Summary
Her vil vi præsentere en metode til at forberede organotypic skive kulturer fra mus lillehjernen og myelinskeden farvning af Immunhistokemi egnet til at undersøge mekanismerne i myelination og remyelination i det centrale nervesystem.
Abstract
I nervesystemet er myelin en kompleks membran struktur genereret af myelinating glial celler, hvilket ensheathes axoner og letter hurtigt elektriske overledning. Myelin ændring har vist sig at forekomme i forskellige neurologiske sygdomme, hvor det er forbundet med funktionelle mangler. Her vi give en detaljeret beskrivelse af en ex vivo model bestående af mus organotypic cerebellare skiver, som kan opretholdes i kultur i flere uger og yderligere være mærket for at visualisere myelin.
Introduction
Neuroner er særdeles polariseret celler, der omfatter en somato-dendritiske rum, der modtager input fra sine omgivelser og et axon, som sikrer, at den generation og udbredelsen af elektriske impulser til andre celler. Hurtige formering og rettidig levering af oplysninger er afgørende for et velfungerende nervesystem. I hvirveldyr, er det lettere ved myelination, som giver mulighed for øget cytoskeletale overledning hastighed1. Myelin er en specialiseret struktur dannes af sammenpresset lag af plasma membran genereret af myelinating glia, nemlig oligodendrocytes i centralnervesystemet (CNS) og Schwann celler i det perifere nervesystem (PNS). Både i CNS og PNS, axoglial interaktioner drive dannelsen af specialiserede cytoskeletale domæner: noder af Ranvier og deres omgivende domæner, paranodes og juxtaparanodes2. De cytoskeletale segmenter isoleret af myelin, eller stængelled, suppleant med noder af Ranvier, som svarer til små unmyelinated domæner beriget med spænding-gated natrium kanaler (Nav). Høj koncentration og hurtig aktivering af Nav kanaler på noder af Ranvier tillade regenerering af handling potentialer, og sammen med de isolerende egenskaber af myelin skeder, sikre effektiv og hurtig saltatory overledning af den nerve impuls langs axon3.
Ud over sin rolle i accelererende nerve impuls overledning hastighed, giver myelinating glia metaboliske støtte til axon, bevare dens langsigtede integritet og deltage i dets overlevelse4,5. Derudover er det blevet klart i de seneste år at myelin dynamisk moduleres hele livet, således formentlig deltager i forordningen og plasticitet af forskellige nervesystem funktioner. Justeringer af fordeling, antal, længde og tykkelse af myelin skeder langs axoner kan således repræsenterer en roman fint tune forskellige netværk6,7,8. Derfor, den evolutionære erhvervelse af myelin er en central proces for sensoriske, motoriske og kognitive funktioner og den undertrykkelse af netbårne af samspillet mellem axoner og glia er i stigende grad betragtes som et bidrag til den udviklingsmæssige eller erhvervede neurologiske sygdomme9.
Myelin sammensætning er blevet karakteriseret, med det specifikke ved en høj andel af lipider (70%) i forhold til proteiner (30%) i modsætning til andre cellulære membraner10. Men i modsætning til myelin lipider, de fleste af myelin proteiner er specifikke for myelin, herunder myelin grundlæggende protein (MBPS), proteolipid protein (PLP), 2', 3'-cyklisk nukleotid 3'-phosphodiesterase (CNP), myelin-associerede glycoprotein (MAG), myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG), PMP-22 og P010. Forskellige histologiske metoder at plette myelin findes baseret på lipid sammensætning, såsom Luxol hurtigt blå11, Sudan Black B12, Bakers syre hematin metode13, samt sølvfarvning14. Ikke desto mindre mulighed disse metoder ikke altid for en passende kontrast og opløsning til at visualisere enkelte fibre. En alternativ fremgangsmåde til at registrere myelin er gennem Immunhistokemi rettet mod myelin proteiner. Forskellige antistoffer rettet mod myelin-specifikke antigener med en høj specificitet og kan bruges rutinemæssigt til at opdage myelinerede strukturer. Antigen-antistof interaktion kan afsløres yderligere, ved hjælp af en sekundær antistof koblet til en fluorophore rettet mod de primære antistof og visualiseret med passende Fluorescens mikroskopi. Her, beskriver vi en immunokemisk protokol for at plette myelin på ex vivo cerebellare skiver, en model, som giver mulighed for en god konservering af nervevæv arkitektur. Derudover organisation og størrelse af Purkinje celler (den eneste myelinerede neuron af lillehjernen) gør dem et klassisk model for elektrofysiologiske undersøgelser og de er ligeledes ideel til at udføre fast eller live imaging studier.
De cerebellare skiver er genereret fra P9-P10 mus, gangen svarer til den tidlige start af Purkinje celle myelination, en proces, der opnås for det meste af en uge ex vivo (6-7 dage in vitro DIV)15. Endvidere, denne model er tilpasset til at undersøge demyeliniserende lidelser som multipel sklerose (MS), som en omfattende demyelinering kan være fremkaldt i cerebellare skiver ved hjælp af myelinotoxic sammensatte lysophosphatidylcholine (eller lysolecithin, LPC), som er efterfulgt af en spontan remyelination16,17. Endogene remyelination finder sted fra to dage efter LPC fjernelse af næringssubstratet og er næsten komplet efterbehandling en uge.
Gennemførelsen af denne protokol tager ca 3 uger, herunder en halv dag til cerebellare skive kulturer forberedelse, en uge til at opnå fuldt myelinerede skiver, efterfulgt af 2 dage at nå toppen af demyelinering og endnu en uge for deres fulde remyelination. Derudover kan Immunhistokemi være afsluttet i 2 dage. Protokollen beskrevet her er tilpasset et standard kuld af 6 mus unger og tilpasses med hensyn til antallet af dyr, der anvendes til de planlagte eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt arbejde, der involverer dyr overholdt institutionelle politikker og retningslinier som den UPMC, INSERM og de franske og europæiske EF Rådets direktiv 86/609/EØF.
1. forberedelse af dyrkningsmediet og kultur indsætter (Hands-on tid ≈ 10 – 15 min)
Bemærk: Udføre dette trin i et flow kultur hood under sterile betingelser
- Forberede 40 mL af næringssubstratet, som består af 50% BME, 25% Hank afbalanceret saltopløsning (1 x), 25% varme-inaktiverede hest serum, suppleret med 2 mM glutamin derivat, 100 IE/mL penicillin-streptomycin og 4,5 mg/mL D-Glucose. PH indstilles til 7,4.
- Filter-sterilisere medium gennem et 0,22 μm filter tilpasses på en 50 mL plastik sprøjte.
Bemærk: Næringssubstratet kan opbevares ved 4 ° C i mindst en uge. - For en standard kuld på 6 unger, bruge to sterile 6-godt plader. For hver plade, Fjern dækslet og tilsættes 1 mL af næringssubstratet pr. brønd.
- Sted én kultur Indsæt til hver enkelt brønd ved at holde plastic kanten med steril pincet. Sæt dækslet tilbage på pladen.
Bemærk: Cerebellare skiverne er indsamlet fra en hvalp (6-8) kan sendes på to membraner (3-4 cerebellare skiver pr. membran Indsæt).
2. forberedelse af dissektion Medium (Hands-on tid ≈ 5 min)
Bemærk: Udføre dette trin i et flow kultur hood under sterile betingelser
- Forberede 100 mL af dissektion medium, som består af Geys afbalanceret saltopløsning suppleret med 4,5 mg/mL D-Glucose og 1 x penicillin-streptomycin (100 IE/mL hver).
- Filter-sterilisere medium gennem et 0,22 μm filterenhed.
Bemærk: Dissektion medium kan opbevares ved 4 ° C i mindst en måned. - Der tilsættes 5 mL af kolde dissektion medium i 60 mm celle kultur retter. Forberede en 60 mm celle kultur parabol for hver hvalp at blive dissekeret.
- Holde dissektion retter på køl indtil brug.
3. forberedelse af dissektion materiale (Hands-on tid ≈ 15 min)
- Ren bænk med 100% ethanol.
- Sterilisere alle dissektion værktøjer, et barberblad og væv chopper plast platform med 100% ethanol.
- Lave barberblad og plast platformen på væv chopper og justere skære tykkelse til 300 µm.
- Kontroller, at alle ethanol er fordampet før du starter dissektion.
4. CerebellumDissection og sektioner forberedelse (Hands-on tid ≈ 15-20 min pr. dyr)
- Placer en af de 60 mm celle kultur retter der indeholder iskold dissektion medium under kikkert mikroskop og fjerne den øverste plade.
- Svaber hoved pels med 70% ethanol (omhyggeligt undgår at røre øjne af dyret) og Hug hovedet af dyret ved hjælp af store skarpe saks, overensstemmelse med den godkendte procedure.
Bemærk: De cerebellare skiver er genereret fra P9-P10 mus uden specifikke sex eller stamme bias. - Bruge lille saks til at skære i huden langs midterlinjen af hovedet start fra nakken og går op til musen snude.
- For at holde hovedet og udsætte kraniet, fold tilbage huden ventrally under hovedet og knibe to folderne i huden mellem ens fingre.
- Indsæt den lille saks forsigtigt ind i foramen magnum og skære kraniet ved at gøre en lateral indsnit mod side og derefter skære hele vejen rundt hoved kraniet. Holde spidsen af saksen som parallel og tæt på kraniet som muligt mens der skæres, at undgå at beskadige hjernevæv.
- Hente den dorsale del af kraniet med bøde-lige pincet. Mens forsigtigt løftes den dorsale del af kraniet, skæres de vedhængende meninges (gennemskinnelige vandede membran omkringliggende hjernevæv) hvis det er nødvendigt med en lille saks til at undgå at beskadige hjernevæv.
- Omhyggeligt indføre bøde-lige pincet (eller alternativt bruge en spatel) mellem det ventrale kraniet og hjernen, forsigtigt flip ud hjernen og skære optik og trigeminus nerver med en lille saks.
- Hjælpe hjernen til at falde med tyngdekraften i 60 mm celle kultur skål indeholdende iskold dissektion medium ved at dreje hovedet hovedet lige over fadet og frigive de sidste sammenvoksninger med en lille saks, hvis nødvendigt.
- Bruger fine pincet, orientere hjernen med den dorsale side vender forskeren og den ventrale side liggende på bunden af skålen.
- Under den kikkert mikroskop, kan bruge bøde-lige pincet til at immobilisere hjernen i forhjernen side og undgå at berøre baghjernen, som det kunne blive beskadiget. Adskille baghjernen fra resten af hjernen (forgrunden- og midthjernen, se skematisk på figur 1Aa), ved hjælp af fine-straight pincet. For at adskille lillehjernen fra resten af baghjernen, bruge den fine pincet til at skære de cerebellare stilke nedenunder lillehjernen (Se skematisk på figur 1Aa').
- Når lillehjernen er isoleret, forsigtigt rive meninges ved hjælp af fine-straight pincet (Se skematisk på figur 1Aa').
- Hold lillehjernen forsigtigt med fint buet pincet og placere det med den dorsale side op på plastik platform vinkelret til chopper barberblad (Se skematisk på figur 1Bb).
- Suges overskydende af dissektion medium omkring lillehjernen ved hjælp af en steril tynd ende pipette spids tilpasset på en 1 mL pipetteres (Se skematisk på figur 1Bb).
- Sikre, at lillehjernen ligger fladt, men er ikke strakt, engang placeret på platformen til at få optimal sagittal skiver under skæring (Se skematisk på figur 1Bb).
- Skær 300 μm tykt sagittal sektioner af lillehjernen med væv chopper (Se skematisk på figur 1Bb'). Kraft og hastighed af bladet skal optimeres på stedet.
- Forsigtigt tilføje en dråbe af dissektion medium på en skiveskåret cerebellum. Bruger en wide-bore pipette tip placeret på 1 mL pipette, langsomt Opsug den skiveskåret cerebellum og overføre det tilbage i 60 mm celle kultur skål indeholdende iskold dissektion medium (Se skematisk på figur 1Bb'').
- Rense væv chopper plast platform med 100% ethanol mellem hver lillehjernen udskæring. Lad ethanol fordampe før markedsføring den næste lillehjernen på platformen.
- Bruge to fine-straight pincet (eller alternativt titanium nåle) for at adskille individuelle udsnit, og vælg 6-8 skiver vermis (Se skematisk på figur 1Cc og 1Cc').
- Tage en 6-godt plade med kultur skær og overføre op til 4 valgte skiver på én kultur Indsæt sammen med nogle dissektion medium, ved hjælp af en wide-bore pipette spids tilpasset på 1 mL pipette (Se skematisk på figur 1Cc').
- Placer skiver i midten af kultur Indsæt ved hjælp af dissektion medium eller pincet til at skubbe og trække dem forsigtigt i den rigtige placering, undgå dem for at være i kontakt med hinanden (Se skematisk på figur 1Cc').
- Fjern overskydende af dissektion medium omkring skiver ved hjælp af en tynd ende pipette tip. Sikre at skiverne lå fladt på membranen (Se skematisk på figur 1Cc').
- 6-godt pladen anbringes i rugemaskinen umiddelbart efter at have tilføjet skiver på membranen.
5. skiver kultur og demyelinering (Hands-on tid ≈ 15-20 min)
Bemærk: Udføre dette trin i et flow kultur hood under sterile betingelser
- Erstatte næringssubstratet med 1 mL pr. brønd af pre varmede og bufferet frisk næringssubstratet hver 3 dage efter skive forberedelse.
- For demyelinering, fjerne alle næringssubstratet nedenfor kultur indsætter efter 6 dage in vitro (DIV) og erstatte det med 1 mL pr. brønd af pre varmede frisk næringssubstratet indeholdende 0,5 mg/mL LPC. Inkuber i 15-17 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
- Efter inkubationen vaske indsætter ved at placere dem i en 25 mm petriskål indeholdende 1 mL af pre varmede næringssubstratet.
Bemærk: Indsætter bør være i kontakt med mediet, men ikke være omfattet af den. - Straks overføre kultur skær i en ny 6-godt plade der indeholder friske pre varmede næringssubstratet.
- Erstatte næringssubstratet med 1 mL af pre varmede frisk næringssubstratet hver 2-3 dage indtil skiver fiksation.
6. Immunhistokemi (Hands-on tid ≈ 1:30 – 2 h)
Bemærk: Udføre trin 6.1. til 6.3. under et stinkskab. Undgå redegørelsen til PARAFORMALDEHYD (PFA) og henvise til produktets sikkerhed dataark for passende manipulation og beskyttelse.
- Brug pincet til at løfte hver kultur indsætter ved at holde plastic kanten og fjerne næringssubstratet under membran skær fra hver brønd.
- Fastsætte de cerebellare skiver i 30 min. ved tilsætning 2 mL 4% PFA i 1 x PBS pH 7,4 på membran skær.
Bemærk: Tidspunkt for fiksering afhænger fase af myelination studerede: 4 DIV svarer til starten af myelination, 7 DIV fuldt myelinerede udsnit. I tilfælde af LPC behandling svarer 9 DIV til toppen af demyelinering, 11 DIV udbrud af remyelination og 14 DIV til fuldt remyelinated skiver. - Vask skær med skiver tre gange med 2 mL 1 x PBS i 10 min.
- Adskille skiver fra membran skær under kikkert mikroskop ved hjælp af en 25 x til 30 x forstørrelse, ved forsigtigt at skubbe dem ved hjælp af en skalpel eller en børste. Alternativt, for at undgå risikoen for at beskadige skiver mens løsrive dem fra membranen, bruge en skalpel til at skære membranen med skiverne er stadig fastgjort.
- Overføre de flydende skiver til huller i en 4-godt pladen indeholdende 1 x PBS, ved hjælp af en pensel.
- Opsug PBS fra hver brønd og Inkuber skiver i pre afkølede 100% ethanol ved-20 ° C i 15 til 20 min. Dette trin letter antistof penetration i myelinerede fibre.
- Opsug 100% ethanol og vask en gang kort med 1 x PBS, så to gange i 1 x PBS i 10 min ved stuetemperatur.
- Opsug PBS og inkuberes skiver for 30 til 45 min med en oploesning indeholdende 1 x PBS, 5% NGS, 0,3% nonionisk detergent ved stuetemperatur til at blokere ikke-specifikke antistof fiksering websteder.
- Opsug den blokerende løsning. Ingen vask er nødvendige.
- Inkuber skiver natten over med de primære antistoffer fortyndet i blokerende løsning ved 4 ° C. For at visualisere myelin på cerebellare organotypic skiver, bruge MBP (kylling, 1/150 eller mus IGg2b, Smi99, 1/200) eller PLP (rotte, hybridom, 1/5 til 1/10) antistoffer.
Bemærk: For at afsløre udtryk for mere end én antigen i den samme skive, udføre en dobbelt- eller triple farvning procedure (Se figur 1 som et eksempel). For at udføre inkubationen samtidigt, sikre primære antistoffer produceres i forskellige arter. Brug derefter deres tilsvarende sekundære antistoffer koblet til forskellige fluorophores (Se Tabel af materialer til nodal og paranodal markør18 antistoffer). - På andendagen, vaske skiver tre gange i 1 x PBS i 10 min.
- Inkuber i 3h med de sekundære antistoffer fortyndet i blokerende løsning (1/500 fortynding) i mørke ved stuetemperatur.
Bemærk: Optimering af antistof fortynding og inkubering tid kan være påkrævet, når du bruger andre antistoffer end de, der er beskrevet her. - Vask skiver tre gange i 1 x PBS i 10 min. i mørke.
- Under en kikkert mikroskop, montere skiver på et glas dias. 100 µL 1 x PBS på diaset og overføre skiver i PBS ved hjælp af en pensel. Udfolde skiver, hvis det er nødvendigt og tromle dem på diaset. Fjern overskydende af PBS. I tilfælde af immunolabeling er udført med skiverne er stadig knyttet til membraner, montere med skiver står coverslip med membran på glas dias.
- Anbring en dråbe af montering medium direkte på glas coverslip og forsigtigt dække skiver. Monterede dias kan opbevares i flere måneder ved 4 ° C i mørke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempler på repræsentative myelin immunostainings i organotypic cerebellare skiver fremstillet af P9-P10 C57black6 wild-type (WT) (figur 2A), samt PLP-normal god landbrugspraksis Transgene mus (figur 2B), sammen med Purkinje celler farvning. Cerebellare skiver myelinate fra den hvide substans spor region af skiver mod periferien af folia og myelination af cellerne, Purkinje opnås oftest efter 6-7 DIV. På 7 DIV er induktion af en fuld demyelinering muligt gennem LPC behandling (figur 2Ci-ii). Følgende demyelinering, skiver spontant remyelinate og er fuldt remyelinated 6-7 dage efter toppen af demyelinering (figur 2Ciii).
Fig. 1: Illustration af lillehjernen skiver generation. Dissektion er opdelt i tre hovedtrin. (A) lillehjernen er isoleret og meninges fjernet (trin 4.10 og 4.11). (B) lillehjernen overføres derefter til chopper platform og skiver (trin 4.12 til 4.16). (C) Endelig skiver er isoleret fra vermis og placeret på en membran indsætte. Dissektion medium overført med skiver er fjernet og 6-godt pladen placeres i inkubator (trin 4.18 og 4.22). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempel på myelinerede cerebellare skiver kulturperler ex vivo. Billedstakke (med iagttagelsesretning) blev opnået ved hjælp af en opretstående Konfokal mikroskop efter gratis flydende immunolabeling, flad montering som beskrevet i protokollen. Skiverne er håndfast myelinerede på 11 DIV (A, PLP; B, normal god landbrugspraksis i grøn) og de cytoskeletale domæner er samlet som observeret in vivo med noder af Ranvier beriget med spænding-gated natrium kanaler (Nav, i rød) flankeret af paranodal axoglial junction domæne (s, i hvidt) i C57black6 WT (A ) samt PLP-normal god landbrugspraksis (B) Transgene mus skiver. (C) den cerebellare cortex arkitektur er bevaret i de kulturperler skiver, som observeret på cerebellare skiver fra PLP-normal god landbrugspraksis mus. (jeg) Purkinje celler axon (Calbindin, Calb, i blå) er håndfast myelinerede (NGL, i grøn) efter en uge i kultur. (ii) LPC behandling fuldt demyelinates skiver, som remyelinate spontant og er fuldt remyelinated 6 dage post demyelinering (iii, 14 DIV). Skalere barer = 20 µm (A, B); 100 µm (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, vi detalje en protokol til at generere en ex vivo model svarer til musen cerebellare organotypic skive kulturer, tilpasset fra tidligere publicerede metoder15,16,19 , og den efterfølgende myelin immunfarvning af disse præparater. Denne strategi tilbyder mulighed for at visualisere myelin komponenter med en høj opløsning i både sunde og patologiske stater.
Cerebellare organotypic skive kulturer taget fra 10 dage gamle mus er en veletableret eksperimentel model til at undersøge molekylære og cellulære mekanismer bag myelination og remyelination processer, som det er muligt for at reproducere mest anatomiske og funktionelle elementer i den tilsvarende væv in vivo, herunder ikke kun at bevare en veldefineret cellulære arkitektur, men også modning tidslinje17. Derudover cerebellare skiver har en bevarede arkitektoniske organisation efter to uger in vitro- (figur 1 c). Den transgene PLP-normal god landbrugspraksis stamme er et alternativ, lade, navnlig, for at observere myelination status under en fluorescerende kikkert mikroskop på live skiver, som er særlig praktisk for demyelinering-remyelination studier (figur 1 c ).
Disse præparater er af særlig interesse som en hurtig metode til at vurdere myelination sats med den udviklede automatiseret kvantificering, herunder western-skamplet analyse20, CNPase assay16 eller kvantificering af PLP/Calbindin (eller MBP / Calbindin) farvning17,21, der således repræsenterer en høj overførselshastighed system giver mulighed for afprøvning af farmakologiske stoffer i demyeliniserende sygdomme22,23.
Et af de vigtigste kritiske spørgsmål når du udfører disse eksperimenter kan være relateret til kvaliteten af de cerebellare skiver. For det første er alder af mus af betydning for cerebellare organotypic skive kulturer. Overlevelse af Purkinje celler, kun myelinerede neuron i cerebellare kulturer, er kompromitteret hvis kulturer er fremstillet fra P2 til P7 gnavere eller med donorer ældre end P1317. Mere generelt er organotypic hjerne skive kulturer vanskeligt at opnå fra voksne dyr. For det andet væv behandlingen under dissektion af er kritisk, som en dissektion trin i mere end 15-20 minutter pr. dyr fører til et fald i overlevelsesraten for skiver. Desuden, når du vælger skiver at være kulturperler, det er bedst at undgå at bruge dem fra begge ender af lillehjernen på grund af den dårlige overlevelse af neuroner og deraf følgende knaphed på myelinerede fibre.
Andre parametre såsom temperatur og CO2 -koncentration i kultur stabilitet afgørende faktorer for skive sundhed. Endelig, kvaliteten af skiver er påvirket af sammensætningen af hest serum, som ikke kan kontrolleres af brugerne. Derfor er test flere partier af serum stærkt anbefales.
For at opnå en passende mærkning, er væv fiksering et vigtigt skridt. For at lette udbredelsen af antistoffer til at nå myelin antigener, som myelin er en meget kompakt struktur, tilrådes skiver forbehandling med absolut ethanol efter fiksering. En lignende protokol af farvning kan yderligere anvendes til i vivo faste væv, selvom Triton koncentration skal muligvis tilpasses til tykkelsen af vibratome eller kryostaten genereret in vivo sektioner. Tilgængeligheden af ikke-kommercielle antistoffer bør også overvejes. Forberede skiver fra Transgene mus som PLP-normal god landbrugspraksis24 eller CNP-normal god landbrugspraksis25 udgør således et alternativ til at visualisere myelin og oligodendrocytes processer.
Ud over de i denne protokol beskrevne immunokemisk metoder bruges andre tilgange almindeligvis til at undersøge myelin arkitektur. Supplerende teknikker findes også for at undersøge myelin ultrastruktur, med Elektron Mikroskopi er guldstandarden26. Andre teknikker findes, såsom etiket-gratis metoder herunder optisk kohærens tomografi27,28, Raman spredning28,29, tredje-harmonisk generation30 eller spektral Konfokal Reflektionsgraden mikroskopi31; disse tilgange har den ekstra fordel af at aktivere observation af dynamiske cellulære processer. Men nogle af disse teknikker er kompleks og kræver desuden state-of-the-art mikroskopi set-ups. Af disse grunde forbliver myelin undersøgelse ved immunfluorescens mærkning en standardmetode til at undersøge myelination og sine mangler i forskellige udviklingsmæssige eller erhvervede sygdomme og deres modeller, samt at vurdere potentialet i fremtiden terapeutiske behandlinger. Det kan yderligere bruges til at studere myelination i flere sammenhænge, såsom læring og plasticitet, samt aldring, depression eller autisme, hvor myelin er kendt for at være ændret32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har konkurrerende interesser eller modstridende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon og Dr. Thomas Roux for værdifulde kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af INSERM, ICM, ARSEP tilskud R13123DD, ANR R17127DD (til e.kr.) og FRM fellowship, SPF20110421435 (til e.kr.), FDT20170437332 (til M.T.). Vi takker CELIS celle kultur facilitet og icm. Quant imaging platform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60 mm and 100 mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 mm x 26 mm x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M.
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
