Aquí presentamos un método para preparar organotypic culturas rebanada de cerebelo de ratón y la vaina de mielina de tinción por inmunohistoquímica adecuado para investigar mecanismos de myelination y remielinización en el sistema nervioso central.
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Artículo de método
Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas
En este artículo
Resumen
Resumen
En el sistema nervioso, la mielina es una estructura compleja de la membrana generada por myelinating glial de las células, que axones ensheathes y facilita la conducción eléctrica rápido. Alteración de la mielina se ha demostrado para ocurrir en varias enfermedades neurológicas, donde se asocia con déficits funcionales. Aquí, ofrecemos una descripción detallada de una ex modelo vivo que consiste en rodajas cerebelosa organotypic de ratón, que se pueden mantener en cultivo por varias semanas y aún más ser etiquetado para visualizar la mielina.
Introducción
Las neuronas son células altamente polarizadas, que comprenden un compartimiento somato-dendrítica que recibe entradas de su medio ambiente y un axón que garantice la generación y propagación de impulsos eléctricos a otras células. Propagación rápida y oportuna entrega de información es esencial para el buen funcionamiento del sistema nervioso. En los vertebrados, se facilita por la mielinización, que permite aumentar la velocidad de conducción axonal1. Mielina es una estructura especializada formada por capas compactadas de membrana del plasma generado por la glia myelinating, es decir, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (CNS) y c....
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Protocolo
Todo trabajo con animales el cumplimiento de las políticas institucionales y lineamientos establecidos por el UPMC, INSERM y el francés y Directiva Comunidad Europea 86/609/CEE.
1. preparación de medio de cultivo y cultura inserta (práctica tiempo ≈ 10-15 min)
Nota: Realizar este paso en una campana de cultivo de flujo bajo condiciones estériles
- Preparar 40 mL de medio de cultivo, que consiste en 50% BME, solución salina equilibrada de Hank 25% (1 x), 25% inactivado con calor caballo suero, suplementado con 2 mM glutamina derivado, 100 UI/mL penicilina-estreptomicina y 4,5 mg/mL de D-gl....
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Resultados
Ejemplos de mielina representante immunostainings en rebanadas cerebelosa organotypic obtenidos P9-P10 C57black6 wild-type (WT) (figura 2A), así como de ratones transgénicos de PLP-GFP (figura 2B), junto con la tinción de las células de Purkinje. Myelinate de la materia blanca cerebelosas rebanadas pistas región de las láminas hacia la periferia de la folia y mielinización de las células de Purkinje se obtiene sobre todo después .......
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Discusión
Aquí detallamos un protocolo para generar un ex vivo modelo correspondientes a las culturas de rebanada de ratón organotypic cerebelosa, adaptado de previamente métodos publicados15,16,19 y la mielina posterior inmunotinción de estos preparados. Esta estrategia ofrece la posibilidad de visualizar los componentes de la mielina con una alta resolución en Estados sanos y patológicos.
Cerebelosa organotyp.......
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tienen intereses en competencia o conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon y Dr. Thomas Roux valiosos comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por el INSERM, ICM, ARSEP becas R13123DD, R17127DD de la ANR (para DC) y beca FRM, SPF20110421435 (para DC), FDT20170437332 (a M.T.). Agradecemos a las instalaciones de cultura de célula CELIS y la RIC. Plataforma de proyección de imagen de Quant.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio BME | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank' s Solución salina equilibrada (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Suero de caballo inactivado por calor | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicilina– Estreptomicina (10.000 UI/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey' s Solución salina equilibrada | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| Solución de D-glucosa (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lisofosfatidilcolina (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehído (PFA) | Microscopía electrónica Ciencias | 15714 | |
| Etanol absoluto (100% etanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Enfriado a -20 grados; C |
| Tritón® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Suero de Cabra Normal (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Solución tampón de fosfato | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anticuerpo anti-GFP (policlonal, pollo) | Merck Millipore | 06-896 | Dilución 1/300 |
| Anticuerpo anti-mielina proteína básica (MBP) (policlonal, pollo) | Merck Millipore | AB9348 | Dilución 1/150 |
| Anticuerpo anti-Proteína Básica de Mielina (MBP) (Monoclonal, IgG2b de ratón) | Merck Millipore | NE1019 | Dilución 1/200 |
| Anticuerpo Anti-PLP (Rata, Hibridoma) | Regalo del Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japón | Dilución 1/5 a 1/10 | |
| Canal antisódico, anticuerpo Pan (monoclonal, IgG1 de ratón, clon K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilución 1/150 |
| Anticuerpo anti-Caspr (policlonal, conejo) | Abcam | ab34151 | Dilución 1/500 |
| Anticuerpos secundarios de cabra conjugados con Alexa Fluor 488, 594, 647 o 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Picadora de tejidos | McIlwain | ||
| Hojas de afeitar Tijeras | |||
| grandes | F.S.T | 14101-14 | |
| Tijeras pequeñas | F.S.T | 91500-09 | |
| Pinzas finas-rectas | F.S.T | 91150-20 | |
| Pinzas curvas-finas | F.S.T | 11297-00 | |
| Placas de cultivo celular (60 mm y 100 mm) | TPP | ||
| Placas de cultivo de 4 y 6 pocillos | TPP | ||
| Insertos de cultivo Millicell (0,4 y micro; m, 30 mm de diámetro) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Incubadora de | celulares 37° C, 5% CO2 | ||
| Puntas de pipeta de punta fina | Dutscher | 134000CL | |
| Puntas de pipeta de diámetro ancho | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Jeringa estéril | Terumo Europe | 20 o 50 mL | |
| Filtros de jeringa estériles | Terumo Europe | 0.22 µ m | |
| Bisturí | Swann-Morton | 0510 | |
| Portaobjetos de microscopio | de | ||
| Cubreobjetos de vidrio | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tejidos Limpiadores | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Microscopio | binocular |
Referencias
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple scleros....
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Reimpresiones y permisos
