Summary
Hier presenteren we een methode ter voorbereiding organotypic segment culturen van muis cerebellum en myelineschede kleuring door immunohistochemistry geschikt voor onderzoek naar mechanismen van myelinisering en remyelination in het centrale zenuwstelsel.
Abstract
In het zenuwstelsel, de myeline is een complexe membraan structuur gegenereerd door myelinating gliale cellen, welke ensheathes axonen en vergemakkelijkt de snelle elektrische geleiding. Myeline wijziging heeft aangetoond dat het optreden in diverse neurologische aandoeningen, waar het wordt geassocieerd met functionele tekorten. Hier, wij bieden een gedetailleerde beschrijving van een ex vivo model bestaande uit muis organotypic cerebellaire segmenten, die kunnen worden gehandhaafd in cultuur voor verscheidene weken en verder worden aangeduid om te visualiseren van myeline.
Introduction
Neuronen zijn zeer gepolariseerde cellen, die bestaan uit een compartiment somato-dendritische die ingangen ontvangt van haar omgeving en een axon die zorgt voor de generatie en de verspreiding van elektrische impulsen naar andere cellen. Snelle voortplanting en tijdige levering van informatie is essentieel voor de goede werking van het zenuwstelsel. In gewervelde dieren, wordt het door de myelinisering, waardoor verhoging van axonale geleiding snelheid1vergemakkelijkt. Myeline is een gespecialiseerde structuur gevormd door samengeperste lagen van plasmamembraan gegenereerd door de myelinating-glia, namelijk oligodendrocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) en Schwann cellen in het perifere zenuwstelsel (PNS). Zowel in het centraal zenuwstelsel en de PNS, axoglial interacties rijden de vorming van gespecialiseerde axonale domeinen: de knooppunten van Ranvier en hun omliggende domeinen, de paranodes en juxtaparanodes2. De axonale segmenten geïsoleerd door myeline of groeispurt, afgewisseld met de knopen van Ranvier, die overeenkomen met kleine unmyelinated domeinen verrijkt in spanning-gated natrium kanalen (nbv). De hoge concentratie en het snelle activering van nbv kanalen op de knooppunten van Ranvier toestaan de regeneratie van de actie potentieel, en samen met de isolerende eigenschappen van de myeline omhulsels, zorgen voor de geleiding van het efficiënte en snelle saltatory van de zenuw impuls langs de axon3.
Naast haar rol bij het versnellen van de snelheid van de geleiding van de zenuw impuls, ondersteunt myelinating glia metabole de axon, behoud van de lange termijn integriteit en deelnemen aan haar overleving4,5. Bovendien, het is duidelijk geworden in de afgelopen jaren dat die myeline is dynamisch gemoduleerd gedurende het hele leven, dus vermoedelijk deel te nemen aan de verordening en de plasticiteit van de verschillende functies van het zenuwstelsel. Aanpassingen van de distributie, aantal, lengte en dikte van myeline omhulsels langs axonen kunnen dus een nieuwe manier om te fijn afstemmen van verschillende netwerken6,-7,8vormen. Dus, de evolutionaire verwerving van myeline is een belangrijke proces voor sensorische, motorische en cognitieve functies en de verstoring van de interactie tussen axonen en glia is steeds meer beschouwd als een bijdrage tot de ontwikkeling of verworven neurologische ziekten9.
Myeline samenstelling heeft gekenmerkt, met de specifieke functie van een hoog percentage van lipiden (70%) in vergelijking met eiwitten (30%) in tegenstelling tot andere cellulaire membranen10. In tegenstelling tot de myeline lipiden zijn meeste van myeline eiwitten echter specifiek voor myeline, met inbegrip van myeline basic protein (MBP), proteolipid eiwit (PLP), 2', 3'-cyclische nucleotide 3'-fosfodiësterase (NPM), myeline-geassocieerde glycoproteïne (MAG), myeline-Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG), PMP-22 en P010. Verschillende histologische methoden om vlek myeline bestaan op basis van de samenstelling van lipide, zoals snel blauwe Luxol11, Soedan zwart B12, Baker's zuur hematin methode13, evenals zilver14kleuring. Deze benaderingen doen echter niet altijd mogelijk voor een voldoende contrast en resolutie te visualiseren van individuele vezels. Een alternatieve benadering voor het detecteren van myeline is door middel van immunohistochemistry gericht tegen myeline eiwitten. Verschillende antilichamen richten van de myeline-specifieke antigenen met een hoge specificiteit en kunnen routinematig worden gebruikt voor het detecteren van myelinated structuren. De antilichaam-antigeen interactie kan verder worden onthuld met behulp van een secundair antilichaam gekoppeld aan een fluorophore gericht tegen het primaire antilichaam en gevisualiseerd met voldoende fluorescentie microscopie. Hier beschrijven we een immunochemical protocol om vlekken van myeline op ex vivo cerebellaire segmenten, een model dat voor een goede bewaring van de architectuur van zenuwweefsel zorgt. Bovendien, de organisatie en de grootte van het Purkinje-cellen (de enige myelinated neuron van het cerebellum) laten een klassiek model voor elektrofysiologische studies en ze zijn ook ideaal vast of live-imaging studies te verrichten.
De cerebellaire segmenten worden gegenereerd uit P9-P10 muizen, een tijd die overeenkomt met de vroege begin van Purkinje cel myelinisering, een proces dat meestal door één week ex vivo (6-7 dagen in vitro DIV)15 bereikt wordt. Bovendien, dit model is aangepast aan het onderzoeken van demyeliniserende aandoeningen zoals multiple sclerose (MS), zoals een uitgebreide demyelinisatie kan worden opgewekt in cerebellaire plakjes met behulp van de myelinotoxic-samengestelde lysophosphatidylcholine (of lysolecithin, LPC), die wordt gevolgd door een spontane remyelination16,17. Endogene remyelination plaatsvindt van twee dagen na de LPC verwijdering uit het kweekmedium en is bijna een week na de behandeling te voltooien.
De voltooiing van dit protocol duurt ongeveer 3 weken, met inbegrip van een halve dag voor cerebellaire segment culturen voorbereiding, een week voor volledig myelinated segmenten, gevolgd door 2 dagen te bereiken van het hoogtepunt van demyelinisatie en nog een week voor hun volledige remyelination. Immunohistochemistry kan bovendien worden uitgevoerd in 2 dagen. Het protocol hier beschreven is aangepast aan een standaard nest van 6 muizen pups en moet worden aangepast met betrekking tot het aantal dieren die worden gebruikt voor de geplande experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle werkzaamheden waarbij dieren worden institutionele beleidslijnen en door de UPMC, INSERM en de Franse en Europese gemeenschapsrichtlijn 86/609/EEG vastgestelde richtsnoeren nageleefd.
1. voorbereiding van de voedingsbodem en cultuur wordt ingevoegd (Hands-on tijd ≈ 10-15 min)
Opmerking: Voer deze stap uit in een stroom cultuur kap onder steriele omstandigheden
- Bereiden van 40 mL gestolde voedingsbodem, die uit 50 bestaat % BME, 25% Henks evenwichtig zoutoplossing (1 x), 25% warmte-geïnactiveerd paard serum, aangevuld met 2 mM glutamine afgeleide, 100 IU/mL penicilline-streptomycine en 4.5 mg/mL D-Glucose. Breng de pH op 7.4.
- Filter-steriliseren het medium door een 0,22 μm filter aangepast op een 50 mL kunststof spuit.
Opmerking: Kweekmedium kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor ten minste een week. - Voor een standaard nest van 6 pups, gebruik twee steriele 6-Wells-platen. Voor elke plaat, verwijder het klepje en voeg 1 mL gestolde voedingsbodem per putje.
- Plaats één cultuur invoegen in elk afzonderlijke putje door het ingedrukt houden van de kunststof rand met steriel pincet. Zet het deksel terug op de plaat.
Opmerking: De cerebellaire segmenten verzameld uit één pup (6-8) kunnen worden verzonden op twee membranen (3-4 cerebellaire segmenten per membraan invoegen).
2. voorbereiding van de dissectie Medium (Hands-on tijd ≈ 5 min)
Opmerking: Voer deze stap uit in een stroom cultuur kap onder steriele omstandigheden
- 100 mL dissectie medium, dat uit Gey de evenwicht zoutoplossing aangevuld met D-Glucose en 1 x 4.5 mg/mL penicilline-streptomycine (100 IU/mL elk bestaat) voor te bereiden.
- Filter-steriliseren het medium door een 0,22 μm filter eenheid.
Opmerking: Het medium van de dissectie kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor ten minste een maand. - Voeg 5 mL van koude dissectie medium tot 60 mm cel cultuur gerechten. Bereiden een 60 mm cel cultuur schotel voor elke pup te worden ontleed.
- Houd de dissectie gerechten op ijs tot gebruik.
3. voorbereiding van de dissectie materiaal (Hands-on tijd ≈ 15 min)
- Reinig de Bank met 100% ethanol.
- Het steriliseren van alle hulpmiddelen van de dissectie, een scheermesje en het weefsel chopper van kunststof platform met 100% ethanol.
- Fix het scheermesje en het plastic platform op de chopper weefsel en de snijdikte tot 300 µm aan te passen.
- Zorg ervoor dat alle de ethanol is verdampt voordat de dissectie.
4. CerebellumDissection en voorbereiding van de secties (Hands-on tijd ≈ 15-20 min per dier)
- Plaats een van de 60 mm cel cultuur gerechten met het medium van de ijskoude dissectie onder de binoculair Microscoop en verwijder de bovenste plaat.
- Swab het hoofd bont met 70% ethanol (zorgvuldig vermijden van het raken de ogen van het dier) en het dier met behulp van grote scherpe schaar, overeenkomstig de goedgekeurde procedure onthoofden.
Opmerking: De cerebellaire segmenten worden gegenereerd uit P9-P10 Muizen zonder specifieke seks of stam bias. - Gebruik kleine schaar te snijden de huid langs de middellijn van het hoofd vanaf de nek en omhoog naar de snuit van de muis.
- Aanhouden van het hoofd en de schedel bloot, vouwen terug de huid ventrally onder het hoofd en de twee plooien van de huid tussen de vingers knijpen.
- Invoegen van de kleine schaar zachtjes in het achterhoofdsgat en snijd de schedel door een lateraal incisie aan de zijkant en knip rondom de hoofd schedel. Houd de punt van de schaar als parallel en dicht bij de schedel mogelijk tijdens het snijden, om te voorkomen beschadiging van het hersenweefsel.
- De dorsale deel van de schedel met behulp van fine-straight pincet ophalen. Terwijl het zorgvuldig tillen het dorsale deel van de schedel, snijd de daaraan vastzittende hersenvliezen (doorschijnend geïrrigeerde membraan rond het hersenweefsel) eventueel met kleine schaar om te voorkomen beschadiging van het hersenweefsel.
- Boete-straight pincet zorgvuldig te introduceren (of als alternatief gebruik een spatel) tussen de ventrale schedel en de hersenen, zachtjes flip uit de hersenen en snijd de optiek en trigeminus zenuwen met een kleine schaar.
- Het helpen van de hersenen te laten vallen door de zwaartekracht in de 60 mm cel cultuur schotel ijskoude dissectie medium bevattende ondersteboven draaien van het hoofd net boven de schotel en laat de laatste verklevingen met kleine schaar indien nodig.
- Met behulp van fijne pincet, oriënteren de hersenen met de dorsale zijde naar de onderzoeker, en de ventrale zijde liggend op de bodem van de schotel.
- Onder de binoculair Microscoop, kunt de verlostang boete-straight immobiliseren van de hersenen aan de reukkolf kant en raak de hindbrain, zoals het beschadigd kan raken. De hindbrain te scheiden van de rest van de hersenen (voorgrond- en veroorzaakt, zie schema op figuur 1Aa), met behulp van fine-straight pincet. Als u wilt het cerebellum scheiden van de rest van de hindbrain, gebruik de fijne pincet te snijden van de cerebellaire steeltjes onder het cerebellum (zie schema op figuur 1Aa').
- Zodra het cerebellum geïsoleerd is, zorgvuldig scheur weg de hersenvliezen met behulp van fine-straight pincet (zie schema op figuur 1Aa').
- Houd het cerebellum zachtjes met de mooie gebogen verlostang en plaats het met de dorsale zijde boven op de plastic platform loodrecht naar de chopper razor blade (zie schema op figuur 1Bb).
- Gecombineerd een overmaat van dissectie medium rond het cerebellum met behulp van een steriele dun-einde Pipetteer tip aangepast op een 1 mL Pipetteer (zie schema op figuur 1Bb).
- Ervoor zorgen dat het cerebellum plat legt, maar is niet uitgerekt, eenmaal geplaatst op het platform om optimale Sagittaal segmenten tijdens vectorafbeeldingsbestanden (zie schema op figuur 1Bb).
- Snij 300 μm dik Sagittaal secties van het cerebellum met de chopper weefsel (zie schema op figuur 1Bb'). De kracht en de snelheid van het blad moeten worden geoptimaliseerd op site.
- Voeg voorzichtig een druppel van dissectie medium op het gesneden cerebellum. Met behulp van een wide-boring Pipetteer tip geplaatst op een pipet 1 mL, langzaam het gesneden cerebellum gecombineerd en breng dit terug in de 60 mm cel cultuur schotel met ijskoude dissectie medium (zie schema op figuur 1Bb'').
- Reinig de weefsel chopper van kunststof platform met 100% ethanol tussen elke cerebellum snijden. Laat de ethanol verdampen alvorens het volgende cerebellum op het platform te plaatsen.
- Gebruik twee boete-straight pincet (of als alternatief titanium naalden) om te scheiden van de afzonderlijke segmenten en selecteer 6-8 segmenten van de vermis (zie schema op figuur 1Cc en 1Cc').
- Nemen van een 6-well plaat met inzetstukken van de cultuur en de overdracht van maximaal 4 geselecteerde segmenten op één cultuur invoegen samen met een dissectie medium, met behulp van een tip van de wide-boring Pipetteer aangepast op een pipet 1 mL (zie schema op figuur 1Cc').
- Plaats van de segmenten in het midden van de cultuur invoegen met behulp van de dissectie medium of pincet te duwen en trek ze voorzichtig in de juiste locatie, om deze om te worden met elkaar in contact te vermijden (zie schema op figuur 1Cc').
- Verwijder eventuele overmaat van dissectie medium rond de segmenten met behulp van een dun-einde pipette uiteinde. Zorgen dat de plakjes plat lag op het membraan (zie schema op figuur 1Cc').
- Plaats de 6-well-plaat in de incubator onmiddellijk na de segmenten op het membraan hebben toegevoegd.
5. plakjes cultuur en demyelinisatie (Hands-on tijd ≈ 15-20 min)
Opmerking: Voer deze stap uit in een stroom cultuur kap onder steriele omstandigheden
- Vervang het kweekmedium met 1 mL per putje van voorverwarmde en gebufferde kweekmedium vers om de 3 dagen na de voorbereiding van het segment.
- Voor demyelinisatie, alle kweekmedium hieronder de cultuur wordt ingevoegd na 6 dagen in vitro (DIV) te verwijderen en te vervangen door 1 mL per putje van voorverwarmde verse kweekmedium dat 0, 5 mg/mL LPC. Incubeer gedurende 15-17 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
- Na incubatie, de inserts te wassen door ze te plaatsen in een petrischaal van 25 mm met 1 mL voorverwarmde kweekmedium.
Opmerking: De inserts moeten in contact met het medium, maar niet door haar worden gedekt. - Onmiddellijk overdracht de cultuur invoegt in een nieuwe 6-well plaat met verse voorverwarmde kweekmedium.
- Vervang het kweekmedium met 1 mL voorverwarmde verse kweekmedium elke 2-3 dagen tot de segmenten fixatie.
6. Immunohistochemistry (Hands-on tijd ≈ 1:30-2 h)
Opmerking: Voer de stappen uit 6.1. 6.3. onder een zuurkast. Expositie aan paraformaldehyde (PFA) voorkomen en verwijzen naar het product veiligheid gegevensblad voor voldoende manipulatie en bescherming.
- Gebruik pincet te heffen van elke cultuur wordt ingevoegd door het ingedrukt houden van de kunststof rand en verwijder het kweekmedium onder de membraan inzetstukken van elk putje.
- Bevestigen van de cerebellaire segmenten gedurende 30 minuten door toevoeging van 2 mL van 4% PFA in 1 x PBS pH 7.4 op de membraan inserts.
Opmerking: Het tijdstip van fixatie is afhankelijk van de fase van de myelinisering bestudeerd: 4 DIV komt overeen met het begin van de myelinisering, 7 DIV aan volledig myelinated segmenten. In het geval van LPC behandeling, 9 DIV komt overeen met het hoogtepunt van demyelinisatie, 11 DIV aan het begin van de remyelination en 14 DIV aan volledig remyelinated segmenten. - Wassen van de inzetstukken met de plakjes driemaal met 2 mL 1 x PBS gedurende 10 minuten.
- Scheiden van de segmenten van de membraan inserts onder de binoculair Microscoop met behulp van een 25 x 30 x vergroting, door ze met behulp van een scalpel of een borstel zachtjes te duwen. Ook om te voorkomen dat het risico van beschadiging van de segmenten terwijl ze loskoppelen van het membraan, gebruiken een scalpel te snijden het membraan met de segmenten nog steeds gehecht.
- Breng de zwevende segmenten in de putjes van de plaat van een 4-well met 1 x PBS, met behulp van een penseel.
- De PBS van elk putje gecombineerd en segmenten van-20 ° C gedurende 15 tot 20 minuten vooraf gekoelde 100% ethanol uit te broeden. Deze stap vergemakkelijkt antilichaam penetratie in myelinated vezels.
- De 100% ethanol gecombineerd en wassen eenmaal kort met 1 x PBS en vervolgens tweemaal in 1 x PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- De PBS gecombineerd en de segmenten gedurende 30 tot 45 minuten met een oplossing die 1 x PBS, 5% NGS, de niet-ionogene wasmiddel 0,3% bij kamertemperatuur te blokkeren van niet-specifieke antilichaam fixatie sites uit te broeden.
- De blokkerende oplossing gecombineerd. Geen wassen is noodzakelijk.
- Incubeer de plakjes 's nachts met de primaire antilichamen verdund in het blokkeren van de oplossing bij 4 ° C. Om te visualiseren de myeline op cerebellaire organotypic segmenten, MBP (kip, 1/150 of muis IGg2b, Smi99, 1/200) of PLP (Rat, hybridoma, 1/5 tot 1/10) te gebruiken antilichamen.
Opmerking: Om weer te geven van de uitdrukking van meer dan één antigeen in hetzelfde segment, een dubbel- of triple kleuring procedure uitvoeren (Zie Figuur 1 als voorbeeld). Zorgen om uit te voeren de incubatietijd gelijktijdig, primaire antilichamen worden geproduceerd in verschillende soorten. Gebruik vervolgens hun overeenkomstige secundaire antilichamen, gekoppeld aan verschillende fluorophores (Zie Tabel van materialen voor knooppunten en paranodal marker18 antilichamen). - Op de tweede dag, spoel de plakjes driemaal in 1 x PBS gedurende 10 minuten.
- Incubeer gedurende 3 uur met de secundaire antilichamen verdunde oplossing (1/500 verdunning) in het donker bij kamertemperatuur te blokkeren.
Opmerking: Optimalisatie van antilichaam verdunnings- en incubatie tijd misschien wel vereist bij het gebruik van andere antistoffen dan degene die zijn beschreven hier. - Spoel de plakjes driemaal in 1 x PBS gedurende 10 minuten in het donker.
- Onder een binoculaire loep, mount de plakjes op een glasplaatje. 100 µL van 1 x PBS plaats op de dia en breng de plakjes in de PBS met een borstel. Ontvouwen van de segmenten, indien nodig en ze plat op de dia. Verwijder eventuele overmaat van PBS. In het geval dat de immunolabeling wordt uitgevoerd met de segmenten nog steeds verbonden met membranen, monteren met de plakjes geconfronteerd met het dekglaasje aan, met het membraan op de glasplaatje.
- Breng een druppel van montage medium direct op het glas dekglaasje aan en zachtjes betrekking hebben op de segmenten. Gekoppelde dia's kunnen worden opgeslagen voor enkele maanden bij 4 ° C in het donker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorbeelden van representatieve myeline immunostainings in organotypic cerebellaire plakjes verkregen P9-P10 C57black6 wild-type (WT) (figuur 2A), evenals PLP-GFP transgene muizen (figuur 2B), samen met Purkinje cellen kleuring. Cerebellaire segmenten myelinate van de witte stof tracks regio van de segmenten naar de periferie van de folia en myelinisering van de cellen Purkinje gebeurt meestal na 6 tot en met 7 DIV. Bij 7 DIV is de inductie van een volledige demyelinisatie mogelijk door LPC behandeling (figuur 2Ci-ii). Volgende demyelinisatie, de plakjes spontaan remyelinate en zijn volledig remyelinated 6-7 dagen na het hoogtepunt van demyelinisatie (figuur 2Ciii).
Figuur 1: illustratie van cerebellum plakjes generatie. De dissectie is verdeeld in drie stappen. (A) het cerebellum is geïsoleerd en de hersenvliezen verwijderd (stappen 4.10 en 4.11). (B) het cerebellum wordt vervolgens overgebracht naar de helikopter platform en gesneden (stappen 4.12 tot en met 4.16). (C) ten slotte de segmenten van de vermis zijn geïsoleerd en geplaatst op een membraan invoegen. Het medium van de dissectie overgebracht met de plakjes wordt verwijderd en de plaat 6-well wordt geplaatst in de incubator (stappen 4.18 en 4.22). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: voorbeeld van myelinated cerebellaire segmenten gekweekte ex vivo. Afbeeldingsstapels (met orthogonale projectie) werden verkregen met behulp van een rechtop confocal microscoop na vrij zwevende immunolabeling, vlakke montage zoals beschreven in het protocol. De segmenten zijn krachtig myelinated op 11 DIV (A, PLP; B, GFP in het groen) en de axonale domeinen worden geassembleerd, zoals waargenomen in vivo met knopen van Ranvier verrijkt in spanning-gated natrium kanalen (nbv, in het rood) geflankeerd door het paranodal axoglial junction domein (Caspr, in wit) in C57black6 WT (A ) evenals PLP-GFP (B) transgene muizen segmenten. (C) de cerebellaire cortex het platform is bewaard gebleven in de gekweekte segmenten, , zoals waargenomen op cerebellaire segmenten van PLP-GFP muizen. (ik) Purkinje cellen axon (Calbindin, Calb, in het blauw) zijn krachtig myelinated (GFP, in het groen) na één week in cultuur. (ii) LPC behandeling volledig demyelinates van de segmenten, welke remyelinate spontaan en zijn volledig remyelinated 6 dagen post demyelinisatie (iii, 14 DIV). Schaal bars = 20 µm (A, B); 100 µm (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier, we detail een protocol voor het genereren van een ex vivo model overeenkomt met de muis cerebellaire organotypic segment culturen, aangepast van eerder gepubliceerde methoden15,16,19 en de daaropvolgende myeline immunokleuring van deze preparaten. Deze strategie biedt de mogelijkheid om te visualiseren van myeline onderdelen met een hoge resolutie in zowel gezonde en pathologische staten.
Cerebellaire organotypic segment culturen genomen van 10-dag oude muizen zijn een gevestigde experimentele model te onderzoeken van moleculaire en cellulaire mechanismen ten grondslag liggen aan de myelinisering en remyelination processen, aangezien het toestaat te reproduceren meest anatomische en functionele kenmerken van het desbetreffende weefsel in vivo met inbegrip van niet alleen het behoud van een welomschreven cellulaire architectuur, maar ook de rijping tijdlijn17. Bovendien cerebellaire segmenten hebben een bewaard gebleven, architecturale organisatie na twee weken in vitro (Figuur 1 c). De transgene PLP-GFP-stam is een alternatief, toe te staan, in het bijzonder om te observeren de status van de myelinisering onder een fluorescente verrekijker Microscoop op levende segmenten, die is met name handig voor demyelinisatie-remyelination studies (Figuur 1 c ).
Deze preparaten zijn van bijzonder belang als een snelle aanpak om te beoordelen van de myelinisering ten opzichte van de ontwikkelde geautomatiseerde kwantificering, met inbegrip van de westelijke vlekkenanalyse20, CNPase assay16 of kwantificering van PLP/Calbindin (of MBP / Calbindin) kleuring17,21, dus een hoge-doorvoer systeem voor het testen van farmacologische drugs in demyeliniserende stoornissen22,23te vertegenwoordigen.
Een van de belangrijkste kritieke problemen bij het uitvoeren van deze experimenten mogelijk te maken met de kwaliteit van de cerebellaire segmenten. Ten eerste, de leeftijd van muizen is van belang voor cerebellaire organotypic segment culturen. Het voortbestaan van Purkinje cellen, het slechts myelinated neuron in cerebellaire culturen, is gecompromitteerd als culturen bereid zijn van P2 naar P7 knaagdieren of met donoren ouder dan P1317. Meer in het algemeen, organotypic hersenen segment culturen zijn moeilijk te verkrijgen van volwassenen dieren. Ten tweede, de duur van weefsel verwerking tijdens ontleding is van cruciaal belang, als een dissectie stap van meer dan 15-20 minuten per dier leidt tot een daling van de overlevingskansen van de segmenten. Bovendien, bij het selecteren van de segmenten worden gekweekt, het is het beste om te voorkomen dat met behulp van degene van het einde van het cerebellum als gevolg van het slechte voortbestaan van neuronen en resulterende schaarste van myelinated vezels.
Andere parameters zoals de stabiliteit van temperatuur en CO2 -concentratie in de cultuur zijn bepalende factoren om ervoor te zorgen de gezondheid van het segment. Tot slot, de kwaliteit van de segmenten wordt beïnvloed door de samenstelling van het paard-serum, die niet kan worden gecontroleerd door de gebruikers. Testen meerdere batches van serum wordt daarom sterk aanbevolen.
Voor het verkrijgen van een adequate etikettering, is weefsel fixatie een belangrijke stap. Teneinde de penetratie van de antilichamen te bereiken van myeline antigenen, zoals myeline een zeer compacte structuur is, wordt plakjes voorbehandeling met absolute ethanol geadviseerd na fixatie. Een vergelijkbaar protocol van kleuring kan verder worden toegepast op de in vivo vaste weefsels, hoewel Triton concentratie moet worden aangepast aan de dikte van de vibratome of de cryostaat gegenereerd in vivo secties. De beschikbaarheid van niet-commerciële antilichamen moet ook worden overwogen. Voorbereiding van segmenten van transgene muizen zoals PLP-GFP24 of CNP-GFP25 vormt aldus een alternatief voor het visualiseren van myeline en oligodendrocyten processen.
Naast de immunochemical in dit protocol omschreven methoden, zijn andere benaderingen gebruikt bij het bestuderen van myeline het platform. Er bestaan ook aanvullende technieken om te onderzoeken van myeline ultrastructuur, met elektronenmicroscopie wordt de goudstandaard26. Andere technieken bestaan, zoals de label-vrije benaderingen, met inbegrip van optische coherentie tomografie27,28, Raman verstrooiing28,29, derde-harmonische generatie30 of spectrale confocale reflectie microscopie31; deze benaderingen hebben het extra voordeel van het inschakelen van de waarneming van dynamische cellulaire processen. Echter, sommige van deze technieken zijn complex en state-of-the-art microscopie set-ups verder te vereisen. Om deze redenen blijft myeline studie door immunofluorescentie labeling een standaard aanpak om myelinisering en de gebreken bij verschillende ontwikkelings of verworven aandoeningen en hun modellen te onderzoeken, alsook om te beoordelen van het potentieel van de toekomst therapeutische behandelingen. Het kan verder worden gebruikt om te studeren van myelinisering in verschillende contexten, zoals leren en plasticiteit, evenals veroudering, depressie of autisme die myeline bekend is worden de gewijzigde32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs geen strijdige belangen of belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon en Dr. Thomas Roux voor waardevolle opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door INSERM, ICM, ARSEP subsidies R13123DD, R17127DD van de ANR (tot A.D.) en FRM fellowship, SPF20110421435 (tot A.D.), FDT20170437332 (naar M.T.). Wij danken de CELIS faciliteit voor de cultuur van de cel en de icm. Quant imaging platform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60 mm and 100 mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 mm x 26 mm x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M.
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
