Her præsenterer vi en protokol for at analysere Aspergillus flavus vækst og aflatoksin produktion i majs kerner udtrykker en svampedræbende protein. Ved hjælp af en normal god landbrugspraksis-udtrykker A. flavus stamme overvåges vi af infektion og spredning af svamp i modne kerner i realtid. Analysen er hurtig, pålidelig og reproducerbar.
Aflatoksinforureningen i fødevare-og er en stor udfordring på verdensplan. Aflatoksiner, produceret af svampen Aspergillus flavus (A. flavus) er potent kræftfremkaldende, der væsentligt reducerer afgrøde værdi i majs og andre olie rig afgrøder som peanut udover alvorlig trussel for menneskers og dyrs sundhed. Forskellige metoder, herunder traditionelle avl, transgene udtryk for modstand knyttet proteiner og RNA-interferens (RNAi)-baseret vært-induceret genhæmning af kritiske A. flavus gen målene, evalueres for at øge aflatoksin modstand i modtagelige afgrøder. Tidligere undersøgelser har vist en vigtig rolle i α-amylase i A. flavus patogenese og aflatoksin produktion, tyder dette gen/enzym er et potentielt mål at reducere både A. flavus vækst og aflatoksin produktion. I denne forbindelse den aktuelle undersøgelse var forpligtet sig til at evaluere Heterolog ekspression (under kontrol af konstitutiv CaMV 35S -promotoren) af en hjelmbønne purpureus L. α-amylase inhibitor-lignende protein (AILP) i majs mod A. flavus. AILP er en 36-kDa protein, som er en kompetitiv inhibitor af A. flavus α-amylase enzym og tilhører lektin-arcelin-α-amylase inhibitor protein familie i fælles bønne. In vitro undersøgelser forud for det aktuelle arbejde havde vist AILP rolle i hæmning af A. flavus α-amylase aktivitet og svampevækst. Svampevækst og aflatoksin produktion i modne kerner blev overvåget i realtid ved hjælp af en normal god landbrugspraksis-udtrykker A. flavus stamme. Denne kerne screening assay (KSA) er meget enkel at sætte op og giver pålidelig og reproducerbar data på infektion og omfanget af spredning, der kunne kvantificeres for evalueringen af kimplasma og transgene linjer. Fluorescens fra stammen, normal god landbrugspraksis er tæt korreleret til svampe vækst, og i forlængelse heraf er det godt korreleret til aflatoksin værdier. Målet med den nuværende arbejde var at gennemføre denne tidligere viden i et kommercielt vigtige afgrøder som majs til at øge aflatoksin modstand. Vores resultater viser en 35% – 72% reduktion i A. flavus vækst i AILP-udtrykker transgene majs kerner, som til gengæld oversat til en 62-88% reduktion i aflatoksinindholdet.
Mykotoksin kontaminering af svampe slægterne, Aspergillus, Fusarium, Penicilliumog Alternaria er et stort problem for fødevarer og foder afgrøder, der dyrkes på verdensplan1,2,3. Blandt disse plantepatogene svampe har Aspergillus den største skadelige indvirkning på afgrøde værdi og menneskers og dyrs sundhed. Aspergillus flavus (A. flavus) er en opportunistisk plante-patogen, der inficerer olie rig afgrøder såsom majs, bomuldsfrø og peanut og producerer de potent kræftfremkaldende stoffer, aflatoksiner, samt talrige giftige sekundære metabolitter (SMs). Majs er en vigtig fødevare og fodre afgrøder dyrkes på verdensplan og er meget modtagelige for forurening af A. flavus. De økonomiske konsekvenser af Aflatoksinforureningen på mister og reducerede værdi i majs kan være så meget som $686.6 mio i USA2 med forventede ændringer i globale klima, virkningen af aflatoksiner kunne resultere i større økonomiske tab i majs med skøn så højt som $1,68 milliarder pr. år i den i nærheden af fremtidige2. I betragtning af de negative økonomiske og sundhedsmæssige virkninger af aflatoksiner i mennesker og husdyr, kunne før høst aflatoksin kontrol i majs være den mest effektive måde at forhindre aflatoksinindholdet i levnedsmidler og foder produkter.
Den store før høst kontrol tilgang til aflatoksin resistens i majs, som har været udbredt i de seneste årtier er primært gennem avl, som kræver en betydelig mængde tid4. For nylig, biocontrol har haft en vis succes i aflatoksin reduktion i stor skala felt programmer5,6. Udover biocontrol, har anvendelse af avanceret Molekylær værktøjer såsom ‘Vært induceret genhæmning’ (HIGS) gennem RNAi og transgene udtryk for modstand-associerede proteiner haft en vis succes i reduktion af A. flavus vækst og aflatoksin produktion i lille målestok laboratorie- og undersøgelser. Disse tilgange er i øjeblikket ved at blive optimeret udover at identificere nye potentielle A. flavus gen mål for fremtidige manipulation.
Udover gener, der er direkte involveret i mykotoksin produktion som potentielle mål af transgene kontrolstrategier, har svampe amylaser vist sig at spille en afgørende rolle i at opretholde vellykket patogenese og mykotoksin produktion under vorden af værten plante infektion. Et par eksempler kan nævnes Pythium pleroticum (kausal agent af ingefær rhizom rot), Fusarium solani (kausal agent af blomkål visnesyge), hvor positive korrelationer mellem patogenicitet og α-amylase udtryk og aktivitet blev observeret 7,8. Hæmning af α-amylase aktivitet enten gennem gen knockout eller knockdown tilgange påvirker negativt svampe vækst og toksin produktion. En α-amylase knockout mutant af A. flavus var ude af stand til at producere aflatoksiner når dyrkes på stivelse substrat eller degermed majs kerner9. På samme måde i Fusarium verticillioides undladt en α-amylase knockout stamme at producere fumonisin B1 (mykotoksin) under infektion af majs kerner10. I en nyere undersøgelse viste Gilbert et al. (2018), at et RNAi-baserede banke ned af A. flavus α-amylase udtryk gennem HIGS betydeligt reduceret A. flavus vækst og aflatoksin produktion under majs kerne infektion11 .
Specifikke hæmmere af α-amylase aktivitet har også produceret lignende resultater som fremstillet af ned-regulering af α-amylase udtryk. Den første rapport om rollen af en α-amylase hæmmer i svampe modstand kom fra isolering og karakterisering af en 14-kDa trypsin-α-amylase hæmmer fra majs linjer resistente over for A. flavus12. Yderligere screening af flere hundreder af plantearter af Fakhoury og Woloshuk førte til identifikation af en 36-kDa α-amylase inhibitor-lignende protein (AILP) af frøene fra hyacinth bønner, hjelmbønne purpureus L.13. Peptid sekvensen af AILP lignede lektiner tilhører familien lektin-arcelin-α-amylase hæmmer rapporteret til fælles bean14,15. Renset AILP udviser ikke nogen hæmmende aktivitet mod pattedyr trypsin og yderligere in vitro-karakterisering viste betydelige hæmning af A. flavus vækst og conidial spiring13. Betænkninger her klart viser α-amylase kan tjene som et mål i kontrol tilgange til at begrænse patogener eller skadedyr, der afhænger af stivelse mobilisering (gennem α-amylase aktivitet) og erhvervelse af opløselige sukkerarter som energikilde under deres patogen interaktion med værtsplanter.
Alpha-amylase er kendt for at være kritiske i A. flavus patogenicitet9,10,11, og i betragtning af betydningen af AILP som en potent anti-A. flavus agent (α-amylase hæmning/antigrowth)13, Vi genereret transgene majs planter at udtrykke hjelmbønne AILP gen den konstituerende CaMV 35S promotor. Målet var at undersøge hvis heterolog ekspression af denne α-amylase hæmmer i majs er effektiv mod A. flavus patogenese og aflatoksin produktion under majs kerne infektion. Vores resultater viser, at transgene majs kerner udtrykker AILP betydeligt reduceret A. flavus vækst og aflatoksin produktion under kerne infektion.
Udbyttetab i landbrugsafgrøder som følge af patogener og skadedyr er et globalt problem20. I øjeblikket, anvendelse af syntetiske fungicider og pesticider er den fremherskende metode for kontrollerende plante patogener og skadedyr, men resterende toksicitet af disse biokemikalier i fødevarer og foder kan medføre alvorlig trussel for menneskers og dyrs sundhed21. I betragtning af den økonomiske betydning af majs som fødevarer og foder afgrøder, reduktion eller elimin…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker David Meints, University of Arkansas for hans hjælp med at udvikle og analysere den transgene majs under de tidlige generationer. Dette arbejde modtaget økonomisk støtte fra USDA-ARS CRIS-projektet 6054-42000-025-00D. Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne artikel er udelukkende til brug for specifikke oplysninger og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse af den US Department of Agriculture. USDA-ARS’ lig beskæftigelse lejlighed (EEO) politiske mandater lige muligheder for alle personer og forbyder diskrimination i alle aspekter af agenturets personalepolitik, praksis og operationer.
Agar | Caisson | ||
Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
Ethanol | |||
FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
Force Air Oven | VWR | ||
FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
liquid Nitrogen | |||
Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
Methanol | |||
Methylene Chloride | |||
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
Potato Dextrose Broth | |||
Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
Stir Plate | |||
Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
V8 juice | Campbell's | ||
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |