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Neuroscience

तैयारी और Myelinating ऑर्गेनोप्ररूपी अनुमस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों का Immunostaining

Published: March 20, 2019 doi: 10.3791/59163
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM-GH Pitié-Salpétrière

Summary

यहां हम एक विधि वर्तमान myelin और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में remyelination के तंत्र की जांच के लिए उपयुक्त immunohistochemistry द्वारा माउस सेरिबैलम और myelin म्यान धुंधला से organotypic टुकड़ा संस्कृतियों तैयार करने के लिए ।

Abstract

तंत्रिका तंत्र में, myelin एक जटिल झिल्ली संरचना myelin ग्लाइटल कोशिकाओं है, जो axons ensheathes और तेजी से विद्युत चालन की सुविधा के द्वारा उत्पन्न होता है । Myelin परिवर्तन करने के लिए विभिंन मस्तिष्क संबंधी बीमारियों, जहां यह कार्यात्मक घाटे के साथ जुड़ा हुआ है में होने के लिए दिखाया गया है । यहां, हम एक पूर्व vivo माउस organotypic सेरिबैलर स्लाइस, जो कई हफ्तों के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है और आगे myelin कल्पना को लेबल से मिलकर मॉडल का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं ।

Introduction

ंयूरॉंस अत्यधिक polarized कोशिकाओं है, जो एक somato-डेन्ट्रीटिक डिब्बे शामिल है कि अपने पर्यावरण से जानकारी प्राप्त करता है और एक axon कि उत्पादन और अंय कोशिकाओं को विद्युत आवेगों के प्रसार को सुनिश्चित करता है । तंत्रिका तंत्र के समुचित कार्यकरण के लिए सूचना का तीव्र संचरण और समय पर वितरण आवश्यक है । कशेरुका में, यह myelination, जो बढ़ती axonal चालन वेग1की अनुमति देता है की सुविधा है । Myelin एक विशेष संरचना myelin glia द्वारा उत्पंन प्लाज्मा झिल्ली की संकुचित परतों द्वारा गठित है, अर्थात् में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) और Schwann कोशिकाओं परिधीय तंत्रिका तंत्र (PNS) में ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स । दोनों सीएनएस में और PNS, axoglial बातचीत विशेष axonal डोमेन के गठन ड्राइव: Ranvier के नोड्स और उनके आसपास के डोमेन, पैरानोड, और juxtaparanodes2। axonal खंडों myelin, या internodes, रैनवियर के नोड्स के साथ वैकल्पिक, जो छोटे unmyelinated वोल्टेज में समृद्ध डोमेन के अनुरूप से अछूता-gated सोडियम चैनल (Nav) । रैनवियर के नोड्स पर नवी चैनलों की उच्च एकाग्रता और तेजी से सक्रियण कार्रवाई क्षमता के उत्थान की अनुमति है, और एक साथ myelin sheaths के इन्सुलेट गुणों के साथ, कुशल और तेजी से साल्टटरी चालन सुनिश्चित axon3के साथ तंत्रिका आवेग ।

तंत्रिका आवेग के चालन वेग को तेज करने में अपनी भूमिका के अलावा, myelinating glia axon के लिए चयापचय समर्थन प्रदान करता है, अपनी दीर्घकालिक अखंडता के संरक्षण और अपने अस्तित्व4,5में भाग लेने । इसके अलावा, यह हाल के वर्षों में स्पष्ट हो गया है कि myelin गतिशील जीवन भर संग्राहक है, इस प्रकार संभवतः विनियमन और विभिंन तंत्रिका तंत्र के कार्यों के सुघट्यता में भाग ले । axons के साथ वितरण, संख्या, लंबाई, और myelin आवरण की मोटाई के समायोजन इस प्रकार एक उपंयास के लिए पतले विभिंन नेटवर्क6,7,8धुन तरीके का प्रतिनिधित्व हो सकता है । इसलिए, myelin के विकासवादी अधिग्रहण संवेदी, मोटर और संज्ञानात्मक कार्यों के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है और axons और glia के बीच बातचीत की क्षोभ तेजी से विकास या अर्जित तंत्रिका विज्ञान के लिए योगदान के रूप में माना जाता है रोग9.

Myelin संरचना की विशेषता है, लिपिड के एक उच्च अनुपात के विशिष्ट सुविधा के साथ किया गया है (७०%) प्रोटीन की तुलना में (30%) अन्य सेलुलर झिल्ली के विपरीत10. हालांकि, myelin लिपिड के विपरीत, myelin प्रोटीन के अधिकांश माइलिन के लिए विशिष्ट हैं, myelin बुनियादी प्रोटीन सहित (MBP), proteolipid प्रोटीन (PLP), 2 ', 3 '-चक्रीय न्यूक्लियोटाइड 3 '-फॉस्फोडाईस्टरेज़ (CNP), myelin एसोसिएटेड ग्लाइकोप्रोटीन (पत्रिका) myelin-ओलिगोडेन्ट्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (MOG), पीएमपी-22 और P010. myelin दाग करने के लिए विभिन्न ऊतकीय तरीकों Luxol तेजी से नीले11, सूडान ब्लैक बी12, बेकर एसिड hematin विधि13, साथ ही चांदी धुंधला14के रूप में अपनी लिपिड संरचना के आधार पर मौजूद हैं । फिर भी, इन तरीकों हमेशा एक पर्याप्त विपरीत और व्यक्तिगत फाइबर कल्पना करने के लिए संकल्प के लिए अनुमति नहीं है । myelin का पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण immunohistochemistry myelin प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित के माध्यम से है । विभिन्न एंटीबॉडी एक उच्च विशिष्टता के साथ myelin विशिष्ट एंटीजन लक्ष्य और myelin संरचनाओं का पता लगाने के लिए नियमित रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है । एंटीबॉडी-antigen बातचीत आगे एक प्राथमिक एंटीबॉडी के खिलाफ निर्देशित और पर्याप्त प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना एक फ्लोरेफोर के लिए युग्मित एक द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग कर पता चला जा सकता है । यहां, हम एक immunochemical प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए पूर्व vivo अनुमस्तिष्क स्लाइस पर myelin दाग, एक मॉडल है जो तंत्रिका ऊतक वास्तुकला का एक अच्छा संरक्षण के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, संगठन और प्रकिंजे कोशिकाओं के आकार (सेरिबैलम के एकमात्र myelinated ंयूरोन) उंहें electroशरीरक्रियात्मक अध्ययन के लिए एक शास्त्रीय मॉडल बनाने के लिए और वे इसी तरह के लिए तय या लाइव इमेजिंग अध्ययन प्रदर्शन आदर्श हैं ।

सेरिबैलर स्लाइसें P9-P10 चूहों से उत्पन्न होते हैं, एक प्रकिंजे सेल myelination के प्रारंभिक शुरुआत करने के लिए इसी समय, एक प्रक्रिया है कि ज्यादातर एक सप्ताह पूर्व vivo द्वारा प्राप्त की है (विट्रो, DIV में 6-7 दिन)15। इसके अलावा, इस मॉडल ऐसे मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस), एक व्यापक ग्रासलेल्या myelinotoxic यौगिक lysopफॉस्फेट (या lysolecithin, एलपीसी) का उपयोग कर अनुमस्तिष्क स्लाइसें में प्रेरित किया जा सकता है के रूप में विकारों demyelinating की जांच करने के लिए अनुकूलित है, जो एक सहज remyelination16,17के बाद है । अंतर्जात रिमायलिनेशन संस्कृति माध्यम से LPC हटाने के बाद दो दिनों से जगह लेता है और लगभग एक सप्ताह के बाद उपचार पूरा हो गया है ।

इस प्रोटोकॉल के पूरा होने के approximatively 3 सप्ताह, सेरिबैलर स्लाइस संस्कृतियों की तैयारी के लिए आधा एक दिन सहित लेता है, एक सप्ताह के लिए पूरी तरह से myelinated स्लाइसें प्राप्त करने के लिए, 2 दिनों के बाद और उनके पूरा करने के लिए एक और सप्ताह के ग्रासलेल्या चोटी तक पहुँचने के लिए रिमाइलनेशन । इसके अलावा, immunohistochemistry 2 दिनों में पूरा किया जा सकता है । प्रोटोकॉल यहां वर्णित 6 चूहों पिल्ले के एक मानक कूड़े के लिए अनुकूलित है और जरूरत के लिए नियोजित प्रयोग के लिए इस्तेमाल पशुओं की संख्या के बारे में अनुकूलित किया है ।

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Protocol

सभी काम संस्थागत नीतियों और UPMC, INSERM और फ्रांसीसी और यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देश के द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के अनुपालन के साथ पशुओं को शामिल 86/

1. संस्कृति माध्यम और संस्कृति आवेषण की तैयारी (हाथ-समय ≈ 10 – 15 मिनट पर)

नोट: बाँझ शर्तों के तहत एक प्रवाह संस्कृति हुड में इस चरण निष्पादित करें

  1. तैयार ४० मिलीलीटर संस्कृति माध्यम है, जो ५०% BME, 25% हैंक संतुलित नमक समाधान (1x), 25% गर्मी-निष्क्रिय हार्स सीरम, 2 मिमी glutamine व्युत्पंन, १०० IU/एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और ४.५ मिलीग्राम/एमएल डी-ग्लूकोज के साथ पूरक शामिल हैं । ७.४ को पीएच समायोजित करें ।
  2. फिल्टर-एक ०.२२ μm फिल्टर के माध्यम से मध्यम एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज पर अनुकूलित ।
    नोट: संस्कृति माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस से कम एक सप्ताह के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  3. 6 pups के एक मानक कूड़े के लिए, दो बाँझ 6-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करें । प्रत्येक थाली के लिए, कवर हटा दें और अच्छी तरह से प्रति संस्कृति मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. एक संस्कृति बाँझ संदंश के साथ प्लास्टिक किनारे धारण करके एक व्यक्ति को अच्छी तरह से डालने प्लेस । कवर को प्लेट पर वापस रख दें ।
    नोट: एक पिल्ला (6-8) से एकत्र अनुमस्तिष्क स्लाइसें दो झिल्ली पर भेजा जा सकता है (प्रति झिल्ली डालने 3-4 अनुमस्तिष्क स्लाइस) ।

2. विच्छेदन मध्यम की तैयारी (हाथ-समय ≈ 5 मिनट पर)

नोट: बाँझ शर्तों के तहत एक प्रवाह संस्कृति हुड में इस चरण निष्पादित करें

  1. १०० मिलीलीटर विच्छेदन माध्यम है, जो है Gey संतुलित नमक समाधान के साथ ४.५ मिलीग्राम/एमएल डी-ग्लूकोज और 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०० IU/
  2. फिल्टर-एक ०.२२ μm फिल्टर इकाई के माध्यम से मध्यम ।
    नोट: विच्छेदन माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस से कम एक महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  3. ६० मिमी सेल संस्कृति व्यंजन में शीत विच्छेदन मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें । प्रत्येक पिल्ला के लिए विच्छेद किया जा करने के लिए १ ६० मिमी सेल संस्कृति पकवान तैयार करते हैं ।
  4. प्रयोग होने तक बर्फ पर विच्छेदन व्यंजन रखें.

3. विच्छेदन सामग्री की तैयारी (हाथ-समय ≈ 15 मिनट पर)

  1. १००% इथेनॉल के साथ बेंच साफ ।
  2. सभी विच्छेदन उपकरण, एक रेगर ब्लेड और १००% इथेनॉल के साथ ऊतक हेलिकॉप्टर के प्लास्टिक मंच जीवाणुरहित ।
  3. उरेर ब्लेड और ऊतक हेलिकॉप्टर पर प्लास्टिक मंच को ठीक करने और काटने की मोटाई ३०० μm को समायोजित करें ।
  4. सुनिश्चित करें कि सभी इथेनॉल विच्छेदन शुरू करने से पहले काफूर है ।

4. अनुमस्तिकी अनुभाग और अनुभागों की तैयारी (हाथ-समय ≈ 15 – प्रति पशु-20 मिनट पर)

  1. ६० मिमी कोशिका संस्कृति के व्यंजन एक जगह है जिसमें बर्फ-शीत विच्छेदन माध्यम द्विनेत्री माइक्रोस्कोप से युक्त है और शीर्ष प्लेट को हटा दें ।
  2. swab ७०% इथेनॉल के साथ सिर फर (ध्यान से पशु की आंखों को छूने से परहेज) और बड़े तेज कैंची का उपयोग कर पशु सिर काटना, अनुमोदित प्रक्रिया के अनुसार ।
    नोट: सेरिबैलर स्लाइस P9-P10 चूहों से किसी भी विशिष्ट सेक्स या तनाव पूर्वाग्रह के बिना उत्पन्न होते हैं ।
  3. छोटे कैंची का प्रयोग गर्दन से शुरू सिर की मिडलाइन के साथ त्वचा में कटौती और माउस के लिए जा रहा है ।
  4. सिर पकड़ और खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए, वापस सिर के नीचे त्वचा बल गुना, और एक उंगलियों के बीच त्वचा के दो परतों चुटकी ।
  5. छोटी कैंची डालने रंध्र मैग्नम में धीरे और पक्ष की ओर एक पार्श्व चीरा बनाने के द्वारा खोपड़ी में कटौती और फिर सिर खोपड़ी के चारों ओर कटौती । समानांतर के रूप में कैंची की नोक रखो और संभव के रूप में खोपड़ी के पास जबकि काटने, मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए ।
  6. ठीक-सीधे forceps का उपयोग कर खोपड़ी के पृष्ठीय भाग को पुनः प्राप्त. ध्यान से खोपड़ी के पृष्ठीय भाग को उठाने के दौरान, मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए छोटे कैंची के साथ जरूरत है, तो पालन मेनिन्जेस (पारभासी सिंचित झिल्ली मस्तिष्क ऊतक आसपास) में कटौती ।
  7. ध्यान से ठीक-सीधे संदंश परिचय (या वैकल्पिक रूप से अधर खोपड़ी और मस्तिष्क के बीच एक spatula का उपयोग करें), धीरे से बाहर मस्तिष्क फ्लिप और छोटे कैंची के साथ ऑप्टिक और नसो मे नसों में कटौती ।
  8. मस्तिष्क में गुरुत्वाकर्षण द्वारा ड्रॉप करने के लिए मदद ६० मिमी कोशिका संस्कृति बर्फ की ठंड विच्छेदन माध्यम से सिर्फ पकवान ऊपर नीचे सिर मोड़ और छोटे कैंची के साथ पिछले आसंजन अगर जरूरत से युक्त पकवान ।
  9. ठीक forceps का उपयोग कर, शोधकर्ता का सामना करना पड़ पक्ष के साथ मस्तिष्क मालूम, और अधर पक्ष पकवान के तल पर झूठ बोल रही है ।
  10. दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत, ठीक है-सीधे संदंश का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क की ओर दिमाग स्थिर और हिंदमस्तिष्क को छूने से बचें, क्योंकि यह क्षतिग्रस्त हो सकता है । मस्तिष्क के आराम (सामने और midbrain, चित्रा 1Aaपर योजनाबद्ध देखें), ठीक-सीधे forceps का उपयोग कर से हिंदमस्तिष्क अलग । मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से सेरिबैलम अलग करने के लिए, ठीक संदंश सेरिबैलम नीचे सेरिबैलर peduncles में कटौती करने के लिए उपयोग करें ( चित्र 1aaपर योजनाबद्ध देखें ') ।
  11. एक बार सेरिबैलम अलग है, ध्यान से दूर ठीक-सीधे संदंश का उपयोग मेनिन्जेस आंसू ( चित्रा 1aaपर योजनाबद्ध देखें ')।
  12. ठीक घुमावदार संदंश के साथ धीरे सेरिबैलम पकड़ो और यह हेलिकॉप्टर उरेर ब्लेड के लिए लंबवत प्लास्टिक मंच पर ऊपर पृष्ठीय पक्ष के साथ जगह ( चित्रा 1bbपर योजनाबद्ध देखें) ।
  13. एक 1 मिलीलीटर पिपेट पर अनुकूलित एक बाँझ पतली अंत पिपेट टिप का उपयोग कर सेरिबैलम के आसपास विच्छेदन मध्यम से किसी भी अतिरिक्त महाप्राण ( चित्रा 1Bbपर योजनाबद्ध देखें) ।
  14. सुनिश्चित करें कि सेरिबैलम फ्लैट देता है, लेकिन फैला नहीं है, एक बार के लिए परिच्छेदन के दौरान इष्टतम सममितार्ल स्लाइस पाने के लिए मंच पर रखा ( चित्रा 1bbपर योजनाबद्ध देखें) ।
  15. ऊतक हेलिकॉप्टर ( चित्र 1Bb 'पर योजनाबद्ध देखें) के साथ सेरिबैलम के ३०० μm-मोटी सैटिटल वर्गों टुकड़ा । बल और ब्लेड की गति साइट पर अनुकूलित किया जाना है ।
  16. धीरे कटा हुआ cerebellum पर विच्छेदन मध्यम की एक बूंद जोड़ें । एक विस्तृत-बोर पिपेट एक 1 मिलीलीटर पिपेट पर रखा टिप का उपयोग कर, धीरे से कटा हुआ सेरिबैलम महाप्राण और इसे वापस हस्तांतरण में ६० मिमी सेल संस्कृति आइस-शीत विच्छेदन मध्यम युक्त पकवान ( चित्र 1bbपर योजनाबद्ध देखें ' ') ।
  17. एक सेरिबैलम टुकड़ा करने की क्रिया के बीच १००% इथेनॉल के साथ ऊतक हेलिकॉप्टर के प्लास्टिक मंच साफ । अगले सेरिबैलम को प्लेटफार्म पर रखने से पहले एथेनॉल को वाष्पीकरण कर दें ।
  18. व्यक्तिगत स्लाइस अलग करने के लिए दो ठीक-सीधे संदंश (या वैकल्पिक रूप से टाइटेनियम सुई) का प्रयोग करें और वर्मिस से 6-8 स्लाइस का चयन करें ( चित्रा 1cc और 1ccपर योजनाबद्ध देखें ').
  19. संस्कृति आवेषण के साथ एक 6-well थाली ले लो और एक संस्कृति डालने पर 4 चयनित स्लाइस करने के लिए स्थानांतरण कुछ विच्छेदन माध्यम के साथ, एक विस्तृत-बोर पिपेट टिप एक 1 मिलीलीटर पिपेट पर अनुकूलित का उपयोग कर ( चित्र 1Ccपर योजनाबद्ध देखें ') ।
  20. संस्कृति के बीच में स्लाइस रखें विच्छेदन माध्यम या संदंश का उपयोग कर डालने के लिए धक्का और उंहें खींच धीरे सही स्थान में, उंहें एक दूसरे के साथ संपर्क में होने से परहेज ( चित्रा 1ccपर योजनाबद्ध देखें ') ।
  21. एक पतली अंत पिपेट टिप का उपयोग कर स्लाइस के आसपास विच्छेदन मध्यम से किसी भी अतिरिक्त निकालें । सुनिश्चित करें कि स्लाइस झिल्ली पर फ्लैट रखना ( चित्र 1Cc 'पर योजनाबद्ध देखें) ।
  22. 6-अच्छी तरह से प्लेट में रखें तुरंत बाद झिल्ली पर स्लाइस जोड़ दिया ।

5. स्लाइसें संस्कृति और ग्रासलेल्या (हाथ-समय ≈ 15 – 20 मिनट पर)

नोट: बाँझ शर्तों के तहत एक प्रवाह संस्कृति हुड में इस चरण निष्पादित करें

  1. कल्चर मीडियम को 1 mL के साथ पहले से अच्छी तरह से बदलें और स्लाइस तैयार करने के बाद हर 3 दिन में ताजा कल्चर मीडियम को गर्म करें ।
  2. ग्रासनेलिनेशन के लिए, विट्रो (DIV) में 6 दिनों के बाद कल्चर आवेषण के नीचे के सभी कल्चर मीडियम को हटा दें और इसे 1 mL के साथ पूर्व-गर्म ताजा कल्चर मीडियम के अनुसार ०.५ मिलीग्राम/एमएल एलपीसी से बदलें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15-17 एच के लिए इनसेबेट, 5% सह2।
  3. ऊष्मायन के बाद, उन्हें एक 25 मिमी पेट्री डिश में रखकर आवेषण को धो लें, जिसमें 1 मिलीलीटर पूर्व-गर्म संस्कृति माध्यम शामिल है ।
    नोट: आवेषण के माध्यम से संपर्क में होना चाहिए, लेकिन इसके द्वारा कवर नहीं किया जाना चाहिए ।
  4. तुरंत ताजा पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम युक्त एक नई 6-well थाली में संस्कृति आवेषण हस्तांतरण ।
  5. पूर्व गर्म ताजा संस्कृति मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ संस्कृति मध्यम हर 2-3 दिनों के लिए स्लाइसें निर्धारण तक बदलें ।

6. Immunohistochemistry (हाथ-समय ≈ 1:30 – 2 ज पर)

नोट: ६.१ कदम बाहर ले । से ६.३. एक धूआं डाकू के तहत । पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के लिए प्रदर्शनी से बचें और पर्याप्त हेरफेर और सुरक्षा के लिए उत्पाद सुरक्षा डेटापत्रक का संदर्भ लें ।

  1. प्लास्टिक किनारे को पकड़कर प्रत्येक कल्चर आवेषण को लिफ्ट करने के लिए संदंश का प्रयोग करें और प्रत्येक कूप से झिल्ली आवेषण के नीचे कल्चर मीडियम को हटा दें ।
  2. 1x PBS पीएच ७.४ में झिल्ली आवेषण पर 4% पीएफए के 2 मिलीलीटर जोड़कर 30 मिनट के लिए अनुमस्तिष्क स्लाइस ठीक करें ।
    नोट: निर्धारण के समय बिंदु myelination अध्ययन के मंच पर निर्भर करता है: 4 DIV myelination की शुरुआत करने के लिए संगत, 7 पूरी तरह से myelination स्लाइस DIV । LPC उपचार के मामले में, 9 DIV ग्रासलेल्या के शिखर से मेल खाती है, 11 रिमायलिनेशन की शुरुआत करने के लिए DIV और पूरी तरह remyelination स्लाइस करने के लिए 14 DIV ।
  3. 10 मिनट के लिए 2 मिलीलीटर 1x PBS के साथ तीन बार स्लाइस के साथ सम्मिलित करता है धोने.
  4. एक 25x 30x आवर्धन करने के लिए, धीरे से उन्हें एक स्केलपेल या एक ब्रश का उपयोग करके धक्का द्वारा दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत झिल्ली सम्मिलित करता है से स्लाइस अलग । वैकल्पिक रूप से, उन्हें झिल्ली से अलग करते समय स्लाइस को नुकसान पहुँचाने के जोखिम से बचने के लिए, अभी भी संलग्न स्लाइस के साथ झिल्ली में कटौती करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें ।
  5. एक ब्रश का उपयोग कर, 1x PBS युक्त 4-कूप प्लेट के कुओं में फ़्लोटिंग स्लाइसें स्थानांतरित करें ।
  6. प्रत्येक कूप से पीबीएस महाप्राण और 15 से 20 मिनट के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा १००% इथेनॉल में स्लाइस सेते । यह कदम myelinated फाइबर में एंटीबॉडी प्रवेश की सुविधा ।
  7. महाप्राण १००% इथेनॉल और धोने 1x PBS के साथ एक बार संक्षेप में, तो दो बार 1x PBS में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ।
  8. PBS महाप्राण और 1x PBS, 5% NGS, ०.३% गैर-ionic डिटर्जेंट के कमरे के तापमान पर गैर विशिष्ट एंटीबॉडी निर्धारण साइटों को ब्लॉक से युक्त समाधान के साथ 30 से ४५ मिनट के लिए स्लाइस सेटे ।
  9. अवरुद्ध समाधान महाप्राण । कोई धुलाई आवश्यक है ।
  10. 4 ° c पर अवरोध समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर स्लाइस सेटे । अनुमस्तिष्क organotypic स्लाइस पर myelin कल्पना करने के लिए, MBP (चिकन, 1/150 या माउस IGg2b, Smi99, 1/200) या PLP (चूहा, संकर डोमा, 1/5 1/10) एंटीबॉडी का उपयोग करें ।
    नोट: एक ही स्लाइस में एक से अधिक प्रतिजन की अभिव्यक्ति प्रकट करने के लिए, डबल-या ट्रिपल धुंधला करने की प्रक्रिया निष्पादित करें ( चित्र 1 को उदाहरण के रूप में देखें) । एक साथ ऊष्मायन करने के लिए, सुनिश्चित करें कि प्राथमिक एंटीबॉडी विभिन्न प्रजातियों में उत्पादित कर रहे हैं । फिर, अलग फ्लोरोफोरेज़ के साथ उनके इसी माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें (नोडल और पैरानोडल मार्कर18 एंटीबॉडी के लिए सामग्री की मेज देखें) ।
  11. दूसरे दिन, स्लाइस धोने 1x PBS में तीन बार 10 मिनट के लिए ।
  12. 3h के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते (1/500 कमजोर पड़ने) समाधान अवरुद्ध में कमरे के तापमान पर अंधेरे में पतला ।
    नोट: एंटीबॉडी कमजोर पड़ने और ऊष्मायन समय के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है जब अंय एंटीबॉडी का उपयोग करने वालों की तुलना में यहां वर्णित है ।
  13. स्लाइस धो लें 1x PBS में तीन बार अंधेरे में 10 मिनट के लिए ।
  14. एक दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत, एक गिलास स्लाइड पर स्लाइस माउंट । स्लाइड पर 1x PBS के १०० μL प्लेस और एक ब्रश का उपयोग कर PBS में स्लाइस हस्तांतरण । यदि आवश्यक हो तो स्लाइस प्रकट करना और स्लाइड पर उन्हें समतल करना. PBS के किसी भी अतिरिक्त निकालें । मामले में immunolabeling अभी भी झिल्ली से जुड़े स्लाइस के साथ किया जाता है, coverslip का सामना करना पड़ स्लाइस के साथ माउंट, कांच स्लाइड पर झिल्ली के साथ.
  15. सीधे कांच coverslip पर बढ़ते माध्यम की एक बूंद प्लेस और धीरे स्लाइस कवर । घुड़सवार स्लाइड अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।

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Representative Results

organotypic सेरिबैलर स्लाइस में प्रतिनिधि myelin immunostainings के उदाहरण P9-P10 C57black6 जंगली-प्रकार (WT) (चित्रा 2A), साथ ही plp-gfp ट्रांसजेनिक चूहों (चित्रा 2a), के साथ साथ प्राप्त की प्रकिंजे कोशिकाओं धुंधला । सेरिबैलर स्लाइसें सफेद पदार्थ से myelinate स्लाइस की परिधि की ओर स्लाइस के क्षेत्र पटरियों और प्रकिंजे कोशिकाओं के myelinate ज्यादातर 6 से 7 DIV के बाद हासिल की है । 7 DIV में, एक पूर्ण ग्रासलेल्या की प्रेरण LPC उपचार के माध्यम से संभव है (चित्रा 2Ci-ii) । ग्रासलेल्या के बाद, स्लाइसें सहज remyelinate और पूरी तरह से 6-7 दिनों के बाद ग्रासलेल्या (चित्रा 2Ciii) के शिखर के बाद remyelinate हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: सेरिबैलम स्लाइसें पीढ़ी का चित्रण । विच्छेदन तीन मुख्य चरणों में बांटा गया है । (क) सेरिबैलम अलग है और मेनिनिजेस को हटा दिया गया है (कदम ४.१० और ४.११) । (ख) सेरिबैलम तो हेलिकॉप्टर प्लेटफॉर्म पर स्थानांतरित कर दिया है और कटा हुआ (कदम ४.१२ से ४.१६) । (ग) अंत में, स्लाइस वर्मिस से अलग कर रहे है और एक झिल्ली डालने पर रखा । विच्छेदन मध्यम स्लाइस के साथ स्थानांतरित कर दिया और 6-अच्छी तरह से थाली को मशीन में रखा गया है (कदम ४.१८ और ४.२२) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: myelinated अनुमस्तिष्क स्लाइसें सुसंस्कृत ex vivo का उदाहरण । इमेज टैक् स (लांबिक प्रक्षेपण के साथ) एक ईमानदार संनाभि माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, जो नि: शुल्क फ्लोटिंग इमम् लाबेलिंग और फ्लैट बढ़ते हुए प्रोटोकॉल में वर्णित है । स्लाइस 11 DIV (एक, plp पर myelinated) है । बी, हरे रंग में gfp) और axonal डोमेन के रूप में मनाया वीवो में वोल्टेज-gated सोडियम चैनल (Nav, लाल रंग में) में समृद्ध ranvier के नोड्स के साथ पैरानोडल axoglial जंक्शन डोमेन (caspr, सफेद में) C57black6 wt में Flanked (एक ) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से PLP-GFP (ख) ट्रांसजेनिक चूहों स्लाइस । (ग) प्रमस्तिष्कीय प्रांतस्था वास्तुकला को सुसंस्कृत स्लाइस में संरक्षित रखा गया है, जैसा कि पीएलपी-जीएफपी चूहों से अनुमस्तिष्क स्लाइस पर देखा गया है । (i) संस्कृति में एक सप्ताह के बाद प्रकिंजे कोशिकाएं अक्षों (कैल्बिडीं, कैलब, नीले रंग में) को एक सप् ताह के बाद, हरित रूप से माइलनीकृत (जीएफपी, हरी में) कर रहे हैं । (ii) एलपीसी उपचार पूरी तरह से स्लाइसें, जो अनायास remyelinate और पूरी तरह से remyelinate 6 दिनों के बाद ग्रासलेल्या (III, 14 DIV) । स्केल बार्स = 20 μm (A, B); १०० μm (C). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां, हम विस्तार से एक प्रोटोकॉल के लिए एक पूर्व vivo मॉडल उत्पंन करने के लिए माउस अनुमस्तिष्क organotypic टुकड़ा संस्कृतियों, पहले प्रकाशित तरीकों15,16,19 और बाद myelin से अनुकूलित इन तैयारियों का प्रतिरोदन । यह रणनीति दोनों स्वस्थ और रोगविज्ञानी राज्यों में एक उच्च संकल्प के साथ myelin घटकों कल्पना करने की संभावना प्रदान करता है ।

अनुमस्तिष्क ऑर्गेनोप्ररूपी स्लाइस 10 दिन पुराने चूहों से लिया संस्कृतियों एक अच्छी तरह से स्थापित प्रयोगात्मक मॉडल के लिए आणविक और सेलुलर myelination और remyelination प्रक्रियाओं अंतर्निहित तंत्र की जांच कर रहे हैं, के रूप में यह सबसे अधिक संरचनात्मक पुनरुत्पादन की अनुमति देता है और विवो में इसी ऊतक की कार्यात्मक विशेषताएं न केवल एक अच्छी तरह से परिभाषित सेलुलर वास्तुकला का संरक्षण भी शामिल है, लेकिन परिपक्वता समयरेखा17। इसके अलावा, अनुमस्तिष्क स्लाइस एक संरक्षित वास्तु संगठन है दो सप्ताह के बाद विट्रो में (चित्रा 1c) । ट्रांसजेनिक PLP-GFP तनाव एक विकल्प है, विशेष रूप से, जीने स्लाइस पर एक फ्लोरोसेंट दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत myelination स्थिति का निरीक्षण करने के लिए, जो विशेष रूप से डेमीलिनेशन के लिए सुविधाजनक है-remyelination अध्ययन (चित्रा 1 सी ).

ये तैयारी एक तेजी से दृष्टिकोण के रूप में विकसित स्वचालित परिमाणीकरण के साथ myelination दर का आकलन करने के लिए विशेष रुचि के हैं, सहित पश्चिमी ब्लाटर विश्लेषण20, cnpase परख16 या plp का परिमाणन/calbindin (या mbp/ calbindin) अभिरंजक17,21, इस प्रकार एक उच्च थ्रपुट प्रणाली का प्रतिनिधित्व करने विकारों22,23demyelinating में औषधीय दवाओं के परीक्षण के लिए अनुमति देता है ।

मुख्य महत्वपूर्ण मुद्दों में से एक है जब इन प्रयोगों प्रदर्शन अनुमस्तिष्क स्लाइस की गुणवत्ता से संबंधित हो सकता है । सबसे पहले, चूहों की उंर अनुमस्तिष्क ऑर्गेनोप्ररूपी टुकड़ा संस्कृतियों के लिए महत्व का है । प्रकिंजे कोशिकाओं के अस्तित्व, सेरिबैलर संस्कृतियों में केवल myelinated ंयूरॉन, अगर संस्कृतियों P2 से P7 कुतर या दाताओं के साथ पुराने17P13 से तैयार कर रहे है समझौता किया है । अधिक आम तौर पर, organotypic मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों वयस्कों जानवरों से प्राप्त करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं । दूसरे, विच्छेदन के दौरान ऊतक प्रसंस्करण की अवधि महत्वपूर्ण है, प्रति जानवर 15-20 मिनट से अधिक की एक विच्छेदन कदम के रूप में स्लाइस की जीवित रहने की दर में गिरावट की ओर जाता है । इसके अलावा, जब स्लाइसें का चयन करने के लिए, यह सबसे अच्छा है कि न्यूरॉन्स के गरीब अस्तित्व और myelinated फाइबर के परिणामस्वरूप कमी के कारण सेरिबैलम के दोनों छोर से लोगों का उपयोग करने से बचने के लिए ।

जबकि संस्कृति में तापमान और सह2 एकाग्रता की स्थिरता के रूप में अंय मानकों के लिए टुकड़ा स्वास्थ्य सुनिश्चित करने के कारकों का निर्धारण कर रहे हैं । अंत में, स्लाइस की गुणवत्ता घोड़े सीरम की संरचना से प्रभावित है, जो उपयोगकर्ताओं द्वारा नियंत्रित नहीं किया जा सकता है । इसलिए, सीरम के कई बैचेस परीक्षण अत्यधिक की सिफारिश की है ।

एक पर्याप्त लेबलिंग प्राप्त करने के लिए, ऊतक निर्धारण एक महत्वपूर्ण कदम है । इस एंटीबॉडी के प्रवेश की सुविधा के लिए myelin एंटीजन तक पहुंचने के लिए, के रूप में myelin एक बहुत कॉंपैक्ट संरचना है, स्लाइसें पूर्व पूर्ण इथेनॉल के साथ इलाज के बाद निर्धारण की सलाह दी है । धुंधला के समान प्रोटोकॉल आगे vivo स्थिर ऊतकों में लागू किया जा सकता है, हालांकि triton एकाग्रता vibratome की मोटाई या vivo वर्गों में उत्पंन cryostat करने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है । गैर-वाणिज्यिक एंटीबॉडी की उपलब्धता पर भी विचार किया जाना चाहिए. ट्रांसजेनिक चूहों से स्लाइस तैयार करना जैसे PLP-GFP24 या CNP-gfp25 इस प्रकार myelin और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स प्रक्रियाओं की कल्पना करने के लिए एक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित immunochemical विधियों के अलावा, अन्य तरीकों सामांयतः myelin वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है । पूरक तकनीक भी myelin ultrastructure की जांच करने के लिए मौजूद हैं, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ सोने के मानक26जा रहा है । अन्य तकनीकें मौजूद हैं, जैसे कि लेबल-मुक्त दृष्टिकोण जैसे ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी27,28, रमन कैटरिंग28,29, थर्ड हार्मोनिक जनरेशन30 या स्पेक्ट्रल संनाभि परावर्तकता माइक्रोस्कोपी31; इन दृष्टिकोणों में गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के प्रेक्षण को सक्षम करने का अतिरिक्त लाभ होता है । हालांकि, इन तकनीकों में से कुछ जटिल है और आगे राज्य के अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी सेट अप की आवश्यकता है । इन कारणों के लिए, प्रतिरक्षा प्रतिदीप्ति लेबलिंग द्वारा myelin अध्ययन एक मानक दृष्टिकोण है myelin और विभिंन विकासात्मक या अधिग्रहीत रोगों और उनके मॉडलों में अपने दोषों की जांच करने के लिए, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भविष्य में चिकित्सीय क्षमता का आकलन उपचार. यह आगे सीखने और plasticity के रूप में कई संदर्भों, में myelination अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उंर बढ़ने, अवसाद, या autism में myelination३२परिवर्तित किया जा करने के लिए जाना जाता है ।

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Disclosures

लेखकों में से कोई भी हितों या परस्पर विरोधी हितों प्रतिस्पर्धा नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ शॉन Freeman, डॉ नथली सोल-Foulon और डॉ थॉमस रॉक्स धंयवाद पांडुलिपि पर बहुमूल्य टिप्पणियों के लिए । इस काम के लिए वित्त पोषित किया गया था INSERM, आईसीएम, ARSEP अनुदान R13123DD, ANR R17127DD (करने के लिए ईसवी) और FRM फैलोशिप, SPF20110421435 (ईसवी सन्), FDT20170437332 (to एमटी) । हम CELIS सेल संस्कृति सुविधा और icm धंयवाद । क्वांट इमेजिंग प्लेटफॉर्म ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BME medium ThermoFisher Scientific 41010026
Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS) ThermoFisher Scientific 14180046
GlutaMAX (100x) ThermoFisher Scientific 35050038
Heat-inactivated Horse Serum ThermoFisher Scientific 26050088
Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
Gey’s Balanced Salt Solution Sigma Aldrich G9779-500ML
D-Glucose Solution (45%) Sigma Aldrich G8769-100ML
Lysophosphatidylcholine (LPC) Sigma Aldrich L4129-100MG
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15714
Absolute ethanol (100% ethanol) VWR Chemicals 20821.330 Cooled at -20°C
Triton® X-100 Sigma Aldrich X100-500ML
10% Normal Goat Serum (NGS) ThermoFisher Scientific 500622
Phosphate Buffer Solution EuroMEDEX ET330-A pH 7.4
Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) Merck Millipore 06-896 Dilution 1/300
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) Merck Millipore AB9348 Dilution 1/150
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) Merck Millipore NE1019 Dilution 1/200
Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan Dilution 1/5 to 1/10
Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) Sigma Aldrich S8809 Dilution 1/150
Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) Abcam ab34151 Dilution 1/500
Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 ThermoFisher Scientific Dilution 1/500
Fluoromount SouthernBiotech 0100-20
Tissue chopper McIlwain
Razor blades
Large scissors F.S.T 14101-14
Small scissors F.S.T 91500-09
Fine-straight forceps F.S.T 91150-20
Curved-fine forceps F.S.T 11297-00
Cell culture dishes (60 mm and 100 mm) TPP
4-, 6-well culture plates TPP
Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter) Merck Millipore PICM0RG50
Cell culture incubator 37°C, 5% CO2
Fine-end pipette tips Dutscher 134000CL
Wide-bore pipette tips ThermoFisher Scientific 2079G
Sterile syringe Terumo Europe 20 or 50 mL
Sterile syringe filters Terumo Europe 0.22 µm
Scalpel Swann-Morton 0510
Brush
Microscope slides RS France 76 mm x 26 mm x 1.1 mm
Glass coverslips RS France 22 mm x 22 mm
Kimtech Sciences Tissue Wipers Kimberly-Clark Professional 5511
Binocular microscope

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References

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तंत्रिका विज्ञान मुद्दा १४५ Organotypic संस्कृतियों immunostaining myelin केंद्रीय तंत्रिका syste cerebellum मरंमत
तैयारी और Myelinating ऑर्गेनोप्ररूपी अनुमस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों का Immunostaining
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Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. … More

Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. J. Vis. Exp. (145), e59163, doi:10.3791/59163 (2019).

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