platformu üzerine yerleştirmeden önce buharlaşır etanol izin.
- İki güzel-düz forseps (veya alternatif olarak titanyum iğneler) tek tek dilimleri ayırmak ve 6-8 dilim vermis seçmek için kullanın (Şematik resim 1Cc üzerinde görmek ve 1Cc').
- 6-şey plaka kültür ekler ile alın ve 4 seçili dilimleri 1 mL pipet uyarlanmış bir geniş-geçişli pipet ucu kullanarak bazı diseksiyon orta ile birlikte bir kültür Ekle üzerine transfer (Şematik bakın şekil 1Cc').
- İtmek ve onları yavaşça doğru konuma çekin diseksiyon orta veya forseps kullanarak, onları birbirlerine temas kaçınarak kültür Ekle ortasında dilimleri yerleştirin (Şematik bakın şekil 1Cc').
- Diseksiyon orta çevresinde dilimleri ince uçlu pipet ucu kullanarak herhangi bir aşırı kaldırın. Dilimleri düz membran üzerinde yatıyordu sağlamak (Şematik bakın şekil 1Cc').
- 6-şey plaka sonra hemen dilimleri eklendi membran üzerinde kuluçka makinesi yerleştirin.
5. dilim kültür ve demiyelinizasyon (Uygulamalı zaman ≈ 15-20 dk)
Not: Bir akış kültür başlıklı steril koşullarda bu adımı gerçekleştirin
- Kültür orta 3 günde dilim hazırlık sonra Önceden ısıtılmış ve tamponlu taze kültür orta kuyu başına 1 mL yerine.
- Demiyelinizasyon için tüm Kültür Kültür 6 gün sonra tüp bebek (DIV) ekler orta aşağıdaki kaldırmak ve Önceden ısıtılmış taze kültür 0,5 mg/mL LPC içeren orta kuyu başına 1 mL ile değiştirin. 15-17 h 37 ° c, % 5 CO2için kuluçkaya.
- Kuluçka sonra ekler bir 25 mm Önceden ısıtılmış kültür orta 1 mL içeren kabında yerleştirerek yıkayın.
Not: Ekler ile temas halinde orta olmalı, ama onun tarafından ele değil. - Hemen taze Önceden ısıtılmış kültür ortamı içeren yeni bir 6-şey plaka kültür ekler aktarın.
- Kültür orta dilimleri fiksasyon kadar her 2-3 gün önceden ısıtılmış taze kültür orta 1 mL ile değiştirin.
6. immünhistokimya (Uygulamalı süresi ≈ 1:30-2 saat)
Not: 6.1 adımları da gerçekleştirin. 6,3 için. duman başlık altında. Fuar paraformaldehyde (PFA) için önlemek ve ürün güvenliği veri sayfası yeterli manipülasyon ve koruma için başvurulacak.
- Her kültür kaldırmak için kullanım forseps plastik kenar tutarak ekler ve kültür orta membran ekler altındaki her kuyudan çıkarın.
- Serebellar dilimler için 30 dk 2 mL % 4'lük ekleyerek düzeltmek PFA membran ekler üzerine PBS pH 7,4 x 1.
Not: Fiksasyon zaman turistik okudu myelination sahnede bağlıdır: 4 DIV karşılık gelen myelination, tam myelinated dilimlere 7 DIV başlangıcı için. LPC tedavi durumunda 9 DIV demiyelinizasyon, remyelination başlangıcı için 11 DIV ve tam remyelinated dilimlere 14 DIV zirvesine karşılık gelir. - Ekler üç kez ile 2 mL 1 x PBS 10 min için dilimleri ile yıkayın.
- Dilimleri membran ekler 25 x 30 x büyütme, neşter veya bir fırça kullanarak hafifçe iterek kullanarak Binoküler mikroskop altında ayırmak. Alternatif olarak, dilimleri membran ayırma sırasında zarar riskini önlemek için bir neşter membran hâlâ bağlı dilimleri ile kesmek için kullanın.
- Kayan dilimleri bir fırça kullanarak 1 x PBS içeren bir 4-şey plaka kuyu aktarın.
- PBS her kuyudan Aspire edin ve önceden soğutulmuş % 100 etanol için 15-20 dk-20 ° C'de dilimleri kuluçkaya. Bu adımı myelinated lifleri antikor penetrasyonu kolaylaştırır.
- % 100 etanol Aspire edin ve bir kez kısaca 1 PBS x, daha sonra iki kez 1 x PBS için oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın.
- PBS Aspire edin ve 1 x PBS, %5 NGS, oda sıcaklığında %0,3 non-iyonik deterjan non-spesifik antikor fiksasyon siteleri engellemek için içeren bir çözüm ile 30-45 dk için dilimleri kuluçkaya.
- Engelleme çözüm Aspire edin. Hiçbir çamaşır gereklidir.
- Dilimleri gecede çözüm 4 ° C'de engelleme seyreltilmiş birincil antikorlar ile kuluçkaya. Miyelin serebellar organotypic dilimleri üzerinde görselleştirmek için MBP (tavuk, 1/150 veya fare Igg2b, Smi99, 1/200) veya PIP (Rat, Hibridoma, 1/5-1/10) kullanın antikorlar.
Not: Ifade aynı dilim içinde birden fazla antijen ortaya çıkarmak için bir çift veya üçlü yordamı boyama gerçekleştirmek (örnek olarak şekil 1 bakınız). Kuluçka aynı anda gerçekleştirmek için birincil antikorlar farklı türler üretilmektedir emin olun. O zaman, onların karşılık gelen ikincil antikorlar için farklı fluorophores birleştiğinde kullanmak ( Malzemeler tablo için bkz: düğüm ve paranodal işaret18 antikorlar). - İkinci gün, dilimleri 1 x PBS 10 min için üç kez yıkayın.
- 3 h için çözüm (1/500 seyreltme) içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında engelleme seyreltilmiş ikincil antikorlar ile kuluçkaya.
Not: Antikor seyreltme ve kuluçka süresi optimizasyonu açıklananlardan başka antikorlar burada kullanırken gerekli olabilir. - Dilimleri 1 x PBS karanlıkta 10 min için üç kez yıkayın.
- Binoküler mikroskop altında bir cam slayt üzerine dilimler bağlayın. 1 x PBS 100 µL slaytta yer ve dilimleri bir fırça kullanarak PBS aktarın. Gerekirse dilimleri açılmak ve onları slayt üzerinde düzleştirin. PBS herhangi bir fazlalığı kaldırın. İmmunolabeling hâlâ membran için bağlı dilimleri ile gerçekleştirilir diye, coverslip membran üzerinde cam kaymak ile karşı karşıya dilimleri ile bağlayın.
- Montaj ortamına doğrudan cam coverslip bir damla yerleştirin ve nazikçe dilimleri kapsayacak. Birkaç ay içinde belgili tanımlık karanlık 4 ° C'de bağlı slaytlar depolanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organotypic serebellar dilimleri P9-P10 C57black6 vahşi-türünden (WT) (şekil 2A), yanında PLP-GFP transgenik fareler (şekil 2B), boyama Purkinje hücreleri ile birlikte elde edilen temsilcisi miyelin immunostainings örnekleri. Serebellar dilim beyaz madde myelinate izler folia çevre doğru dilim bölgesinin ve myelination Purkinje hücre çoğunlukla 6-7 sonra elde DIV. 7 DIV indüksiyon tam demiyelinizasyon LPC tedavi (şekil 2CI-II) yoluyla mümkündür. Aşağıdaki demiyelinizasyon, dilimleri kendiliğinden remyelinate ve tam remyelinated 6-7 gün sonra tepe demiyelinizasyon (şekil 2Ciii).
Şekil 1: beyincik resmi dilim üretimi. Diseksiyon üç ana adımda ayrılmıştır. (A) beyincik izole ve meninkslerde kaldırıldı (Adım 4,10 ve 4.11). (B) beyincik sonra helikopter platformu ve aktarılır (Adım 4.12-4.16) dilimlenmiş. (C) son olarak, dilimleri vermis izole edilmiştir ve bir membran eklemek yerleştirilir. Dilimleri ile transfer diseksiyon orta kaldırılır ve 6-şey plaka İnkübatör (Adım 4,18 ve 4.22) yerleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: ex vivo kültürlü myelinated serebellar dilimleri örneği. Görüntü yığınları (ile orthogonal projeksiyon) aşağıdaki ücretsiz kayan immunolabeling ve iletişim kuralında tanımlandığı gibi montaj düz bir dik confocal mikroskop kullanarak elde edilmiştir. Dilimleri (A, PIP; 11 DIV sağlam myelinated B, GFP yeşil) ve aksonal etki alanları ile düğümleri of paranodal axoglial junction etki alanında (Caspr, beyaz) C57black6 WT (A çevrili voltaj Kapılı sodyum kanalları (Nav, kırmızı) zenginleştirilmiş Ranvier içinde vivo gözlemlediği gibi monte edilir ) yanında PLP-GFP (B) transgenik fareler dilimleri. (C) serebellar korteksin mimari kültürlü dilimler halinde, üzerinden PIP-GFP fareler serebellar dilimleri üzerinde gözlemlediği gibi korunur. (ben) Purkinje hücreleri axon (Calbindin, Calb, mavi) kültür bir hafta sonra sağlam myelinated (GFP, yeşil) vardır. (II) LPC tedavi tam dilimleri, hangi remyelinate kendiliğinden demyelinates ve tam remyelinated 6 gün sonrası demiyelinizasyon (III, 14 sayı) vardır. Ölçek çubukları 20 µm (A, B); = 100 µm (C). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, eski bir oluşturmak için bir protokol ayrıntılı fare serebellar organotypic dilim kültürler için karşılık gelen vivo modeli adapte üzerinden daha önce yayımlanmış yöntemleri15,16,19 ve sonraki miyelin Bu hazırlıklar immunostaining. Bu strateji ile bir yüksek çözünürlüklü miyelin bileşenlerinde sağlıklı ve patolojik durumları görselleştirmek için imkanı sunuyor.
10 günlük eski fare alınan serebellar organotypic dilim kültürleri vardır en anatomik çoğaltmak sağlar gibi myelination ve remyelination süreçleri, temel moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak için köklü bir deneysel model ve işlevsel özellikleri karşılık gelen doku içinde sadece iyi tanımlanmış bir hücresel mimarisi değil, aynı zamanda olgunlaşma zaman çizelgesi17korunması dahil olmak üzere vivo. Ayrıca, serebellar dilimleri sonra iki hafta içinde vitro korunmuş bir mimari örgüt-si olmak (şekil 1 c). Alternatif, özellikle demiyelinizasyon-remyelination çalışmaları (rakam 1 c için özellikle uygun floresan binoküler mikroskop canlı dilimleri üzerinde myelination statüsünde gözlemlemek için izin, transgenik PLP-GFP yük olduğunu ).
Bu hazırlıklar myelination oranı western-blot analizi20, CNPase tahlil16 ya da PIP/Calbindin miktar dahil olmak üzere Gelişmiş otomatik miktar ile değerlendirmek için hızlı bir yaklaşım olarak belirli ilgi vardır (veya MBP / Böylece içinde bozuklukları22,23demiyelinizan farmakolojik ilaçlar test için izin veren bir yüksek-den geçerek sistem temsil eden Calbindin) Boyama17,21.
Bu deneyler yaparken ana kritik konulardan biri serebellar dilimleri kalitesi ile ilgili. İlk olarak, farelerin yaş serebellar organotypic dilim kültürler için önem taşıyor. Yoksa kültürleri P2 P7 kemirgenler veya bağış P1317büyük ile hazırlanır Purkinje hücreleri, sadece myelinated nöron serebellar kültürlerde yaşama güvenilir değil. Daha genel olarak, organotypic beyin dilim kültürler yetişkin hayvanlardan elde etmek zordur. İkinci olarak, doku işleme diseksiyon sırasında süresi önemlidir bir diseksiyon hayvan başına 15-20 dakikadan fazla adımında hayatta kalma oranı dilimleri bir düşüş yol açar. Ayrıca, kültürlü için dilimler seçerken, beyincik zavallı hayatta kalma nedeniyle bir ucunu olanlardan nöronlar ve sonuç myelinated lifleri kıtlığı kullanarak kaçınmak en iyisidir.
Sıcaklık ve CO2 konsantrasyonu kültüründe ise istikrarı gibi diğer parametreleri dilim Sağlık sağlamak için faktörler belirleniyor. Son olarak, dilimleri kalitesi kompozisyon kullanıcılar tarafından kontrol edilemez bir at serum etkilenir. Bu nedenle, serum birkaç toplu işlemi test önerilir.
Bir yeterli etiketleme elde etmek için doku fiksasyon önemli bir adımdır. Miyelin çok kompakt bir yapı olduğu gibi miyelin antijenleri, ulaşmak için antikorlar penetrasyon kolaylaştırmak için dilimleri ön arıtma mutlak etanol ile fiksasyon takip tavsiye edilir. Boyama benzer bir protokol se Triton konsantrasyon vibratome kalınlık için adapte olmak gerekebilir ya da cryostat içinde vivo bölümleri oluşturulan vivo içinde sabit dokular için daha da uygulanabilir. Ticari olmayan antikorlar kullanılabilirliğini de durulmalıdır. PIP-GFP24 veya CNP-GFP25 gibi transgenik fareler gelen dilimler hazırlanıyor böylece miyelin ve oligodendrocytes süreçlerini görselleştirin alternatif temsil eder.
Bu protokol için açıklanan immunochemical yöntemlere ek olarak, diğer yaklaşımlar genellikle miyelin mimarlık okumak için kullanılır. Tamamlayıcı teknikleri da miyelin ultrastructure, elektron mikroskobu ile altın standart26olmak araştırmak için bulunmaktadır. Diğer teknikleri, etiket içermeyen yaklaşımlar gibi optik Koherens tomografi27,28, Raman saçılması28,29, üçüncü harmonik üretimi30 da dahil olmak üzere mevcut veya spektral confocal yansıma mikroskobu31; Bu yaklaşımlar dinamik hücresel süreçler gözlenmesi etkinleştirme ek avantajına sahip. Ancak, bazı teknikler karmaşıktır ve daha fazla state-of--art mikroskobu set-up gerektirir. Bu nedenlerden dolayı miyelin çalışma ayirt etiketleme tarafından standart bir yaklaşım myelination ve çeşitli gelişim veya alınan hastalıklar ve kendi modellerinin kendi hatalarını araştırmak için hem de gelecek tedavi potansiyelini değerlendirmek için kalır. tedaviler. Daha fazla myelination öğrenme ve plastisite, aynı zamanda yaşlanma, depresyon veya hangi miyelin değişmiş32olduğu bilinmektedir otizm gibi birden çok bağlamlarda eğitim için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarları ya da çakışan ilgi alanları yok.
Acknowledgments
Biz Dr Sean Freeman, Dr Nathalie Sol-Foulon ve Dr Thomas Roux el yazması üzerine değerli yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser INSERM, ICM, ARSEP hibe R13123DD, ANR R17127DD (MS için) ve FRM dostluk, SPF20110421435 (için ad), tarafından finanse edildi (M.T. için) FDT20170437332. Biz CELIS hücre kültür tesis ve ICM teşekkür ederim. Quant görüntüleme platformu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60 mm and 100 mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 mm x 26 mm x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M.
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
