Summary
Здесь мы представляем метод подготовить organotypic срез культур от мыши мозжечка и миелиновой оболочкой, окрашивание, иммуногистохимия подходит для изучения механизмов миелинизации и remyelination в центральной нервной системе.
Abstract
В нервной системе миелина является комплекс мембранные структуры, порожденных myelinating глиальных клеток, которые ensheathes аксоны и облегчает быстро электрической проводимости. Было показано, что миелина изменения происходят в различных неврологических заболеваний, где это связано с функциональными недостатками. Здесь, мы предоставляем подробное описание ex vivo модель, состоящая из мыши organotypic мозжечка фрагменты, которые можно сохранить в культуре на несколько недель и далее быть помечены для визуализации миелина.
Introduction
Нейроны являются крайне поляризованную клетки, которые составляют Сомато дендритных отсек, который получает входы от окружающей его среды и аксон, который обеспечивает генерации и распространения электрических импульсов в другие ячейки. Быстрое распространение и своевременное предоставление информации имеет важное значение для правильного функционирования нервной системы. В позвоночных он способствует миелинизации, что позволяет увеличить аксональное проводимости скорости1. Миелиновые является специализированная структура, образованная уплотненных слоев плазматической мембраны, порожденных myelinating глии, а именно Олигодендроциты в центральной нервной системе (ЦНС) и Шванновские клетки в периферической нервной системы (ПНС). Как в ЦНС и ПНС, axoglial взаимодействия диск формирование специализированных аксональное доменов: Ranvier из узлов и их окружающие доменов, paranodes и juxtaparanodes2. Аксональное сегменты, изолированные миелина, или междоузлий, чередуются с Ranvier на узлы, которые соответствуют малых unmyelinated домены, обогащенный в закрытом напряжения натриевых каналов (Nav). Высокая концентрация и быстрой активации Nav каналов на узлы по Ranvier позволяют регенерации потенциалы действия и вместе с теплоизоляционные свойства миелиновой оболочки, обеспечить проведение эффективных и быстро saltatory нервного импульса вдоль аксона3.
В дополнение к своей роли в ускорении скорости проведения нервного импульса глии myelinating обеспечивает метаболические поддержку Аксон, сохраняя его долгосрочной целостности и участвуя в ее выживание4,5. Кроме того это стало ясно в последние годы, что миелина динамически модулируется на протяжении всей жизни, таким образом, предположительно участвующих в регулирование и пластичности различных функций нервной системы. Корректировки распределения, номер, Длина и толщина миелиновой оболочки вдоль аксоны может таким образом представляют новый способ тонко настраивать различные сети6,,7-8. Таким образом эволюционное приобретение миелина является ключевой процесс для чувств, мотор и когнитивных функций и возмущений взаимодействия между аксонов и глии все чаще рассматривается как вклад развития или приобретенные неврологические болезни9.
Характеризуется состав миелина, с конкретной функцией значительная липидов (70%) по сравнению с белками (30%) в отличие от других клеточных мембран10. Однако в отличие от миелина липиды, большинство белки миелина специфичные для миелина, включая основной белок миелина (MBP), proteolipid белка (ПЛП), 2', 3'-циклических нуклеотидов 3'-фосфодиэстеразы (CNP), связанные миелина гликопротеина (МАГ), миелин Олигодендроциты гликопротеина (мог), PMP-22 и10P0. Основе его состав липидов, например Luxol быстро синий11, Судан черный B12, Бейкер кислоты hematin метод13, а также Серебряный пятнать14существуют различные гистологической методы пятно миелина. Тем не менее эти подходы не всегда позволяют для адекватного контрастность и разрешение для визуализации отдельных волокон. Альтернативный подход для выявления миелина является иммуногистохимия, направленных против белки миелина. Различные антитела целевых миелина специфичные антигены с высокой точностью и может быть использован регулярно для обнаружения Миелинизированные структур. Взаимодействие антител антигена можно далее показал, что с помощью вторичных антител в сочетании с Флюорофор направленных против основного антитела и визуализированы с адекватной флуоресцентной микроскопии. Здесь мы описываем иммунохимических протокол пятно миелина на ex vivo мозжечковой ломтиками, модель, которая позволяет для хорошего сохранения архитектуры нервной ткани. Кроме того Организации и размер клеток Пуркинье (единственным Миелинизированные нейронов мозжечка) делают их классическая модель для электрофизиологических исследований и аналогичным образом они идеальны для выполнения исследований фиксированной или жить изображений.
Мозжечковая фрагменты создаются из P9-P10 мышей, время, соответствующее раннее начало клеток Пуркинье миелинизации, процесс, который достигается в основном на одну неделю ex vivo (6-7 дней в пробирке, DIV)15. Кроме того эта модель адаптирована к расследованию демиелинизирующих расстройств, таких как рассеянный склероз (РС), как обширные демиелинизации может быть наведено в мозжечковой ломтики с использованием комплекса lysophosphatidylcholine myelinotoxic (или lysolecithin, LPC), который сопровождается спонтанное remyelination16,17. Эндогенные remyelination происходит от двух дней после удаления ЛСМ из питательной среды и является почти полной недели после лечения.
Завершение этого протокола занимает около 3 недель, в том числе полдня для подготовки мозжечковой ломтик культур, в неделю, чтобы получить полностью Миелинизированные ломтиками, после 2 дней, чтобы достичь пика демиелинизации и еще одна неделя для их полного remyelination. Кроме того иммуногистохимия может быть завершена в течение 2 дней. Протокол, описанные здесь адаптирована к стандартной помет мышей 6 детенышей и необходимо адаптировать относительно количество животных, используемых для запланированного эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все работы с участием животных выполнены с институциональной политикой и руководящими принципами, установленными UPMC, INSERM и французский и директивы Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС.
1. Подготовка питательной среды и культуры вставляет (практический время ≈ 10-15 мин)
Примечание: Выполните этот шаг в капюшоне культура потока в стерильных условиях
- Подготовить 40 мл питательной среды, которая состоит из 50% BME, 25% Хэнк сбалансированного солевого раствора (1 x), 25% тепло инактивированная Верховая сыворотки, дополненная производная глютамин 2 мм, 100 МЕ/мл пенициллин стрептомицином и 4,5 мг/мл D-глюкозы. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4.
- Фильтр стерилизуйте среды через фильтр 0,22 мкм, адаптированных на пластиковый шприц 50 мл.
Примечание: Культура средних может храниться при температуре 4 ° C для по крайней мере неделю. - Для стандартных помет 6 детенышей используйте две стерильные 6-ну пластины. Для каждой пластины снимите крышку и добавить 1 мл питательной среды на хорошо.
- Место вставки одной культуры в каждой индивидуальной скважины путем проведения пластиковой кромкой стерильным пинцетом. Поставьте крышку обратно на плите.
Примечание: Мозжечковая фрагменты, собранные из одного щенка (6-8) может направляться на две мембраны (3-4 ломтика мозжечковая за вставки мембраны).
2. Подготовка рассечение среднего (практический время ≈ 5 мин)
Примечание: Выполните этот шаг в капюшоне культура потока в стерильных условиях
- Подготовка 100 мл рассечение среды, которая состоит из гей сбалансированного солевого раствора с D-глюкозы и 1 x 4,5 мг/мл пенициллин – стрептомицина (100 МЕ/мл).
- Фильтр стерилизуйте среды через блок фильтра 0.22 мкм.
Примечание: Рассечение среднего может храниться при температуре 4 ° C для по крайней мере месяц. - Добавьте 5 мл холодного рассечение среды в 60 мм ячейку культуры блюда. Подготовка 60 мм ячейку культуры блюдо для каждого щенка быть расчленены.
- Держите рассечение блюда на льду до использования.
3. Подготовка материала диссекции (практический время ≈ 15 мин)
- Очистите скамейке с 100% этанола.
- Простерилизуйте все инструменты рассечение, лезвием бритвы и измельчитель ткани пластиковых платформы с 100% этанола.
- Исправьте лезвие бритвы и пластиковой платформы на ткани измельчитель и отрегулировать толщину резки до 300 мкм.
- Убедитесь, что все этанола испарилась перед началом рассечение.
4. CerebellumDissection и Секции подготовки (практический время ≈ 15 – 20 мин на животное)
- Разместите один из 60 мм блюд культуры клеток, содержащих ледяной рассечение среднего под Микроскоп бинокулярный и удалить верхнюю крышку.
- Тампон головы мех с 70% этанола (тщательно избегая касаясь глаза животного) и обезглавить животных, с использованием больших острыми ножницами, согласно утвержденной процедуре.
Примечание: Мозжечковая фрагменты создаются из Р9-P10 мышей без каких-либо конкретного пола или напряжение смещения. - Используйте маленькие ножницы сократить кожу вдоль средней линии головы, начиная от шеи и подойдя к мыши морды.
- Держать голову и разоблачить черепа, загибается кожи вентрально под голову и сожмите две складки кожи между пальцам.
- Аккуратно вставьте затылочного маленькие ножницы и вырезать черепа, сделав один боковой разрез в сторону, а затем вырезать все вокруг головы череп. Держите кончик ножницы как параллельно и близко к череп как можно во время резки, чтобы избежать повреждения ткани мозга.
- Извлечь спинной части черепа с помощью щипцов штраф прямой. Во время тщательно подъема спинной части черепа, вырезать придерживаясь мозговых оболочек (полупрозрачные орошаемых мембраны, окружающие ткани мозга) при необходимости с небольшой ножницами, чтобы избежать повреждения ткани мозга.
- Осторожно ввести штраф прямой щипцы (или в качестве альтернативы использовать шпатель) между брюшной черепа и головного мозга, слегка откиньте мозга и сократить Оптика и тройничного нервов с маленькие ножницы.
- Помочь мозг, чтобы падение под действием силы тяжести в блюдо культуры клеток 60 мм, содержащие ледяной рассечение среднего, повернув голову вниз головой чуть выше блюдо и выпустить последний спайки с маленькие ножницы при необходимости.
- С помощью тонкой щипцы, ориентироваться мозга спинной стороне стоящих перед исследователем, и вентральной стороне лежал на дне посуды.
- Согласно бинокулярный микроскоп используйте корнцанг штраф прямой для иммобилизации на стороне переднего мозга и не прикасайтесь задний мозг, как он может быть поврежден. Отделить задний мозг от остальной части мозга (план - и среднем мозге, вижу схема на рисунке 1Aa), используя пинцет штраф прямой. Чтобы отделить мозжечка от остальной части задний мозг, используйте тонкой щипцы сократить мозжечковой ножки под мозжечка (см. схема на Рисунок 1Aa').
- После мозжечок является изолированным, тщательно оторвать мозговых оболочек, используя пинцет штраф прямой (см. схема на Рисунок 1Aa').
- Аккуратно возьмите мозжечка с тонкой изогнутой щипцами и поместить его с спинной стороне вверх на платформу пластиковые перпендикулярно к лезвия измельчителя (см. схема на рисунке 1Bb).
- Удалить излишки рассечение среды вокруг мозжечка, используя кончик стерильной пипеткой тонкий конец, адаптированных на 1 мл Пипетка (см. схема на рисунке 1Bb).
- Убедитесь, что мозжечок лежит плашмя, но это не растягивается, раз размещены на платформу, чтобы получить оптимальный сагиттальной фрагменты во время резания (см. схема на рис 1Bb).
- Нарежьте 300 мкм толщиной сагиттальной разделы мозжечка с измельчитель ткани (см. схема на Рисунок 1Bb'). Силу и скорость лезвия должны быть оптимизированы на сайте.
- Аккуратно добавьте каплю рассечение среды на ломтики мозжечка. С помощью пипетки широкий родила подсказка, размещены на 1 мл пипетки, медленно аспирационная нарезанный мозжечка и перенести его обратно в блюдо культуры клеток 60 мм, содержащие ледяной рассечение среднего (см. схема на Рисунок 1Bb'').
- Очистите пластиковые платформы ткани измельчитель с 100% этанола между каждой мозжечка нарезки. Пусть испаряться до размещения следующего мозжечка на платформу этанола.
- Используйте два штраф прямой щипцы (или альтернативно титана иглы) для разделения отдельных фрагментов и выберите 6-8 ломтиков от червя (см. схема на рисунке 1Cc и 1Cc').
- Возьмите тарелку 6-ну культуры вставками и передачи до 4 выбранных фрагментов на одной культуре Вставка наряду с некоторых средних рассечение, используя пипетку широкий родила подсказка адаптированы на 1 мл пипетки (см. схема на Рисунок 1Cc').
- Место ломтики в центре культуры вставки с помощью рассечение среднего или щипцы для толкать и тянуть их нежно в нужном месте, избегая их контакт друг с другом (см. схема на Рисунок 1Cc').
- Удалите излишки рассечение среды вокруг ломтики с помощью кончика пипетки тонкий конец. Убедитесь, что ломтики заложить плашмя на мембране (см. схема на Рисунок 1Cc').
- Место пластину 6-Ну в инкубатор сразу же после добавления ломтики на мембране.
5. кусочки Культура и демиелинизации (практический время ≈ 15 – 20 мин.)
Примечание: Выполните этот шаг в капюшоне культура потока в стерильных условиях
- Замените питательной среды 1 мл на хорошо подогретым и буферизации свежей питательной среды каждые 3 дней после подготовки фрагмента.
- Демиелинизации удалите все культуры среднего ниже культуры вставляет после 6 дней в пробирке (DIV) и заменить его 1 мл на хорошо подогретым свежей питательной среды, содержащих 0,5 мг/мл LPC. Инкубируйте 15-17 ч при 37 ° C, 5% CO2.
- После инкубации мыть вставок, помещая их в чашке Петри 25 мм, содержащие 1 мл подогретым питательной среды.
Примечание: Вставки должен быть в контакте с носителя, но не быть охвачены его. - Сразу передача культуры вставок в новой пластины 6-Ну, содержащий свежие подогретым питательной среды.
- Замените питательной среды с 1 мл раствора подогретым свежей питательной среды каждые 2-3 дня до фиксации фрагментов.
6. иммуногистохимия (практический время ≈ 1:30-2 h)
Примечание: Выполните шаги 6.1. до 6.3. под вытяжного шкафа. Избегайте экспозиции для параформальдегида (PFA) и относятся к безопасности спецификация для надлежащей обработки и защиты.
- Используйте корнцанг поднять каждой культуры вставляет путем проведения пластиковой кромкой и удалите питательной среды под вставки мембраны из каждой скважины.
- Исправить мозжечковой ломтики для 30 мин, добавив 2 мл 4% ПФА в 1 x PBS рН 7,4 на вставки мембраны.
Примечание: Момент времени фиксации зависит от стадии миелинизации учился: 4 DIV соответствует начала миелинизации, 7 DIV полностью Миелинизированные ломтиками. В случае лечения ЛСМ 9 DIV соответствует пик демиелинизации, 11 DIV для начала remyelination и 14 DIV полностью remyelinated ломтиками. - Вымойте вставок с ломтиками три раза с 2 мл ПБС втечение 10 мин.
- Отдельные фрагменты от вставки мембраны под бинокулярный микроскоп, с использованием 25 x 30 x увеличение, осторожно задвиньте их с помощью скальпеля или кистью. Кроме того чтобы избежать риска повреждения ломтики во время отсоединения их от мембраны, используйте скальпель вырезать мембраны с ломтиками еще прилагается.
- Перевести плавающие фрагменты в лунки 4-ну пластины, содержащие ПБС, с помощью кисти.
- Аспирационная PBS от каждой скважины и инкубации срезов в предварительно охлажденным 100% этанола при-20 ° C на 15-20 мин. Этот шаг облегчает проникновение антитела в Миелинизированные волокон.
- Аспирационная 100% этанола и мыть раз кратко с 1 x PBS, затем дважды в однократном ПБС втечение 10 мин при комнатной температуре.
- Аспирационная PBS и инкубации срезов для 30-45 мин раствором, содержащим 1 x PBS, 5% NGS, 0,3% неионные моющего средства при комнатной температуре блокировать сайты фиксации неспецифической антитела.
- Аспирационная блокирования решения. Не мытье является необходимым.
- Проинкубируйте ломтики на ночь с первичных антител, разбавленный преграждая разрешение при 4 ° C. Чтобы визуализировать миелина мозжечковой organotypic срезов, используйте ПМБ (курица, 1/150 или мыши IGg2b, Smi99, 1/200) или ПЛП (Крыса, гибридомной, 1/5 до 1/10) антител.
Примечание: Чтобы раскрыть выражение более чем одного антигена в том же фрагменте выполнить двойной или тройной пятная процедуру (см. рис. 1 в качестве примера). Чтобы одновременно выполнить инкубации, убедитесь, что первичного антитела производятся в разных видов. Затем использовать их соответствующие вторичные антитела, в сочетании с различными флуорофоров (см. Таблицу материалов для узловой и paranodal маркер18 антител). - На второй день Вымойте ломтики три раза в однократном ПБС втечение 10 мин.
- Инкубируйте 3h с вторичные антитела, разбавленный преграждая разрешение (1/500 разрежения) в темноте при комнатной температуре.
Примечание: Оптимизация времени разрежения и инкубации антитела могут потребоваться при использовании других антител, описанных здесь. - Вымойте ломтики три раза в однократном ПБС втечение 10 мин в темноте.
- Под микроскопом бинокль смонтируйте ломтики на стеклянное скольжение. Место 100 мкл ПБС на слайде и Перенесите ломтики в PBS с помощью кисти. Разложите ломтики при необходимости и сплющить их на слайде. Удалите излишки PBS. В случае, если immunolabeling выполняется с ломтиками, по-прежнему придают мембран, смонтируйте с ломтиками, сталкивается с coverslip, с мембраной на стеклянное скольжение.
- Поместите каплю среднего монтажа непосредственно на стекло coverslip и мягко покрывают ломтики. Навесные слайды могут храниться несколько месяцев при температуре 4 ° C в темноте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Примеры immunostainings представитель миелиновый organotypic мозжечка ломтиками, полученные от C57black6 P9-P10 одичал типа (WT) (рисунок 2A), а также ПЛП-GFP трансгенных мышей (рис. 2B), вместе с окрашивания клеток Пуркинье. Мозжечковая ломтики myelinate от белого вещества отслеживает область срезов к периферии folia и миелинизации клеток Пуркинье основном достигается после 6-7 DIV. На 7 DIV индукция полная демиелинизации возможен через LPC лечения (Рисунок 2Ci-ii). Следующие демиелинизации, ломтики спонтанно remyelinate и полностью remyelinated 6-7 дней после пика демиелинизации (Рисунок 2Ciii).
Рисунок 1: Иллюстрация мозжечка ломтиками поколения. Рассечение разделена на три основных этапа. (A) мозжечок является изолированной и мозговых оболочек удалены (шаги 4.10 и 4.11). (B) мозжечка затем переведен на платформу измельчитель и нарезанный (шаги 4.12 до 4.16). (C) наконец, ломтики изолированы от червя и размещены на вставке мембраны. Рассечение среднего, переведены с ломтиками удаляется и 6-ну пластина помещается в инкубатор (шаги 4.18 и 4,22). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: пример Миелинизированные мозжечковой ломтиками, культивированный ex vivo. Стеки изображений (с ортогональной проекции) были получены с помощью вертикально конфокального микроскопа, после свободного плавающего immunolabeling и плоский, монтаж, как описано в протоколе. Ломтики энергично Миелинизированные на 11 див (A, ПЛП; B, GFP в зеленый) и аксональной домены собраны, как отмечено в естественных условиях с узлами по Ranvier обогащенный в закрытом напряжения натриевых каналов (Nav, в красном) окружении paranodal axoglial перехода домена (Caspr, в белом) в C57black6 WT (A ) а также фрагменты трансгенных мышей ПЛП-GFP (B). (C) коры мозжечка архитектура сохраняется в культивированный фрагменты, как заметил на мозжечковой кусочка от ПЛП-GFP мышей. (я) Пуркинье клетки аксона (кальбиндин, Calb, в голубом) являются энергично Миелинизированные (GFP, зеленый) после одной недели в культуре. (ii) LPC лечение полностью спонтанно demyelinates ломтиками, которые remyelinate и полностью remyelinated 6 дней поста демиелинизации (iii, 14 DIV). Масштаб баров = 20 мкм (A, B); 100 мкм (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь, мы подробно протокол для создания ex vivo модель, соответствующую мыши мозжечковой organotypic срез культур, адаптированных из ранее опубликованные методы15,16,19 и последующих миелина иммуноокрашивания этих препаратов. Эта стратегия предоставляет возможность визуализировать миелина компоненты с высоким разрешением в здоровой и патологических государствах.
Мозжечковой organotypic срез культуры взяты из 10-день old мышей являются установившимися Экспериментальная модель для изучения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе процессов миелинизации и remyelination, как он позволяет воспроизводить наиболее анатомические и функциональные возможности соответствующих ткани в естественных условиях, включая не только сохранение четко сотовой архитектуры, но и сроки созревания17. Кроме того, мозжечковой ломтики имеют сохранились архитектурные организации после двух недель в пробирке (рис. 1 c). Трансгенные ПЛП-GFP штамм является альтернативой, позволяя, в частности, соблюдать статус миелинизации под флуоресцентный Микроскоп бинокулярный живой срезов, что особенно удобно для исследования демиелинизации remyelination (Рисунок 1 c ).
Эти препараты представляют особый интерес как быстрый подход к оценке миелинизации курс с развитыми автоматизированного количественного определения, включая Западной блот анализ20, CNPase пробирного16 или количественной оценки ПЛП/кальбиндин (или MBP / Кальбиндин) пятная17,21, таким образом представляя высокой пропускной способности системы, позволяя для тестирования фармакологических препаратов при демиелинизирующих заболеваний22,23.
Одним из основных критических вопросов при выполнении этих экспериментов могут быть связаны с качество мозжечковой ломтиками. Во-первых возраст мышей имеет важное значение для мозжечковой organotypic срез культур. Выживания клеток Пуркинье, только Миелинизированные нейрон в мозжечковой культур, нарушается, если культуры готовят из P2 P7 грызунов или с донорами старше P1317. Вообще organotypic мозг ломтик культуры трудно получить от взрослых животных. Во-вторых продолжительность обработки ткани во время вскрытия имеет решающее значение, как рассечение шаг более чем 15-20 минут в животных ведет к снижению в выживаемости ломтиков. Кроме того при выборе фрагментов для быть культивировали, это лучше избегать использования те от концах мозжечка из-за плохой выживания нейронов и результирующая дефицита Миелинизированные волокон.
Другие параметры, такие как стабильность температуры и концентрации CO2 в культуре являются определяющими факторами для обеспечения здоровья срез. И наконец качество ломтики зависит от состава сыворотки лошадь, которая не может быть проконтролировано пользователей. Поэтому настоятельно рекомендуется тестирование несколько партий сыворотки.
Для получения надлежащей маркировки, фиксация ткани является ключевым шагом. Чтобы облегчить проникновение антител для достижения антигены миелина, как миелина – это очень компактная структура, предварительная обработка срезов с абсолютного этанола рекомендуется после фиксации. Аналогичный протокол пятнать может дополнительно в естественных условиях фиксированной тканей, хотя Тритон концентрации должны быть адаптированы к толщине vibratome или криостата генерируется в естественных условиях секций. Следует также рассмотреть наличие некоммерческих антител. Подготовка фрагментов от трансгенных мышей например ПЛП-GFP24 или25 CNP-GFP таким образом представляет собой альтернативу визуализации процессов миелина и олигодендроциты.
В дополнение к иммунохимические методы, описанные в настоящем протоколе другие подходы обычно используется для изучения архитектуры миелина. Дополнительные методы существуют также расследовать Ультраструктура миелина, с электронной микроскопии, будучи золотой стандарт26. Существуют другие методы, например метка бесплатно подходы, в том числе оптическая когерентная томография27,28, комбинационного рассеяния28,29, поколение третьей гармоники30 или спектральные конфокальный отражения микроскопии31; Эти подходы имеют дополнительное преимущество, позволяя наблюдения динамических клеточных процессов. Однако некоторые из этих методов являются сложными и далее требуют установок-искусство микроскопии. По этим причинам исследование миелина Этикетировочный иммунофлуоресценции остается стандартный подход расследовать миелинизации и его дефекты в различных целях развития или приобретенных заболеваний и их моделей, а также оценить потенциал будущего терапевтических лечение. Он также может использоваться для изучения миелинизации в различных контекстах, таких, как обучение и пластичность, а также старения, депрессии или аутизма, в котором миелина, как известно, быть изменены32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никто из авторов у конкурирующих или противоречивых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Шон Фриман, д -р Натали соль-Фулон и д-р Томас Ру за ценные замечания по рукописи. Эта работа финансировалась INSERM, ICM, ARSEP грантов R13123DD, НРУ R17127DD (до н.э.) и FRM стипендий, SPF20110421435 (до н.э.), FDT20170437332 (для м.т.). Мы благодарим фонд культуры клеток СЕЛИС и icm. Платформа Квант.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60 mm and 100 mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 mm x 26 mm x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M. Molecular dissection of the myelinated axon. Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
