Summary
Her presenterer vi en metode for å forberede organotypic skive kulturer fra musen lillehjernen og myelin-skjeden farging av immunhistokjemi egnet for å undersøke mekanismer for myelination og remyelination i det sentrale nervesystemet.
Abstract
I nervesystemet er myelin et kompleks membran generert av myelinating glial celler, som ensheathes axons og muliggjør rask Elektrisk ledning. Myelin endring har vist oppstår i ulike nevrologiske sykdommer, hvor det er forbundet med funksjonell underskudd. Her gir vi en detaljert beskrivelse av en ex vivo modell består av musen organotypic lillehjernen skiver, som kan vedlikeholdes i kultur for flere uker og ytterligere merkes for å visualisere myelin.
Introduction
Neurons er svært polarisert celler, som omfatter en somato-dendrittiske kupé som mottar inndata fra omgivelsene og en axon som sikrer generasjon og overføring av elektriske impulser til andre celler. Rask overføring og rettidig levering av informasjon er avgjørende for riktig funksjon av nervesystemet. I virveldyr, er det tilrettelagt av myelination, som gir økende axonal ledning hastighet1. Myelin er en spesialisert struktur av komprimerte lag av plasma membran generert av myelinating glia, nemlig oligodendrocytes i sentralnervesystemet (CNS) og Schwann celler i perifere nervesystemet (PNS). Både i CNS og PNS, axoglial vekselsvirkningene kjøre dannelsen av spesialiserte axonal domener: noder av Ranvier og deres omkringliggende domener, paranodes og juxtaparanodes2. Axonal segmentene isolert av myelin, eller internodes, alternativ med noder av Ranvier, som samsvarer med små unmyelinated domener beriket i spenning-gated natrium kanaler (Nav). Høy konsentrasjon og rask aktivering av Nav kanaler på noder i Ranvier tillate fornyelse av handlingen potensialer, og de isolerende egenskapene av myelin hylser, sikre effektiv og rask saltatory gjennomføring av den nerve impuls langs axon3.
I tillegg til sin rolle i akselererende ledning hastigheten av det nerven impulsen, gir myelinating glia metabolske støtte til axon, bevare integriteten langsiktig og delta i overlevelse4,5. Videre har det blitt klart i de senere årene at myelin dynamisk modulert gjennom livet, således antagelig deltar i regulering og plastisitet av ulike nervesystemet funksjoner. Justeringer av distribusjon, antall, lengde og tykkelse på myelin sheaths langs axons kan dermed representerer en ny måte å fininnstille ulike nettverk6,7,8. Derfor evolusjonære oppkjøpet av myelin er en viktig prosess for sensoriske, motoriske og kognitive funksjoner og forstyrrelsene av samspillet mellom axons og glia er stadig som bidrar til den utviklingsmessige eller ervervet nevrologiske sykdommer9.
Myelin sammensetning har vært preget med den bestemte funksjonen av en høy andel av lipider (70%) sammenlignet med proteiner (30%) i motsetning til andre mobilnettet membraner10. Men i motsetning til myelin lipider er de fleste av myelin proteiner spesifikke for myelin, inkludert myelin basic protein (MBP), proteolipid protein (PLP), 2', 3-sykliske nukleotid 3-fosfodiesterase (CNP), myelin-assosiert glykoprotein (MAG), myelin-oligodendrocyte glykoprotein (MOG), PMP-22 og P010. Ulike histologiske metoder stain myelin finnes basert på komposisjonen lipid, som Luxol rask blå11, Sudan svart B12, Baker syre hematin metoden13, samt sølv flekker14. Likevel, disse er ikke alltid mulig for en tilstrekkelig kontrast og oppløsning til å visualisere personlige fiber. En alternativ tilnærming til oppdage myelin er gjennom immunohistochemistry rettet mot myelin proteiner. Ulike antistoffer målrette myelin-spesifikke antigener med en høy spesifisitet og kan brukes rutinemessig å oppdage myelinated strukturer. Antistoff-antigen samspillet kan bli ytterligere avdekket ved hjelp av en sekundær antistoff koplet til en fluorophore rettet mot primære antistoffer og visualisert med tilstrekkelig fluorescens mikroskopi. Her beskriver vi en talipes protokoll til stain myelin på ex vivo lillehjernen skiver, en modell som gir en god bevaring av nervøs vev arkitektur. I tillegg organisasjon og størrelsen på Purkinje celler (eneste myelinated Nevron av lillehjernen) gjøre dem en klassisk modell for elektrofysiologiske studier og egner seg like godt å utføre fast eller live-imaging studier.
Lillehjernen skiver genereres fra P9-P10 mus, gangen tilsvarer tidlig utbruddet av Purkinje celle myelination, en prosess som oppnås hovedsakelig ved en uke ex vivo (6-7 dager i vitro, DIV)15. Videre, denne modellen er tilpasset for å undersøke demyeliniserende lidelser som multippel sklerose (MS), som en omfattende demyelinisering kan bli indusert i lillehjernen skiver ved hjelp av myelinotoxic sammensatte lysophosphatidylcholine (eller lysolecithin, LPC), som etterfølges av en spontan remyelination16,17. Endogene remyelination foregår fra to dager etter LPC fjerning fra kultur medium og er nesten en uke innlegg behandling.
Fullføringen av denne protokollen tar approximatively 3 uker, inkludert en halv dag for lillehjernen skive kulturer forberedelse, en uke å få fullt myelinated skiver, etterfulgt av 2 dager å nå toppen av demyelinisering og en uke i sin helhet remyelination. I tillegg kan immunohistochemistry fullføres i 2 dager. Protokollen beskrevet her er tilpasset en standard søppel av 6 mus pups og må tilpasses om antall dyr som brukes for planlagte eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt arbeid som involverer dyr overholdt institusjonelle politikk og retningslinjer som er etablert av den UPMC, INSERM og fransk og europeisk fellesskap rådsdirektiv 86/609/EØF.
1. forberedelse kultur Medium og kultur setter inn (Hands-on tid ≈ 10-15 min)
Merk: Utføre dette trinnet i flyt kultur hette under sterile forhold
- Forberede 40 mL kultur medium, som består av 50% BME, 25% Hanks balansert saltløsning (1 x), 25% inaktivert hest serum, supplert med 2 mM glutamin derivat, 100 IU/mL penicillin-streptomycin og 4,5 mg/mL D-glukose. Justere pH 7,4.
- Filter-sterilisere mediet gjennom et 0.22 μm filter tilpasset en 50 mL plastsprøyte.
Merk: Kultur medium kan lagres på 4 ° C i minst en uke. - For en standard søppel av 6 pups, bruker du to sterile 6-og plater. For hver plate, Fjern dekselet og tilsett 1 mL av kultur medium per brønn.
- Plass en kultur setter inn i hver enkelt brønn ved å holde plast kanten med sterilt tang. Sett dekselet tilbake på tallerkenen.
Merk: Lillehjernen skiver fra ettall pup (6-8) kan fordeles på to membraner (3-4 lillehjernen stykker per membran sett inn).
2. forberedelse av disseksjon Medium (Hands-on tid ≈ 5 min)
Merk: Utføre dette trinnet i flyt kultur hette under sterile forhold
- Forberede 100 mL disseksjon medium, som består av Geys balansert saltløsning med 4,5 mg/mL D-glukose og 1 x penicillin-streptomycin (100 IU/mL hver).
- Filter-sterilisere mediet gjennom en 0.22 μm filter enhet.
Merk: Disseksjon mediet kan lagres på 4 ° C i minst en måned. - Legge til 5 mL kaldt disseksjon medium i 60 mm celle kultur retter. Forberede en 60 mm celle kultur parabolen for hver valp å være dissekert.
- Holde disseksjon rettene på is til bruk.
3. forberedelse disseksjon materiale (Hands-on tid ≈ 15 min)
- Rengjør benken med 100% etanol.
- Sterilisere alle disseksjon verktøy, et barberblad og vev chopper's plast plattform med 100% etanol.
- Fastsette den razor bladet og plast plattformen på vev chopper og justere kutte tykkelsen til 300 µm.
- Kontroller at alle etanol har fordampet før dissection.
4. CerebellumDissection og deler forberedelse (Hands-on tid ≈ 15-20 min per dyr)
- Plasser en av 60 mm celle kultur retter som inneholder iskald disseksjon mediet under kikkert mikroskopet og fjerne topplaten.
- Vattpinnen hodet pelsen med 70% etanol (nøye unngå berøre øynene til dyret) og halshugge dyret med store skarp saks, i henhold til godkjente prosedyren.
Merk: Lillehjernen skiver genereres fra P9-P10 mus uten spesifikk sex eller belastning bias. - Bruk liten saks til å kutte huden langs midtlinjen av hodet fra halsen og går opp til musen snuten.
- Å holde hodet og utsette skallen, brett tilbake huden ventrally under hodet og knipe to folder i huden mellom en finger.
- Sette inn små saksen forsiktig i de foramen magnum og kuttet skallen ved å gjøre en lateral snitt mot og skjær rundt hodet skallen. Hold spissen av saksen som parallell og nær kraniet som mulig under sagingen, å unngå å skade hjernevev.
- Hente den dorsal delen av skallen med fine-rett tang. Mens forsiktig løfte den dorsal delen av skallen, kuttet overholde meninges (gjennomskinnelig Vannes membran omgir hjernevev) om nødvendig med liten saks til å unngå å skade hjernevev.
- Nøye introdusere fine-rett tang (eller alternativt bruke en slikkepott) mellom ventrale skallen og hjernen, forsiktig flip ut hjernen og klippe optikk og trigeminal nerve med liten saks.
- Hjelpe hjernen til å slippe av tyngdekraften til 60 mm celle kultur parabol med iskald disseksjon medium ved å slå hodet opp-ned like over parabolen, og slipp de siste adhesjon med liten saks Hvis nødvendig.
- Bruke fine tang, orientere hjernen med dorsal side mot forskeren, og ventral side liggende på bunnen av parabolen.
- Under kikkert mikroskopet, bruke fine-rett tang nakkens hjernen på forebrain siden og unngå å berøre hindbrain, som det kan bli skadet. Skiller hindbrain fra resten av hjernen (forgrunnen- og mellomhjernen, se skjematisk på figur 1Aa), med fine-rett tang. Separate lillehjernen fra resten av hindbrain, bruke fine tang til å kutte av lillehjernen peduncles under lillehjernen (se skjematisk på figur 1Aa').
- Når lillehjernen er isolert, nøye rive meninges ved hjelp av fine-rett pinsett (se skjematisk på figur 1Aa').
- Hold lillehjernen forsiktig med fine buet tang og plassere den med dorsal side opp på plast plattformen vinkelrett til barberblad chopper (se skjematisk figur 1Bb).
- Sug opp overflødig disseksjon middels rundt lillehjernen bruker et sterilt tynn-end pipette tips tilpasset en 1 mL Pipetter (se skjematisk figur 1Bb).
- Kontroller at lillehjernen ligger flatt, men er ikke strukket, når plassert på plattformen få optimal sagittal skiver under snitting (se skjematisk på figur 1Bb).
- Skjær 300 μm tykke sagittal delene av lillehjernen med vev chopper (se skjematisk på figur 1Bb'). Force og hastigheten på bladet må optimaliseres på nettstedet.
- Forsiktig legge en dråpe disseksjon medium på skiver lillehjernen. Bruker en bred-fødte pipette spissen på en 1 mL pipette, sakte Sug opp skiver lillehjernen og overføre den til 60 mm celle kultur parabol med iskald disseksjon medium (se skjematisk på figur 1Bb'').
- Rengjør vev chopper's plast plattform med 100% etanol mellom hver lillehjernen kutting. La etanol fordampe før du plasserer neste lillehjernen på plattformen.
- Bruke to fine-rett tang (eller alternativt Titan nåler) for å skille enkeltsektorer og velg 6-8 skiver vermis (se skjematisk på figur 1Cc og 1Cc').
- Ta en 6-vel plate med kultur setter inn og overføre opptil 4 valgte skiver på en kultur sett inn sammen med noen disseksjon mediet, bruker en bred-fødte pipette tips tilpasset en 1 mL pipette (se skjematisk på figur 1Cc').
- Sett skiver i kultur innsatsen med disseksjon medium eller tang å presse og trekke dem forsiktig inn i riktig sted, unngå dem for å være i kontakt med hverandre (se skjematisk på figur 1Cc').
- Fjern overflødig disseksjon middels rundt skiver med en tynn-end pipette tips. Sikre at skiver ligge flatt på membranen (se skjematisk på figur 1Cc').
- Plass 6-vel platen i inkubator umiddelbart etter å ha lagt skiver på membranen.
5. skiver kultur og demyelinisering (Hands-on tid ≈ 15-20 min)
Merk: Utføre dette trinnet i flyt kultur hette under sterile forhold
- Erstatt kultur medium med 1 mL per brønn av forvarmes og bufrede frisk kultur medium hver 3 dager etter skive forberedelse.
- For demyelinisering, fjerne alle kultur medium nedenfor kultur setter inn etter 6 dager i vitro (DIV) og erstatte den med 1 mL per brønn forvarmes frisk kultur medium med 0,5 mg/mL LPC. Inkuber 15-17 h ved 37 ° C, 5% CO2.
- Inkubasjon vaskes som setter inn ved å plassere dem i en 25 mm Petriskål som inneholder 1 mL av forvarmes kultur medium.
Merk: Skivene bør være i kontakt med mediet, men dekkes ikke av den. - Øyeblikkelig overføre som kultur setter inn i en ny 6-vel plate som inneholder ferske forvarmes kultur medium.
- Erstatt kultur medium med 1 mL av forvarmes frisk kultur medium hver 2-3 dager før sektorer fixation.
6. Immunohistochemistry (Hands-on tid ≈ 1:30-2 h)
Merk: Utføre trinnene 6.1. til 6.3. under avtrekksvifte. Unngå utredning for å paraformaldehyde (PFA) og se produktet sikkerhet dataarket for tilstrekkelig manipulasjon og beskyttelse.
- Bruk tang til å løfte hver kultur setter inn ved å holde plast kanten og fjerne kultur medium under membranen skivene i hver brønn.
- Fastsette lillehjernen sektorene for 30 min ved å legge til 2 mL 4% PFA i 1 x PBS pH 7.4 på membran skivene.
Merk: Tid utgangspunktet fiksering avhenger av scenen myelination studerte: 4 DIV tilsvarer utbruddet av myelination, 7 DIV fullt myelinated skiver. Ved LPC behandling tilsvarer 9 DIV toppen av demyelinisering, 11 DIV starten på remyelination og 14 DIV fullt remyelinated skiver. - Vask skivene med skiver tre ganger med 2 mL 1 x PBS i 10 min.
- Skille sektorene fra membranen skivene under kikkert mikroskop med en 25 x 30 x forstørrelse, ved forsiktig skyve dem ved hjelp av en skalpell eller en pensel. Også for å unngå risikoen for skade skiver mens koble dem fra membranen, bruke en skalpell for å klippe membranen med skiver fortsatt festet.
- Overføre flytende skiver i brønnene av en 4-vel plate som inneholder 1 x PBS, med en pensel.
- Sug opp PBS fra hver brønn og ruge sektorene i pre-avkjølt 100% etanol på 20 ° C i 15-20 min. Dette trinnet forenkler antistoff penetrasjon i myelinated fiber.
- Sug opp 100% etanol og vaskes en gang kort med 1 x PBS, deretter to ganger i 1 x PBS i 10 min ved romtemperatur.
- Sug opp PBS og ruge sektorene for 30 til 45 minutter med en løsning som inneholder 1 x PBS, 5% NGS, 0,3% ikke-ioniske vaskemiddel ved romtemperatur for å blokkere ikke-spesifikke antistoffer fiksering nettsteder.
- Sug opp den blokkerende løsningen. Ingen vask er nødvendig.
- Inkuber skiver over natten med primære antistoffer fortynnet i blokkering løsning på 4 ° C. For å visualisere myelin på lillehjernen organotypic skiver, bruke MBP (kylling, 1/150 eller mus IGg2b, Smi99, 1/200) eller PLP (Rat, hybridoma, 1/5 1/10) antistoffer.
Merk: For å avsløre uttrykk for flere antigen i samme stykke, utføre en dobbelt- eller trippel flekker prosedyre (se figur 1 som et eksempel). For å utføre inkubering samtidig, sikre primære antistoffer blir produsert i forskjellige arter. Deretter bruker deres tilsvarende sekundære antistoffer koblet til forskjellige fluorophores (se Tabell for materiale for knutepunktet og paranodal markør18 antistoffer). - På den andre dagen, vaske skiver tre ganger i 1 x PBS i 10 min.
- Inkuber for 3t med sekundær antistoffer fortynnet i blokkering løsning (1/500 fortynning) i mørket ved romtemperatur.
Merk: Optimalisering av antistoff fortynning og inkubasjon tid kan være nødvendig når du bruker andre antistoffer enn de som er beskrevet her. - Vask skiver tre ganger i 1 x PBS i 10 min i mørket.
- Under en kikkert mikroskop, montere skiver på et glass lysbilde. Plasser 100 µL av 1 x PBS på lysbildet og overføre skiver i PBS med en pensel. Trekke ut sektorene hvis nødvendig og kok på lysbildet. Fjern overflødig på PBS. I tilfelle av immunolabeling utføres med skiver fortsatt festet til membraner, montere med skiver overfor dekkglassvæske, med membran på av objektglass.
- Plasser en dråpe montering medium direkte på glass dekkglassvæske og forsiktig dekke skiver. Montert lysbilder kan lagres i flere måneder på 4 ° C i mørket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempler på representant myelin immunostainings i organotypic lillehjernen skiver innhentet fra P9-P10 C57black6 vill-type (WT) (figur 2A), samt PLP-GFP transgene mus (figur 2B), sammen med Purkinje celler flekker. Lillehjernen skiver myelinate fra hvit saken sporer regionen skiver mot periferien av folia og myelination av Purkinje celler er stort sett oppnådd etter 6 til 7 DIV. 7 DIV er induksjon av en full demyelinisering mulig gjennom LPC behandling (figur 2Ci-ii). Følgende demyelinisering, skiver spontant remyelinate og er fullt remyelinated 6-7 dager etter toppen av demyelinisering (figur 2Ciii).
Figur 1: illustrasjon av lillehjernen skiver generasjon. Dissection er delt i tre hovedtrinn. (A) lillehjernen er isolert og meninges fjernet (trinn 4.10 og 4.11). (B) lillehjernen overføres deretter til helikopter plattform og skiver (trinn 4,12 til 4.16). (C) endelig sektorene er isolert fra vermis og plassert på en membran setter. Disseksjon mediet overført med skiver fjernes og 6-vel platen plasseres i inkubator (trinn 4.18 og 4.22). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempel på myelinated lillehjernen skiver kultivert ex vivo. Bildestakker (med orthogonal projeksjon) ble hentet ved hjelp av en oppreist AC confocal mikroskop følgende gratis flytende immunolabeling og flat montering som beskrevet i protokollen. Sektorene er robust myelinated på 11 DIV (A, PLP; B, GFP i grønt) og axonal domenene er samlet som observert i vivo med noder av Ranvier beriket i spenning-gated natrium kanaler (Nav, i rødt) flankert av paranodal axoglial krysset domenet (Caspr, hvitt) i C57black6 WT (A ) og PLP-GFP (B) transgene mus skiver. (C) lillehjernen cortex arkitektur er bevart i kulturperler skiver, observert på lillehjernen skiver fra PLP-GFP mus. (jeg) Purkinje celler axon (Calbindin, Calb, blått) er robust myelinated (GFP, i grønt) etter en uke i kultur. (ii) LPC behandling fullt demyelinates skiver, som remyelinate spontant og er fullt remyelinated 6 dager innlegget demyelinisering (iii, 14 DIV). Skalere barer = 20 µm (A, B); 100 µm (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her vi detalj en protokoll for å generere en ex vivo modell tilsvarer musen lillehjernen organotypic skive kulturer, tilpasset fra tidligere publiserte metoder15,16,19 og påfølgende myelin immunostaining av disse forberedelsene. Denne strategien tilbyr muligheten til å visualisere myelin komponenter med en både sunn og patologiske tilstander.
Lillehjernen organotypic skive kulturer tatt fra 10 dager gamle mus er en veletablert eksperimentell modell å undersøke mobilnettet og molekylære mekanismer underliggende myelination og remyelination prosesser, som gjør det mulig for å gjenskape mest anatomiske og funksjonelle egenskaper av tilsvarende vev i vivo inkludert ikke bare bevare en veldefinert mobilnettet arkitektur, men også de modning tidslinje17. Videre lillehjernen skiver har en bevarte arkitektoniske organisasjon etter to uker i vitro (figur 1 c). Transgene PLP-GFP belastningen er et alternativ, tillater, spesielt for å observere myelination status under fluorescerende kikkert mikroskop på live skiver, som er spesielt nyttig for demyelinisering-remyelination studier (figur 1 c ).
Disse forberedelsene er av spesiell interesse som en rask tilnærming til å vurdere myelination rate med utviklet automatisert kvantifiseringen, inkludert western blot analyse20, CNPase analysen16 eller kvantifisering av PLP/Calbindin (eller MBP / Calbindin) flekker17,21, dermed representerer en høy gjennomstrømming systemet tillater for testing av farmakologiske narkotika i demyeliniserende lidelser22,23.
En av de viktigste kritiske spørsmålene når du utfører disse eksperimentene kunne være relatert til kvaliteten på lillehjernen skiver. For det første er år mus viktig for lillehjernen organotypic skive kulturer. Overlevelsen av Purkinje celler, bare myelinated Nevron i lillehjernen kulturer, er kompromittert hvis kulturer er forberedt fra P2 P7 gnagere eller med givere eldre enn P1317. Mer generelt er organotypic hjernen stykke kulturer vanskelig å få fra voksne dyr. Dernest varigheten av vev behandling under disseksjon er kritisk, som en disseksjon trinn i mer enn 15-20 minutter per dyr fører til en nedgang i overlevelse sektorene. Videre, når du velger skiver til kultivert, er det best å unngå å bruke de fra hver ende av lillehjernen på grunn av de fattige av neurons og resulterende knapphet på myelinated fiber.
Andre parametere som stabiliteten i temperatur og CO2 konsentrasjonen i kultur er avgjørende å sikre skive helse. Til slutt, påvirkes kvaliteten på skiver sammensetningen av hest serum, som ikke kan kontrolleres av brukerne. Derfor anbefales teste flere grupper av serum.
For å få en tilstrekkelig merking, er vev fixation avgjørende. For å lette utbredelsen av antistoffer til myelin antigener, myelin er en svært kompakt struktur, anbefales skiver forbehandling med absolutt etanol følgende fiksering. En lignende protokoll for flekker kan videre brukes i vivo fast vev, om Triton konsentrasjon må tilpasses til tykkelsen på vibratome eller kryostaten generert i vivo deler. Tilgjengeligheten av ikke-kommersielle antistoffer bør også vurderes. Forbereder skiver fra transgene mus som PLP-GFP24 eller CNP-GFP25 dermed representerer et alternativ å visualisere myelin og oligodendrocytes.
I tillegg til talipes metodene som er beskrevet i denne protokollen, brukes andre tilnærminger vanligvis til å studere myelin arkitektur. Utfyllende teknikker finnes også undersøke myelin ultrastructure, med elektronmikroskop blir gullstandarden26. Andre teknikker finnes, for eksempel etikett-fri metoder inkludert optical coherence tomografi27,28, Raman spredning28,29, tredje-harmoniske generasjon30 eller spektrale AC confocal refleksjon mikroskopi31; disse metodene har fordelen av observasjon av dynamisk cellulære prosesser. Men noen av disse teknikkene er komplekse og krever ytterligere state-of-the-art mikroskopi set-ups. For disse grunner er myelin studie av immunofluorescence merking en tilnærming å undersøke myelination og defekter i ulike utviklingsmessige eller ervervet sykdommer og deres modeller, i tillegg til å vurdere potensialet i fremtiden terapeutiske behandlinger. Det kan videre brukes til å studere myelination i flere sammenhenger, som læring og plastisitet, samt aldring, depresjon og autisme som myelin er kjent for å være endret32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har konkurrerende interesser eller motstridende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon og Dr. Thomas Roux for verdifulle kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av INSERM, ICM, ARSEP tilskudd R13123DD, ANR R17127DD (å e.Kr.) og FRM fellesskap, SPF20110421435 (å e.Kr.), FDT20170437332 (til Mt). Vi takker CELIS celle kultur anlegget og icm. Quant tenkelig plattform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60 mm and 100 mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 mm x 26 mm x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M.
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
