Summary
Hier präsentieren wir eine Methode um organotypischen Slice Kulturen aus Maus Kleinhirn und Myelinscheide Färbung von Immunohistochemistry geeignet für die Untersuchung von Mechanismen der Myelinisierung und Remyelinisierung in das zentrale Nervensystem vorzubereiten.
Abstract
Im Nervensystem ist Myelin eine komplexe Membranstruktur erzeugte Myelinating glial Zellen, welche Ensheathes Axone und erleichtert die schnelle elektrische Leitfähigkeit. Myelin Veränderung nachweislich bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen auftreten, wo sie funktionelle Defizite zugeordnet ist. Hier bieten wir eine ausführliche Beschreibung der Ex Vivo Modell bestehend aus Maus organotypischen zerebelläre Scheiben, die in Kultur gepflegt werden können, für mehrere Wochen und weiter beschriftet werden, um Myelin zu visualisieren.
Introduction
Neuronen sind stark polarisierten Zellen, die eine Somato-dendritische Fach umfassen, die erhält Eingänge von seiner Umgebung und ein Axon, das die Erzeugung und Ausbreitung der elektrischen Impulse an andere Zellen sicherstellt. Schnelle Ausbreitung und rechtzeitige Bereitstellung von Informationen ist entscheidend für das reibungslose Funktionieren des Nervensystems. Bei Wirbeltieren wird es durch Myelinisierung, erleichtert, ermöglicht die Erhöhung der axonalen Wärmeleitung Geschwindigkeit1. Myelin ist eine spezielle Struktur, die durch verdichtete Schichten der Plasmamembran durch die Myelinating Glia erzeugt nämlich Oligodendrozyten in das zentrale Nervensystem (ZNS) und Schwann-Zellen im peripheren Nervensystem (PNS) gebildet. Sowohl in das ZNS und PNS, Axoglial Interaktionen fahren die Bildung von spezialisierten axonalen Domänen: die Knoten von Ranvier und ihre umliegenden Domänen, Paranodes und Juxtaparanodes2. Die axonalen Segmente isoliert von Myelin oder Internodien, wechseln sich ab mit den Knoten von Ranvier, die kleine unmyelinierten Domänen bereichert in Voltage-gated Natriumkanäle (NaV) entsprechen. Die hohe Konzentration und schnelle Aktivierung der NaV Kanäle auf den Knoten von Ranvier ermöglichen die Regeneration von Aktionspotentialen und zusammen mit den isolierenden Eigenschaften der Myelinscheiden, gewährleisten die effiziente und schnelle saltatory Wärmeleitung von der Nervenleitung längs des Axon-3.
Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Beschleunigung die Leitgeschwindigkeit der Nervenleitung unterstützt Myelinating Glia metabolische das Axon, die langfristige Integrität bewahren und die Teilnahme an den überleben-4,-5. Darüber hinaus ist deutlich in den letzten Jahren geworden, dass das Myelin dynamisch lebenslang damit vermutlich die Teilnahme bei der Regulierung und Plastizität der verschiedenen Funktionen des Nervensystems moduliert wird. Anpassungen der Verteilung, Anzahl, Länge und Dicke der Myelinscheiden entlang der Axone können somit einen neuartigen Weg, um verschiedene Netze6,7,8fein tunen darstellen. Daher die evolutionäre Übernahme von Myelin ist ein Schlüsselprozess bei sensorischen, motorischen und kognitiven Funktionen und die Störung der Interaktion zwischen Axone und Gliazellen ist zunehmend als Beitrag zu den Entwicklungsstörungen oder erworbenen neurologischen Krankheiten-9.
Myelin Zusammensetzung hat geprägt, mit der Besonderheit eines hohen Anteils von Lipiden (70 %) im Vergleich zu Proteine (30 %) im Gegensatz zu anderen zellularen Membranen10. Allerdings sind die meisten der Myelin Proteine im Gegensatz zu Myelin Lipide spezifisch für Myelin, einschließlich Myelin basic Protein (MBP), Proteolipid-Protein (PLP), 2', 3'-cyclic Nucleotide 3'-Phosphodiesterase (CNP), Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG), Myelin-Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG), PMP-22 und P010. Verschiedenen histologische Methoden Myelin Fleck gibt es anhand seiner Lipidzusammensetzung wie Luxol schnell blau11, Sudan schwarz B12, Bakers Säure Hematin Methode13, sowie Silber Färbung14. Dennoch lassen diese Ansätze nicht immer für einen ausreichenden Kontrast und Auflösung, Einzelfasern zu visualisieren. Ein alternativer Ansatz zur Erkennung von Myelin ist durch Immunhistochemie gegen Myelin Proteine gerichtet. Verschiedene Antikörper gezielt Myelin-spezifische Antigene mit hoher Spezifität und können routinemäßig verwendet werden, um Markhaltige Strukturen zu erkennen. Die Antikörper-Antigen-Interaktion kann weiter aufgedeckt werden, dass mit einem sekundären Antikörper gekoppelt an ein Fluorophor gegen den Primärantikörper gerichtet und mit angemessenen Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Hier beschreiben wir eine immunchemische Protokoll um Myelin auf ex Vivo zerebelläre Scheiben, ein Modell zu beflecken, ermöglicht eine gute Erhaltung der Architektur des Nervengewebes. Darüber hinaus die Organisation und die Größe von den Purkinje-Zellen (die einzige Markhaltige Neuronen des Kleinhirns) machen sie ein klassisches Modell für elektrophysiologische Untersuchungen und sie sind ebenso ideal, feste oder live-Imaging-Untersuchungen durchzuführen.
Die zerebelläre Scheiben entstehen von P9 P10 Mäusen, eine Zeit entspricht dem frühen Beginn der Purkinje Zelle Myelinisierung, ein Prozess, der vor allem durch eine Woche ex Vivo (ca. 6-7 Tage in-vitro-DIV)15erreicht wird. Darüber hinaus ist dieses Modell angepasst, demyelinisierende Erkrankungen wie der multiplen Sklerose (MS), zu untersuchen, wie eine umfangreiche Demyelinisierung im Kleinhirn Scheiben mit der Myelinotoxic Verbindung Lysophosphatidylcholine (oder Lysolecithin, LPC), induziert werden kann dem folgt eine spontane Remyelinisierung16,17. Endogene Remyelinisierung findet statt von zwei Tagen nach der LPC-Entfernung aus dem Kulturmedium und ist fast eine Woche nach der Behandlung vollständig.
Die Vollendung dieses Protokolls dauert ca. 3 Wochen, einschließlich einen halben Tag lang zerebelläre Slice Kulturen Vorbereitung, eine Woche völlig Markhaltige Scheiben, gefolgt von 2 Tagen auf dem Gipfel der Demyelinisierung zu erhalten und eine weitere Woche für ihre volle Remyelinisierung. Darüber hinaus kann Immunohistochemistry in 2 Tagen abgeschlossen sein. Das hier beschriebene Protokoll ist ein standard Wurf von 6 Mäusen Welpen angepasst und hinsichtlich der Anzahl der für das geplante Experiment verwendeten Tiere angepasst werden muss.
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Protocol
Alle Arbeiten im Zusammenhang mit Tieren eingehalten werden institutionelle und die UPMC INSERM und Französisch und der Europäischen Gemeinschaftsrichtlinie 86/609/EWG festgelegten Richtlinien.
1. Vorbereitung des Kulturmediums und Kultur fügt (Hands-on-Zeit ≈ 10 – 15 min.)
Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem Fluss-Kultur-Abzug unter sterilen Bedingungen
- Bereiten Sie 40 mL Kulturmedium, bestehend aus 50 % BME, 25 % Hank ausgewogen Salzlösung (1 X), 25 % Hitze-inaktivierten Pferd Serum, ergänzt mit 2 mM Glutamin-Derivat, 100 IU/mL Penicillin-Streptomycin und 4,5 mg/mL D-Glucose. Den pH-Wert 7,4 einstellen.
- Sterilisieren Sie Filter-das Medium durch einen 0,22 μm-Filter auf eine 50 mL Kunststoffspritze angepasst.
Hinweis: Kulturmedium kann mindestens eine Woche bei 4 ° C aufbewahrt werden. - Verwenden Sie für ein standard Wurf von 6 Welpen zwei sterile 6-Well-Platten. Entfernen Sie für jede Platte die Abdeckung und 1 mL Kulturmedium pro Bohrloch.
- Legen Sie eine Kultur-Einsatz in jedem einzelnen Brunnen halten die Kunststoffkante mit der sterilen Pinzette. Setzen Sie die Abdeckung wieder auf die Platte.
Hinweis: Die zerebelläre Scheiben gesammelt von einem Welpen (6-8) können auf zwei Membranen (3-4 zerebelläre Scheiben pro Membran einfügen) versendet werden.
2. Vorbereitung der Dissektion Medium (Hands-on-Zeit ≈ 5 min)
Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem Fluss-Kultur-Abzug unter sterilen Bedingungen
- Bereiten Sie 100 mL Dissektion Medium, bestehend aus Gey Balanced Salzlösung mit 4,5 mg/mL D-Glucose und 1 X Penicillin-Streptomycin (100 IE/mL) ergänzt.
- Sterilisieren Sie Filter-das Medium durch einen 0,22-μm-Filter-Einheit.
Hinweis: Die Dissektion Medium kann bei 4 ° C für mindestens einen Monat gespeichert. - Fügen Sie 5 mL kalte Dissektion Medium in 60 mm Zelle Kultur Gerichte. Bereiten Sie ein 60 mm Zelle Kulturschale für jeden Welpen sich seziert werden.
- Halten Sie die Dissektion Gerichte auf dem Eis bis zur Verwendung.
3. Vorbereitung der Dissektion Material (Hands-on-Zeit ≈ 15 min)
- Reinigen Sie die Bank mit 100 % Ethanol.
- Sterilisieren Sie alle Dissektion Werkzeuge, eine Rasierklinge und der Gewebe Chopper Kunststoff Plattform mit 100 % Ethanol.
- Beheben Sie die Rasierklinge und die Kunststoff-Plattform auf der Gewebe-Chopper zu, und passen Sie die Schnittstärke bis 300 µm.
- Stellen Sie sicher, dass das Ethanol verdampft ist, vor Beginn der Dissektion.
4. CerebellumDissection und Abschnitte Vorbereitung (Hands-on-Zeit ≈ 15 – 20 min pro Tier)
- Platzieren Sie eines der 60 mm Zelle Kultur Gerichte mit dem eiskalten Dissektion Medium unter dem Binokular und entfernen Sie die obere Platte.
- Tupfer Kopf Fell mit 70 % Ethanol (sorgfältig vermeiden, berühren Sie die Augen des Tieres) und das Tier mit großen scharfen Schere, entsprechend dem genehmigten Verfahren zu enthaupten.
Hinweis: Die zerebelläre Scheiben werden aus P9 P10 Mäuse ohne spezifische Sex oder Belastung Vorspannung erzeugt. - Verwenden Sie kleine Schere, schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie des Kopfes vom Hals ab und hinauf zu den Maus-Schnauze.
- Um den Kopf halten und setzen den Schädel, Klappen Sie die Haut ventral unter dem Kopf, und drücken Sie die zwei Falten der Haut zwischen den Fingern.
- Legen Sie die kleine Schere sanft in das Foramen Magnum und schneiden Sie den Schädel mit einer seitlichen Schnitt in Richtung der Seite und schneiden Sie dann rund um den Kopf Schädel. Halten Sie die Spitze der Schere als Parallel und in der Nähe der Schädel wie möglich beim Schneiden, um eine Beschädigung des Gehirngewebes.
- Abrufen des dorsalen Teiles des Schädels mit Fine-gerade Pinzette. Beim vorsichtig anheben des dorsalen Teiles des Schädels, schneiden die anhaftenden Hirnhaut (transluzente bewässerten Membran umgibt das Hirngewebe) ggf. mit einer kleinen Schere zu beschädigen das Hirngewebe.
- Bildenden Geraden Zange vorsichtig einführen (oder alternativ mit einem Spatel) zwischen den ventralen Schädel und das Gehirn, sanft das Gehirn ausflippen und Optik und Trigeminal Nerven mit einer kleinen Schere schneiden.
- Helfen Sie dem Gehirn, fallen durch die Schwerkraft in der 60 mm Zelle Kulturschale mit eiskalten Dissektion Medium durch den Kopf direkt über die Schüssel auf den Kopf drehen und lassen Sie die letzten Verwachsungen mit einer kleinen Schere, wenn erforderlich.
- Mit feinen Pinzette, orientieren sich das Gehirn mit der dorsalen Seite gegenüber des Forschers und der Bauchseite liegen auf dem Boden der Schale.
- Unter dem Binokular verwenden der bildenden Geraden Zange zu immobilisieren das Gehirn auf der Seite des Vorderhirns und berühren das Hinterhirn, da es beschädigt werden könnte. Trennen Sie das Hinterhirn vom Rest des Gehirns (Vorder- und Mittelhirn, schematische Abbildung 1Aasehen), mit schönen geraden Pinzette. Um das Kleinhirn vom Rest der Hinterhirn zu trennen, verwenden die feine Pinzette, um zerebelläre fruchtbaren unter dem Kleinhirn zu schneiden (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Aa').
- Sobald das Kleinhirn isoliert ist, sorgfältig reißen Sie die Hirnhaut mit Fine-gerade Pinzette (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Aa').
- Das Kleinhirn sanft mit der feinen gebogenen Zange halten und legen es mit der dorsalen Seite nach oben auf die Kunststoff-Plattform senkrecht zur Rasierklinge Chopper (siehe schematische Abbildung 1Bb).
- Überschüssiges Öl abzusaugen Dissektion Medium rund um das Kleinhirn mit einer sterilen dünn-End Pipettenspitze angepasst auf 1 mL pipette (siehe schematische Abbildung 1Bb).
- Sicherstellen Sie, dass das Kleinhirn flach liegt, aber ist nicht gedehnt wird, einmal auf die Plattform zu optimalen sagittale Scheiben während Stationspunkte (siehe schematische auf Abbildung 1Bb) gelegt.
- Scheibe 300 μm dicken sagittale Abschnitte des Kleinhirns mit Gewebe-Chopper (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Bb'). Die Kraft und die Geschwindigkeit des Messers müssen vor Ort optimiert werden.
- Vorsichtig einen Tropfen der Dissektion Medium auf die in Scheiben geschnittenen Kleinhirn. Verwenden eine weite Bohrung Pipettenspitze platziert auf einer 1-mL-Pipette, langsam aspirieren Sie die in Scheiben geschnittenen Kleinhirn und zurück in die 60 mm Zelle Kulturschale mit eiskalten Dissektion Medium zu übertragen (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Bb'').
- Reinigen Sie die Gewebe Chopper Kunststoff Plattform mit 100 % Ethanol zwischen jedes Kleinhirn schneiden. Lassen Sie das Ethanol verdunsten kann, bevor das nächste Kleinhirn auf der Plattform platzieren.
- Verwenden Sie zwei bildenden Geraden Zange (oder alternativ Titan-Nadeln) um einzelne Segmente zu trennen und die Vermis 6-8 Scheiben auswählen (siehe schematische Abbildung 1Cc und 1Cc').
- Nehmen Sie eine 6-Well-Platte mit Kultur-Einsätze und bis zu 4 ausgewählten Scheiben auf einer Kultur einfügen zusammen mit einigen Dissektion Medium, mit einer weiten Bohrung Pipettenspitze angepasst auf einer 1-mL-Pipette (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Cc').
- Legen Sie die Scheiben in der Mitte der Kultur einfügen mit Hilfe der Dissektion Medium oder Zangen drücken und ziehen sie sanft in die richtige Position, sie miteinander in Kontakt sein zu vermeiden (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Cc').
- Entfernen Sie überschüssiges Dissektion Medium um die Scheiben mit einem dünnen Ende Pipettenspitze. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben flach auf der Membran liegen (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Cc').
- Platz 6-Well-Platte in den Brutkasten sofort nach dem Hinzufügen der Scheiben auf der Membran.
5. Scheiben Kultur und Demyelinisierung (Hands-on-Zeit ≈ 15 – 20 min.)
Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem Fluss-Kultur-Abzug unter sterilen Bedingungen
- Ersetzen Sie das Kulturmedium mit 1 mL pro Bohrloch vorgewärmt und gepufferten frisches Kulturmedium alle 3 Tage nach der Herstellung der Scheibe.
- Entfernen Sie für Demyelinisierung alle Kulturmedium unten die Kultur nach 6 Tagen in vitro (DIV) fügt zu und ersetzen Sie es mit 1 mL pro Bohrloch vorgewärmte frische Kulturmedium enthaltend 0,5 mg/mL LPC. 15-17 h bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.
- Waschen Sie nach der Inkubation die Einsätze indem man sie in einer 25 mm Petrischale mit 1 mL vorgewärmten Kulturmedium.
Hinweis: Die Einsätze sollte mit dem Medium in Kontakt, aber nicht von ihr abgedeckt werden. - Sofortüberweisung die Kultur-Einsätze in eine neue 6-Well-Platte mit frischen vorgewärmten Kulturmedium.
- Ersetzen Sie das Kulturmedium mit 1 mL vorgewärmten frisches Kulturmedium alle 2-3 Tage bis Scheiben Fixierung.
6. Immunohistochemistry (Hands-on-Zeit ≈ 01:30 – 2 h)
Hinweis: Führen Sie die Schritte 6.1. 6.3. unter einem Abzug. Vermeiden Sie Exposition gegenüber Paraformaldehyd (PFA) und beziehen sich auf die Produkt-Sicherheitsdatenblatt für angemessene Manipulation und Schutz.
- Verwendung Zangen, jede Kultur heben fügt halten die Kunststoffkante und entfernen Sie das Kulturmedium unter der Membran-Einsätze aus jedem Brunnen.
- Fix die zerebelläre Scheiben für 30 min durch Zugabe von 2 mL 4 % PFA in 1 x PBS pH-Wert 7,4 auf die Membran-Einsätze.
Hinweis: Der Zeitpunkt der Fixierung richtet sich nach der Stufe der Myelinisierung studierte: 4 DIV entspricht dem Beginn der Myelinisierung, 7 DIV, um völlig Markhaltige Scheiben. Im Falle von LPC Behandlung entspricht 9 DIV auf den Gipfel der Demyelinisierung, 11 DIV zu Beginn der Remyelinisierung und 14 DIV, um voll Remyelinated Scheiben. - Waschen Sie die Einsätze mit den Scheiben dreimal mit 2 mL 1 X PBS 10 min. lang.
- Trennen Sie die Scheiben von der Membran-Einsätze unter dem Binokular mit einer 25 X 30 X Vergrößerung, durch leichten Druck mit einem Skalpell oder einer Bürste. Alternativ um das Risiko einer Beschädigung der Scheiben beim trennen sie von der Membrane zu vermeiden, können Sie ein Skalpell schneiden Sie die Membran mit den Scheiben noch befestigt.
- Übertragen Sie die schwimmenden Scheiben in die Vertiefungen einer 4-Well-Platte mit 1 X PBS, mit einem Pinsel.
- Aspirieren der PBS aus jedem Brunnen und die Scheiben in vorgekühlte 100 % Ethanol bei-20 ° C für 15 bis 20 min inkubieren. Dieser Schritt erleichtert das Eindringen der Antikörper in Markhaltige Fasern.
- Aspirieren Sie die 100 % Ethanol und waschen Sie einmal kurz mit 1 x PBS, dann zweimal mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren der PBS und inkubieren Sie die Scheiben für 30 bis 45 Minuten mit einer Lösung mit 1 x PBS, 5 % NGS, 0,3 % nicht-ionische Waschmittel bei Raumtemperatur, unspezifische Antikörper Fixierung Seiten zu sperren.
- Aspirieren Sie die blockierende Lösung. Keine Waschmaschine ist notwendig.
- Inkubieren Sie die Scheiben über Nacht mit dem primären Antikörper verdünnt in blocking-Lösung bei 4 ° c Um das Myelin auf zerebelläre organotypischen Scheiben zu visualisieren, zu verwenden, MBP (Huhn, 1/150 oder Maus IGg2b, Smi99, 1/200) oder PLP (Ratte, Hybridom, 1/5 bis 1/10) Antikörper.
Hinweis: Um den Ausdruck von mehr als einem Antigen in der gleichen Scheibe sichtbar zu machen, führen Sie ein Doppel- oder dreifach Färbeverfahren (siehe Abbildung 1 als Beispiel). Um die Inkubation gleichzeitig ausführen, sicherstellen Sie, dass primäre Antikörper in verschiedenen Arten hergestellt werden. Verwenden Sie dann ihre entsprechende sekundäre Antikörper gekoppelt an verschiedenen Fluorophore (siehe Tabelle der Materialien für Knoten- und Paranodal Marker18 Antikörper). - Am zweiten Tag waschen Sie die Scheiben dreimal mit 1 X PBS-Puffer für 10 min.
- 3h mit der Sekundärantikörper verdünnt in blocking-Lösung (Verdünnung 1: 500) im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Optimierung der Antikörper Verdünnung und Inkubation Zeit kann erforderlich sein, wenn andere Antikörper als beschrieben hier verwenden. - Waschen Sie die Scheiben dreimal mit 1 X PBS-Puffer für 10 min in der Dunkelheit.
- Montieren Sie unter einem Binokular die Scheiben auf einen Objektträger. 100 µL 1 X PBS auf der Folie platzieren und die Scheiben in die PBS mit einem Pinsel übertragen. Entfalten Sie die Scheiben zu, wenn nötig und glätten sie auf der Folie. Entfernen Sie überschüssiges Öl von PBS. Für den Fall, dass die Immunolabeling mit den Scheiben noch angebracht Membranen durchgeführt wird, mit der Scheiben mit Blick auf das Deckglas mit der Membran auf den Objektträger zu montieren.
- Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium direkt auf das Glas Deckglas und decken Sie sanft die Scheiben zu. Gerahmte Dias können mehrere Monate bei 4 ° C im Dunkeln aufbewahrt werden.
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Representative Results
Beispiele für repräsentative Myelin Immunostainings in organotypischen zerebelläre Scheiben von P9 P10 C57black6 Wildtyp (WT) (Abbildung 2A), sowie PLP-GFP transgene Mäuse (Abb. 2 b), zusammen mit Purkinje-Zellen, die Färbung erhalten. Zerebelläre Scheiben von der weißen Substanz myelinisieren verfolgt Region der Scheiben in Richtung der Peripherie der Folia und Myelinisierung der Purkinje-Zellen erfolgt meist nach 6 bis 7 DIV. Bei 7 DIV ist die Induktion von einem vollen Demyelinisierung durch LPC Behandlung (Abbildung 2Ci-Ii) möglich. Folgenden Demyelinisierung, die Scheiben spontan Remyelinate und sind voll Remyelinated 6-7 Tage nach dem Höhepunkt der Demyelinisierung (Abbildung 2Ciii).
Abbildung 1: Abbildung des Kleinhirns Scheiben Generation. Die Dissektion gliedert sich in drei Schritten. (A) das Kleinhirn ist isoliert und die Hirnhaut entfernt (Schritte 4.10 und 4.11). (B) das Kleinhirn ist dann auf der Chopper-Plattform übertragen und in Scheiben geschnitten (Schritte 4.12, 4.16). (C) schließlich, die Scheiben sind aus der Vermis isoliert und platziert auf einer Membran einfügen. Die Dissektion Medium übertragen mit der Scheiben wird entfernt und der 6-Well-Platte befindet sich in den Brutschrank (Schritte 4.18 und 4,22). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beispiel für Markhaltige zerebelläre Scheiben ex Vivo kultiviert. Bild-Stacks (orthogonale Projektion) wurden mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop nach frei schwebenden Immunolabeling und flache Montage wie im Protokoll beschrieben. Die Scheiben sind robust Markhaltige bei 11 DIV (A, PLP; B, GFP in grün) und der axonalen Domänen werden zusammengebaut, als in-vivo mit Knoten von Ranvier bereichert in Voltage-gated Natriumkanäle (NaV, rot) flankiert von den Paranodal Axoglial Junction Domäne (Caspr, in weiß) in C57black6 WT (A beobachtet ) sowie PLP-GLP (B) transgene Mäuse Scheiben. (C) die zerebelläre Cortex-Architektur ist in der kultivierten Scheiben, erhalten, wie auf zerebelläre Scheiben von PLP-GFP Mäusen beobachtet. (ich) Purkinje Zellen Axon (Calbindin, Calb, blau) sind robust Markhaltige (GFP, grün) nach einer Woche in Kultur. (Ii) LPC Behandlung voll demyelinates Scheiben, welche Remyelinate spontan und sind vollständig Remyelinated 6 Tage Post Demyelinisierung (Iii, 14 DIV). Skalieren von Balken = 20 µm (A, B); 100 µm (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier wir ausführlich ein Protokoll zum Generieren einer Ex Vivo Modell entspricht der Maus zerebelläre organotypischen Slice Kulturen adaptiert von zuvor veröffentlichten Methoden15,16,19 und das anschließende Myelin Immunostaining dieser Präparate. Diese Strategie bietet die Möglichkeit, Myelin-Komponenten mit einem hochauflösenden in gesunden und pathologischen Zuständen zu visualisieren.
Zerebelläre organotypischen Slice Kulturen entnommen 10 Tage alte Mäuse sind ein gut etabliertes experimentelles Modell, molekulare und zelluläre Mechanismen, die Myelinisierung und Remyelinisierung Prozesse zu untersuchen, da es erlaubt um zu reproduzieren die meisten anatomischen und Funktionalitäten des entsprechenden Gewebes in vivo, darunter nicht nur die Erhaltung der eine wohldefinierte zellulären Architektur, sondern auch die Reifung Chronik17. Darüber hinaus zerebelläre Scheiben haben eine erhaltene architektonische Organisation nach zwei Wochen in-vitro- (Abbildung 1). Die transgenen PLP-GFP-Belastung ist eine Alternative, ermöglichen, insbesondere um den Myelinisierung Status unter einem fluoreszierenden Binokular auf live Scheiben zu beobachten, das ist besonders praktisch für Demyelinisierung Remyelinisierung Studien (Abbildung 1 ).
Diese Präparate sind von besonderem Interesse eine schnelle Annäherung an Myelinisierung-Rate mit der entwickelte automatisierte Quantifizierung, einschließlich Western-Blot Analyse20, CNPase Assay16 oder Quantifizierung der PLP/Calbindin beurteilen (oder MBP / Calbindin) Färbung17,21, stellvertretend für ein Hochdurchsatz-System für die Prüfung von pharmakologischen Medikamenten in demyelinisierenden Erkrankungen22,23.
Eine der wichtigsten kritischen Fragen bei der Durchführung dieser Experimente beziehen sich möglicherweise auf die Qualität der zerebelläre Scheiben. Erstens ist das Alter von Mäusen für zerebelläre organotypischen Slice Kulturen von Bedeutung. Das Überleben der Purkinje-Zellen, die nur Markhaltige Neuronen im Kleinhirn Kulturen ist gefährdet, wenn Kulturen von P2 bis P7 Nagetiere oder mit Gebern älter als P1317hergestellt werden. Ganz allgemein sind organotypischen Gehirn Slice Kulturen schwierig, von den erwachsenen Tieren zu erhalten. Zweitens, die Dauer der Verarbeitung der Gewebe während der Präparation ist von entscheidender Bedeutung, führt als eine Dissektion von mehr als 15-20 Minuten pro Tier zu einem Rückgang der Überlebensrate der Scheiben. Darüber hinaus ist es bei der Auswahl der Scheiben, kultiviert werden, am besten zu vermeiden, die von beiden Enden des Kleinhirns aufgrund der schlechten Überleben von Neuronen und daraus resultierende Knappheit Markhaltige Fasern mit.
Andere Parameter wie die Stabilität der Temperatur und CO2 -Konzentration in der Kultur sind ausschlaggebend um Scheibe Gesundheit zu gewährleisten. Zu guter Letzt wird die Qualität der Scheiben durch die Zusammensetzung des Serums Pferd beeinflusst, die von den Benutzern gesteuert werden können. Testen mehrerer Chargen des Serums wird daher dringend empfohlen.
Um eine ausreichende Kennzeichnung zu erhalten, ist Gewebe Fixierung ein wichtiger Schritt. Um das Eindringen von den Antikörpern gegen Myelin-Antigene, zu erreichen zu erleichtern, wie Myelin eine sehr kompakte Struktur ist, empfiehlt Scheiben Vorbehandlung mit absoluten Ethanol nach Fixierung. Ein ähnliches Protokoll der Färbung kann weiter auf in Vivo festen Geweben angewendet werden, obwohl Triton Konzentration die Dicke der Vibratome angepasst werden müssen kann oder Kryostat in-vivo Abschnitte erzeugt. Die Verfügbarkeit von nicht-kommerziellen Antikörper sollten berücksichtigt werden. Vorbereitung von Scheiben aus transgenen Mäuse z. B. PLP-GFP24 oder CNP-GFP25 stellt somit eine Alternative zu Myelin und Oligodendrozyten Prozesse zu visualisieren.
Zusätzlich zu den in diesem Protokoll beschriebenen immunchemische Methoden sind andere Ansätze gebräuchlich Myelin Architektur zu studieren. Ergänzende Techniken gibt es auch um Myelin Ultrastruktur mit Elektronenmikroskopie wird der Gold-Standard-26zu untersuchen. Andere Techniken vorhanden sind, z. B. markierungsfreie Ansätze unter anderem optische Kohärenz Tomographie27,28, Raman-Streuung28,29, dritte harmonische Generation30 oder spektrale konfokalen Reflexion-Mikroskopie-31; Diese Ansätze haben den zusätzlichen Vorteil die Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse zu ermöglichen. Jedoch einige dieser Techniken sind komplex und erfordern weitere State-of-the-Art-Mikroskopie-Set-ups. Aus diesen Gründen bleibt Myelin Studie durch Immunfluoreszenz beschriften einen Standardansatz Myelinisierung und seinen Mängeln in verschiedenen Entwicklungs- oder erworbenen Erkrankungen und ihre Modelle zu untersuchen sowie die Möglichkeiten der Zukunft therapeutische einschätzen Behandlungen. Es kann weiter zur Untersuchung Myelinisierung in mehreren Kontexten, wie lernen und Plastizität, als auch Altern, Depression oder Autismus in der Myelin zu veränderten32bekannt ist.
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Disclosures
Die Autoren keine konkurrierenden Interessen oder widersprüchliche Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon und Dr. Thomas Roux für wertvolle Hinweise auf das Manuskript. Diese Arbeit wurde finanziert durch INSERM, ICM, ARSEP Zuschüsse R13123DD, ANR R17127DD (bis n. Chr.) und FRM Fellowship, SPF20110421435 (zu n. Chr.), FDT20170437332 (zu M.T.). Wir danken die CELIS-Zelle-Kultur-Anlage und das Icm. Quant Bildgebungsplattform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60 mm and 100 mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 mm x 26 mm x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
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- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
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