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Inibizione di crescita di Aspergillus flavus e produzione di aflatossina nel mais transgenici che esprimono la α-amilasi inibitore da Dolichos lablab L.

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

Qui presentiamo un protocollo per analizzare Aspergillus flavus crescita e produzione di aflatossina in chicchi di mais che esprime una proteina di antimicotica.  Usando un ceppo che esprimono GFP a. flavus abbiamo controllato l'infezione e la diffusione del fungo nei kernel maturo in tempo reale. Il test è rapido, affidabile e riproducibile.

Abstract

Contaminazione da aflatossina nelle colture di alimenti e mangimi è una sfida importante in tutto il mondo. Le aflatossine, prodotte dal fungo Aspergillus flavus (a. flavus) sono agenti cancerogeni potenti che sostanzialmente riducono il valore di ritaglio in mais e altre colture ricche di olio come arachidi oltre che propongono una minaccia seria per la salute umana e animale. Diversi approcci, tra cui allevamento tradizionale, espressione transgenica di resistenza associata proteine e RNA interference (RNAi)-base di silenziamento genico indotto da host di critica a. flavus geni bersaglio, vengono valutate per aumentare resistenza di aflatossina nelle colture sensibili. Studi precedenti hanno mostrato un ruolo importante di α-amilasi in produzione patogenesi e aflatossina a. flavus , suggerendo questo gene/enzima è un potenziale bersaglio per ridurre sia la crescita di a. flavus che la produzione di aflatossina. A questo proposito, lo studio corrente è stato intrapreso per valutare l'espressione eterologa (sotto il controllo del promotore 35S CaMV costitutivo) di una proteina del tipo di inibitore della α-amilasi Dolichos lablab L. (AILP) nel mais contro a. flavus. AILP è una proteina di 36-kDa, che è un inibitore competitivo dell'enzima α-amilasi a. flavus e appartiene alla famiglia delle proteine lectine – arcelin – α-amilasi inibitore in comune con fagioli. Studi in vitro prima di iniziare il lavoro corrente avevano dimostrato il ruolo di AILP nella inibizione dell'attività α-amilasi a. flavus e crescita fungina. Crescita fungina e produzione di aflatossina in granella maturo sono stati monitorati in tempo reale utilizzando un ceppo che esprimono GFP a. flavus . Questo kernel lo screening test (KSA) è molto semplice da configurare e fornisce dati affidabili e riproducibili su infezione e il grado di diffusione che poteva essere quantificati per la valutazione di germoplasma e linee transgeniche. La fluorescenza dal ceppo GFP è strettamente correlata alla fungine crescita e, per estensione, è ben correlata ai valori di aflatossina.  L'obiettivo del lavoro attuale era di implementare questa conoscenza precedente in una coltura commercialmente importante come il mais per aumentare la resistenza di aflatossina. I nostri risultati mostrano una riduzione del 35%-72% in crescita di a. flavus nei kernel mais transgenici esprimenti AILP che, a sua volta, si traduce in una riduzione del 62%-88% nei livelli di aflatossina.

Introduction

Contaminazione da micotossine di generi fungini, Aspergillus, Fusarium, Penicilliume Alternaria è un grave problema di cibo e mangimi coltivati in tutto il mondo1,2,3. Tra questi funghi fitopatogeni, Aspergillus ha il più alto impatto negativo sul valore delle colture e salute umana e animale. Aspergillus flavus (A. flavus) è un agente patogeno opportunistico pianta che infetta ricca oleaginose quali mais, semi di cotone e arachidi e produce i potenti cancerogeni, aflatossine, così come numerosi metaboliti secondari tossici (SMs). Mais è un alimento importante e nutrire le colture di tutto il mondo ed è altamente sensibili alla contaminazione da a. flavus. L'impatto economico della contaminazione da aflatossine su perde e valore ridotto in mais può essere tanto quanto $ 686,6 milioni/anno in US2 con i previsti cambiamenti nel clima globale, l'impatto delle aflatossine potrebbe comportare perdite economiche maggiore nel mais con stime su quanto $ 1,68 miliardi/anno nel vicino futuro2. Dato gli effetti economici e sanitari delle aflatossine negli esseri umani e bestiame, controllo di pre-raccolta aflatossine nel mais potrebbe essere il modo più efficace per prevenire la contaminazione da aflatossine negli alimenti e mangimi.

L'approccio di controllo principale di pre-raccolta per resistenza di aflatossine nel mais che è stato ampiamente utilizzato in questi ultimi decenni è principalmente attraverso l'allevamento, che richiede una notevole quantità di tempo4. Recentemente, biocontrol ha avuto certo successo nella riduzione di aflatossina in larga scala campo applicazioni5,6. Oltre biocontrollo, applicazione di strumenti molecolari all'avanguardia come 'Host indotto silenziamento genico' (Villa) attraverso la RNAi e transgenici espressione di proteine associate a resistenza ha avuto un certo successo nella riduzione della crescita di a. flavus e aflatossina produzione in studi di laboratorio e sul campo di piccola scala. Questi approcci sono attualmente in fase di ottimizzazione oltre a individuare nuovi potenziali target di gene a. flavus per modifica futura.

Oltre a geni che sono direttamente coinvolti nella produzione di micotossine come potenziali obiettivi delle strategie di controllo transgenici, amilasi fungine hanno dimostrate di giocare un ruolo critico nel mantenimento della produzione di patogenesi e micotossine successo durante le fasi iniziali di infezione di pianta ospite. Alcuni esempi includono Pythium pleroticum (agente eziologico della putrefazione di zenzero rizoma), Fusarium solani (agente causale della verticillosi cavolfiore), dove le correlazioni positive tra espressione di patogenicità e α-amilasi e attività sono state osservate 7,8. Inibizione dell'attività α-amilasi tramite knockout del gene o approcci atterramento influenza negativamente la produzione della tossina e di crescita fungina. Un mutante di knockout di α-amilasi di a. flavus è stato in grado di produrre aflatossine quando coltivate su amido substrato o degermed chicchi di mais9. Allo stesso modo, in Fusarium verticillioides un ceppo di knockout di α-amilasi non è riuscito a produrre fumonisina B1 (micotossine) durante l'infezione di chicchi di mais10. In uno studio più recente, Gilbert et al (2018) hanno dimostrato che una basata su RNAi abbattere di espressione di α-amilasi a. flavus attraverso Villa ridotto significativamente a. flavus crescita e aflatossina produzione durante l'infezione del kernel mais11 .

Inibitori specifici dell'attività α-amilasi hanno anche prodotto risultati simili come ottenuti da giù-regolamento dell'espressione di α-amilasi. Il primo rapporto sul ruolo di un inibitore di α-amilasi fungina resistenza è venuto dall'isolamento e la caratterizzazione di un inibitore della tripsina-α-amilasi 14-kDa da linee di mais resistente a. flavus12. Ulteriori controlli di diverse centinaia di specie di piante da fattori e Woloshuk ha portato all'identificazione di una proteina di kDa 36 α-amilasi inibitore-come (AILP) dai semi di fagioli di Giacinto, Dolichos lablab L.13. La sequenza del peptide di lectine AILP somigliava appartenente alla famiglia delle lectine – arcelin – α-amilasi inibitore segnalato in comune fagiolo14,15. AILP purificato non presenta alcuna attività inibitoria nei mammiferi tripsina e ulteriore caratterizzazione in vitro ha mostrato l'inibizione significativa di crescita a. flavus e germinazione conidial13. Le relazioni presentate qui chiaramente spettacoli α-amilasi possono servire come una destinazione negli approcci di controllo per limitare gli agenti patogeni o parassiti che dipendono dalla mobilitazione di amido (attraverso attività di α-amilasi) e acquisizione di zuccheri solubili come fonte di energia durante il loro patogeno interazione con piante ospiti.

Alfa-amilasi sono conosciuto per essere critici a. flavus patogenicità9,10,11e data l'importanza dell'AILP come un potente anti-a. flavus agente (α-amilasi inibizione/antigrowth)13, Abbiamo generato piante di mais transgeniche esprimenti Lablab AILP gene sotto il promotore CaMV 35S costitutivo. L'obiettivo era di studiare se l'espressione eterologa di questa α-amilasi inibitore nel mais è efficace contro a. flavus patogenesi e aflatossina produzione durante l'infezione del kernel mais. I nostri risultati dimostrano che chicchi di mais transgenici che esprimono AILP significativamente ridotto a. flavus crescita e aflatossina produzione durante l'infezione del kernel.

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Protocol

1. plasmide costrutti e trasformazione mais

  1. PCR amplificano Lablab AILP inserire utilizzando i primer 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'e 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. Le condizioni PCR includono una denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 s (passaggio 1), seguita da denaturazione a 98 ° C per 10 s (passaggio 2), ricottura a 55 ° C per 30 s (passaggio 3), l'allungamento a 72 ° C per 20 s (passaggio 4), 31 cicli di passaggio 2 al passaggio 4 , e un allungamento finale passo a 72 ° C per 5 min, Clone del prodotto di PCR in un pCAMBIA modificato 1.300 vector utilizzando Xbaio e Pstsono siti di restrizione. Sequenza il vettore di destinazione finale pianta per confermare l'orientamento e la sequenza del gene di AILP clonato nel vettore.
  2. Trasformare Agrobacterium ceppo EHA101 con il costrutto di vettore finale (Figura 1) come in precedenza descritto 16.
  3. Utilizzare trasformati Agrobacterium contenente il vettore di destinazione finale pianta per trasformare gli embrioni immaturi mais (Zea mays L. Hi-II) (eseguiti presso l'impianto trasformazione impianto di Iowa State University) 16.
  4. Crescere T0 piante in serra (26 – 29 ° C; fotoperiodo 16/8 h completati con Na-lampade ad alta pressione) e ripetutamente subcoscienza per ottenere T6 generazione per raggiungere l'omozigosi per il tratto transgenico.

2. test di germinazione di spore

  1. Raccogliere campioni di foglia e conservare a-80 ° C. Macinare i campioni di foglia con un mortaio e pestello usando azoto liquido. Pesare 0,5 g in provette microcentrifuga da 2 mL, aggiungere 17 µ l di inibitore della proteasi e inserire le provette sul ghiaccio.
  2. Centrifugare le provette per 10 min a 16.000 x g. Trasferire 225 µ l di Estratto della pianta per microcentrifuga 0,5 mL e metterli su ghiaccio.
  3. In una provetta da centrifuga da 15 mL, preparare una sospensione di spore di 5ml di Aspergillus flavus 70 – GFP in brodo di 1% patata destrosio (w/v). Vortice e regolare la concentrazione di spore a 105 spore/mL con un emocitometro.
    Attenzione: A. flavus produce aflatossine, tutto il lavoro con questo fungo deve essere condotto in una cappa di sicurezza biologica.
  4. Incubare in PDB a 28 ° C fino a quando la cultura raggiunge il 50% l'inizio della germinazione delle spore come indicato dal rigonfiamento delle spore.
  5. Estratto di vortice e aliquota 25 µ l soluzione di spora alla pianta 225 µ l. Incubare i campioni per 20 ore a 28 ° C con agitazione intermittente.
  6. Aliquotare 25 µ l di soluzione di spore su un vetrino da microscopio e misura la lunghezza del germe tubi spore utilizzando il software della fotocamera digitale. Utilizzare un minimo di 20 misurazioni duplicate per ogni riga.
    Nota: In questa fase, inserire tutte le culture a 4 ° C per fermare la crescita di Colonia fino al momento di contare.

3. kernel Screening Test (KSA)

  1. Costruire tappi KSA incollando 4 Salvapercussori (22 mm) in una capsula Petri 60 x 15 mm. Consentire la colla si asciughi per 48 H prima di usare tappi. Ogni cap KSA costituisce una Rep (Figura 2).
  2. In una sterile cappa di sicurezza biologica, spruzzare un vassoio quadrato analisi biologica (24 x 24 cm) con 70% etanolo: H2O (v/v) e lasciare asciugare aria. Aggiungere carta cromatografia sterile al vassoio. 9 KSA protezioni dello spruzzo con etanolo al 70%, lasciare aria a secco e posizionare nel vassoio di analisi biologica.
  3. Per ogni linea di mais transgenico in fase di test, selezionare 20 noccioli intatti e posto in una provetta da centrifuga 50 mL. Aggiungere etanolo al 70% e lasciate riposare per 4 minuti. Agitare delicatamente i tubi durante la sterilizzazione. Versare il kernel di etanolo e sciacquare tre volte in sterile deionizzata H2O.
  4. Preparare una sospensione di spore di Aspergillus flavus 70 – GFP17 da una 6 giorno vecchia cultura cresciuta sul mezzo V8 (5% succo V8, agar 2%, pH 5.2).
    1. Aggiungere 20 mL sterile 0,02% Triton X-100/deionizzata H2O (v/v) e rottami fuori le spore con un'ansa sterile. Dispensare l'inoculo e posto in un becher da mL 300 sterile.
    2. Preparare una diluizione 5 volte con 0,02% Triton X-100, quindi eseguire un conteggio di spora con un emocitometro. Se necessario, per ottenere 100 mL con una concentrazione di 4 x 106 spore/mL, diluire nuovamente.
  5. Posto noccioli in un becher da mL 300 sterile con un'ancoretta. Aggiungere inoculo Becher.
    Attenzione: L'aggiunta di gherigli di inoculo causerà soluzione a spruzzo. Porre il becher su un piatto di mescolare per 3 minuti. Dopo 3 minuti, versate dell'inoculo in un bicchiere vuoto.
  6. Mezzo di un forcipe, posto kernel nel piatto analisi biologica (1 coperchio). Aggiungere 30 mL di acqua deionizzata al fondo di ogni vassoio di analisi biologica e incubare a 31 ° C al buio per 7 giorni.
  7. Preparare noccioli per la fotografia.
    1. Mettere da parte 4 kernel da ogni riga per analisi microscopica e la fotografia.
      Nota: Kernel possono essere memorizzati a 4 ° C per non più di 5 giorni prima di completare la fotografia.
    2. Prendere le immagini del kernel dopo sette giorni di inoculazione con a. flavus (Figura 3).
    3. Pulito esterno del kernel con un tessuto morbido e acqua deionizzata. Eseguire sezioni longitudinali dei noccioli e immediatamente scattare fotografie al microscopio fluorescente.
  8. Preparare kernel per l'analisi.
    1. Pulito esterno dei rimanenti kernel con un tessuto morbido e acqua deionizzata.
    2. Posto 4 kernel, che costituiscono 1 rappresentante, in un policarbonato di tappo a vite di 15 mL fiala contenente 2 sfere in acciaio inossidabile. Congelare immediatamente fiale in azoto liquido e conservare a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione e analisi.
    3. Rimuovere le fiale dal congelatore a-80 ° C e macinare chicchi in un omogeneizzatore a 1.500 giri/min per 3 minuti.
      Nota: Tenere i kernel congelato con azoto liquido.

4. proiezione PCR di chicchi di mais transgenici

  1. Utilizzare kit di isolamento del DNA per isolare il DNA genomico (gDNA) da chicchi di mais polverizzati infettati da a. flavus secondo le istruzioni del produttore. Brevemente, aggiungere 280 µ l di tampone F, 20 µ l proteasi e 3 µ l ditiotreitolo (DTT) a 10-15 mg di chicchi di mais polverizzati. Incubare e agitare in un thermomixer (56 ° C, 1.200 giri/min, 30 min). Centrifugare a 10.000 x g per 1 min e trasferire il sovranatante chiaro colonna equilibrato. Incubare a temperatura ambiente per 3 min e centrifugare a 700 x g per 1 min eluire gDNA.
  2. Prendere 0,8 µ l di Estratto gDNA impostare una reazione di PCR 20 µ l di ciascun campione utilizzando un kit PCR. Seguire le condizioni thermocycling come consigliato nel protocollo del produttore. Le condizioni PCR includono una denaturazione iniziale a 98 ° C per 5 min (passaggio 1) seguita dalla denaturazione a 98 ° C per 5 s (passaggio 2), ricottura a 55 ° C per 5 s (passaggio 3), l'allungamento a 72 ° C per 20 s (passaggio 4), 40 cicli di passaggio 2 al passaggio 4 e un passo di allungamento finale a 72 ° C per 1 min (passo 5).
  3. Utilizzare forward primer 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' e reverse primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' per confermare la presenza di Lablab AILP gene in chicchi di mais transgenici.

5. isolamento del RNA, sintesi del cDNA e RT-PCR semi-quantitativa

  1. Prendere omogeneizzato a. flavus infettati chicchi di mais precedentemente conservati a-80 ° C per l'estrazione di RNA. Estrarre RNA usando un kit di isolamento del RNA totale secondo il protocollo del produttore ma con leggera modifica18. Dopo l'aggiunta di 50 mg di polvere di kernel mais omogeneizzato nel buffer dell'estrazione, mescolare bene (senza Vortex) utilizzando una punta di pipetta da 1 mL e lasciarlo sul ghiaccio per 5-6 minuti prima di procedere ai passaggi successivi come descritto nel protocollo del produttore.
  2. Preparare cDNA usando un kit di sintesi di cDNA secondo protocollo 18 del produttore.
  3. Utilizzare 0,5 µ l di cDNA non diluito per reazione di PCR per RT-PCR semi-quantitativa come precedentemente descritto18. Utilizzare il primer forward e reverse qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' e qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' rispettivamente per rilevare Lablab AILP espressione genica e avanti e indietro primer qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ e qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ rispettivamente per l'espressione del mais ribosomiale strutturale gene (Rib), GRMZM2G02483819 come un gene di mantenimento della casa.

6. quantificazione di GFP

  1. Preparare 50 mL ciascuno di 0,2 M sodio fosfato monobasico (NaH2PO4) e 0,2 M di fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4·7H2O) in deionizzata H2O.
  2. Compongono il 100 mL di tampone fosfato pH 7,0 Sorenson. Per pH 7.0, aggiungere 19,5 mL brodo di NaH2PO4 , 30,5 mL di NaHPO4·7H2O brodo e 50ml deionizzata H2O.
  3. Pesare il materiale di 25 mg al suolo del kernel (peso fresco, FW) e posto in un tubo del microcentrifuge 1,0 mL. Aggiungere 500 µ l di tampone fosfato alla provetta da centrifuga e vortexare per 30 s.
  4. Centrifugare i campioni a 16.000 x gper 15 minuti. Surnatante µ l di dispensare 100 in una piastra ben nero 96. Leggere i campioni con un fluorimetro (eccitazione 485 nm, emissione 528 nm).

7. analisi di aflatossina totale

  1. Estrazione di elaborazione e aflatossina Sample
    1. Asciugare i campioni del kernel in un forno ad aria forzata per 2 giorni a 60 ° C. Pesare i campioni e posto in una beuta con un tappo di vetro di 50 mL.
    2. In una cappa, aggiungere 25 mL di cloruro di metilene in ciascuno dei palloni.
      Attenzione: Il cloruro di metilene è altamente volatile ed è considerato pericoloso (irritante, cancerogeno). Guanti lattice né nitrile sono sicuri per l'utilizzo di cloruro di metilene. Utilizzare guanti di polivinilalcol resistente ai solventi organici migliorata.
    3. Agitare i campioni per 30 minuti su un agitatore di azione del polso. Dopo 30 min, versare lentamente l'estratto attraverso un cerchio di carta da filtro scanalate in un becher da 80 mL. Lasciate che il pernottamento asciutto di bicchieri in una cappa aspirante.
    4. Il giorno successivo, squirt cloruro di metilene (circa 5 mL) intorno alla parte interna dell'orlo dei bicchieri asciutti, turbinano attorno e versare in fiale di vetro 2 dram. Fiale di lasciare aprire ad per asciugare durante la notte in una cappa aspirante.
  2. Analisi di aflatossina
    1. Aggiungere 4,0 mL 80% di metanolo: deionizzata H2O (v/v) di fiale.
    2. Utilizzare un kit di estrazione di aflatossina per filtrare purificare soluzione di metanolo con la colonna specificata. Analizzare i livelli di aflatossina totale con un fluorimetro, secondo le istruzioni del produttore.

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Representative Results

Trasformazione di mais e lo screening molecolare delle piante transgeniche

Embrioni immaturi di linee di mais Hi-II sono stati trasformati mediante Agrobacterium tumefaciens EHA101 ceppo contenente il vettore di destinazione finale pianta che esprimono il gene AILP Dolichos lablab sotto il controllo di CaMV 35S promotore. Cinque linee di mais in modo indipendente trasformate sono state avanzate per la generazione di T6 per studi successivi. Le piante di mais transgeniche erano molto più piccoli e meno vigorosi, ma non hanno mostrato anomalie rispetto alle piante isogeniche controllo negativo. L'amplificazione di PCR del gene target AILP ha mostrato un amplicone bp 548, osservata solo in linee di mais transgeniche rispetto le piante di controllo (Figura 4A). Il gene AILP ha mostrato l'espressione in linee transgeniche mentre nessuna espressione di AILP è stata osservata negli impianti di controllo (Figura 4B).

Aspergillus flavus analisi di spore con foglia estratti

Greggio foglia estratti da mais transgenico giovani piante erano preparati macinando in liquido N e centrifugazione a 16.000 x g. Le spore di germinare fase precoce sono stati esposti all'Estratto di foglia per 20 ore e la lunghezza ifale spora media è stata registrata da 20 campioni. Lunghezza ifale dalle spore esposte agli estratti di foglia transgenici ha mostrati una riduzione del 58% – 80% rispetto al controllo negativo (Figura 5)

Aspergillus flavus crescita durante l'infezione del kernel

Per esaminare la crescita di a. flavus nei kernel transgenici e controllo è stato effettuato un test di Screening del Kernel (KSA). Espressione del gene di AILP nei kernel transgenici influenzato negativamente la crescita di a. flavus . Il ceppo di a. flavus utilizzato nello studio corrente contiene un reporter GFP che consentono il monitoraggio e la quantificazione della crescita fungina in tempo reale. Riduzione significativa in fluorescenza GFP è stato osservato nei kernel AILP transgenici rispetto al controllo negativo isogeniche (Figura 6). AILP linee 4 e 5 hanno mostrato una riduzione significativa nella crescita fungina, 69% e 72%, rispettivamente, seguita da altre linee dove è stata osservata una riduzione del 35% – 60% in confronto al kernel di controllo (figura 7A).

Produzione di aflatossina nei kernel infetti

L'espressione eterologa del gene di AILP nel mais è provocato da una riduzione significativa del tenore di aflatossine nelle linee transgeniche vs controllo. I dati di aflatossina forniti qui è il contenuto di aflatossine totali rilevato nei kernel infetti. Una riduzione del 62%-88% nel contenuto di aflatossina è stata osservata nei kernel AILP rispetto al controllo (figura 7B). Fra le 5 diverse linee AILP, linea 4 hanno mostrato il più basso tenore di aflatossine (DW 486 ng/g), seguito da altre linee che spaziano tra 640-1.498 ng/g DW nei kernel vs controllo (3.986 ng/g DW).

Figure 1
Figura 1: Disegno vettoriale per transgenici espressione del gene di Lablab AILP in mais. 35s = virus del mosaico del cavolfiore o promotore costitutivo CaMV; RB = bordo destro; LB = bordo sinistro; nptII = gene di resistenza di neomicina fosfotransferasi-kanamicina; nos e 35s = terminatori di trascrizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Kernel Screening Test. (A, B) Sterilizzare il kernel e versare in un recipiente sterile in una cappa di sicurezza biologica. (C-E) Inoculare il kernel con sospensione di spore di a. flavus . (F – H) Utilizzando una pinza sterile, posizionare il kernel in piatto di analisi biologica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Luce micrografie della crescita di a. flavus . Controllo negativo Isogenic (A). (B-F) Kernel transgenici che esprimono AILP (linee 1-5) una settimana dopo l'inoculazione. Barra della scala = 1 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Screening molecolare delle piante transgeniche. (A), PCR conferma di piante di mais transgeniche (corsie 1-5) contenente Lablab AILP (frammento diagnostico del bp 548 del DNA; C = controllo negativo isogeniche; NEB 2-Log scaletta del DNA utilizzato come marcatore del DNA). (B) espressione del gene di Lablab AILP in linee di mais transgeniche (corsie 1-5) usando RT-PCR. Corsia C rappresenta isogeniche controllo negativo. Mais ribosomiale strutturale gene (Rib), GRMZM2G02483819 è stato usato come un gene house-keeping (NEB 2-Log DNA ladder: marcatore del DNA). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5. Effetto di greggio foglia estratti da piante transgeniche AILP mais il a. flavus germinazione delle spore rispetto a un controllo negativo isogeniche (neg). Separazione media è stato fatto dopo il test di Dunnett dopo ANOVA. Livelli di riduzione significativa sono contrassegnati da un asterisco (* * *P ≤ 0,0001). Barre di errore indicano l'errore standard di mezzi per venti campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Nella figura 6. Fluorescenza GFP che emana da a. flavus ceppo 70-GFP in granella transgenici che esprimono AILP dopo una settimana di analisi biologica. Isogeni controlli negativi (A) sono stati usati per valutare l'infezione fungina e diffondere nei kernel transgenici (B-F che rappresentano linee transgeniche 1-5). Almeno quattro noccioli sono stati schermati per ogni riga sotto il microscopio a fluorescenza. Barra della scala = 2 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Produzione di crescita e di aflatossina un flavus . (A) a. flavus 70-GFP infezione e la crescita in chicchi di mais dopo 7 giorni in un test di Screening di Kernel. Media di tre esperimenti indipendenti con quattro biologico replica ogni volta. Quantificazione di GFP (in unità Relative di fluorescenza, RFU) indica crescita fungina in linee di mais transgeniche esprimendo AILP a un controllo negativo isogeniche. Separazione media è stato fatto dopo il test di Dunnett dopo ANOVA. Livelli di riduzione significativa è denotato da asterischi (*P ≤ 0.05; * *P ≤ 0,01; * * *P ≤ 0,001). Barre di errore indicano l'errore standard dei mezzi per quattro repliche biologiche randomizzati. (B) produzione di aflatossina da a. flavus 70-GFP in chicchi di mais dopo 7 giorni in un test di Screening di Kernel. Media di 12 repliche biologiche e ogni replica conteneva quattro noccioli. Livelli di aflatossina nei kernel AILP transgenici (linee 1-5) rispetto a un controllo negativo isogeniche (neg). Separazione media è stato fatto dopo il test di Dunnett dopo ANOVA. Livelli di riduzione significativa è denotato da asterischi (* *P ≤ 0,01; * * *P ≤ 0,001). Barre di errore indicano l'errore standard dei mezzi per quattro repliche biologiche randomizzati. Vedere figure supplementari per visualizzare i dati nel pannello B privo di polarizzazione dovuto inibizione fungina. Chiudere la correlazione tra GFP = RFU e aflatossina valori vengono anche forniti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sup Figure 1
Supplemental figura 1: Dati da figura 7B ridisegnato per mostrare la produzione di aflatossina da a. flavus 70-GFP in chicchi di mais dopo 7 giorni in un test di Screening di Kernel per eliminare la discriminazione dovuta all'inibizione di crescita fungina. Valori di aflatossina sono stati divisi tramite l'inibizione di crescita fungina rappresentato come valori di GFP-RFU in figura 7B. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sup Figure 2
Supplementare nella figura 2: chiudere la correlazione tra valori di GFP-RFU (= crescita fungina) e livelli di aflatossina (r2 = 0,86) segnalato in KSA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Perdite di rendimento dovute a colture agricole a causa di agenti patogeni e parassiti è un problema globale20. Attualmente, applicazione dei fungicidi sintetici e pesticidi è il mezzo predominante per controllo impianto patogeni e parassiti, ma tossicità residua di queste sostanze biochimiche in alimenti e mangimi possono costituire grave minaccia per la salute umana e animale21. Considerando l'importanza economica del mais come alimento e mangime raccolto, riduzione o eliminazione della contaminazione da aflatossine è di massima importanza2,3,22. L'allevamento convenzionale attraverso introgressione gene resistente nelle varietà sensibili è un processo che richiede tempo e tale resistenza non è sempre stabile come resistenza di aflatossina è un tratto poligenico ed espressione di geni partecipanti variano significativamente con i cambiamenti nei parametri ambientali4. Approcci alternativi vengono valutati per aumentare e stabilizzare la difesa della pianta ospite contro a. flavus in maniera ecofriendly.

Nello studio corrente, abbiamo scelto di valutare l'efficacia del gene di AILP da Giacinto fagioli in mais contro a. flavus. Come AILP è un inibitore competitivo della α-amilasi e possiede anche proprietà antifungine, abbiamo espresso questo gene sotto un forte promotore costitutivo CaMV 35S. L'obiettivo era di aumentare la produzione di questa proteina eterologa in mais indipendentemente dalla fase inerente allo sviluppo o tipo di tessuto. Significativa espressione del gene di α-amilasi nelle linee di mais transgeniche (Figura 4AB) supporta stabile espressione di questo gene in un sistema eterologo. Questo influenzato negativamente la crescita fungina come evidente dalla riduzione nella distribuzione spaziale della fluorescenza di GFP dentro il kernel AILP infetti e riduzione complessiva fluorescenza GFP nei kernel (Figura 6 e figura 7A).

Lo sviluppo di test di Screening del Kernel (KSA) utilizza un geneticamente a. flavus ceppo di reporter che esprimono un gene che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) dalla Medusa Aequorea victoria18, 23. per elaborare strategie di controllo per qualsiasi agente patogeno, è necessario comprendere la modalità di infezione, diffusione e colonizzazione all'interno della pianta ospite o tessuto. La colonizzazione e la diffusione del saprofita di aflatoxigenic, a. flavus non è ben capito perché regolazione genetica della resistenza al patogeno, se ne esiste uno, non è ben compreso. Uso del ceppo che esprimono GFP a. flavus permette di tenere traccia in tempo reale il processo di infezione e colonizzazione. Il ceppo GFP e il selvaggio-tipo non hanno differito significativamente all'agente patogeno aggressività e aflatossina produzione23. Tuttavia, il gene GFP in questo particolare ceppo è posto sotto il controllo del fosfato deidrogenasi (gpdA) gliceraldeide costitutivamente espressa gene promotore 24 che è più adatto per il monitoraggio crescita fungina. Tuttavia, usando questa macchia su semi di cotone e chicchi di mais, abbiamo dimostrato una stretta relazione tra fluorescenza GFP che emana dal fungo alla crescita fungina e aflatossina livelli18,23.

Per stabilire una stretta correlazione con capacità di produzione di aflatossina, gfp guidato da promotori di geni di aflatossina come omtA o ver-125,26 sarà più adatto di gpdA. La fluorescenza di GFP è sufficientemente sensibile per consentire per la rilevazione e misura in tempo reale di anche piccoli cambiamenti nella crescita fungina, sia in vitro e in plantae valutazione di attività inibitorie di proteine antifungine sconosciuti e peptidi come AILP e altri11,17,18,23. Inoltre, risultati da KSA correla bene con prestazioni sul campo di linee di mais resistenti o sensibili per quanto riguarda la valutazione per l'aflatossina contaminazione27.

Il KSA è molto utile nel nostro laboratorio a schermo classicamente razza nuova varietà4 e linee transgeniche11,18. È facile da impostare ed eseguire KSA in qualsiasi laboratorio. Bisogna utilizzare kernel pulito intatto per eseguire questo test, in modo che una chiara comprensione dell'interazione pianta-fungo ospite poteva essere valutata. Controlliamo regolarmente tutti i kernel che usiamo nel nostro laboratorio sotto un microscopio stereoscopico prima di condurre l'analisi. Si deve osservare che le condizioni che impieghiamo per il KSA includono alta umidità (95% RH) e temperatura costante (31 ° C). Con l'inizio del processo di germinazione simulato in queste condizioni, il dosaggio fornisce le condizioni ideali per testare l'integrità del tegumento, il trucco genetico dei kernel tra cui geni/proteine antifungine accesi durante la germinazione, e/o fungine infezione. Produzione di infezione e aflatossina fungina sarà sempre superiore in KSA rispetto alla loro insorgenza nel campo; Tuttavia, una stretta correlazione è stato stabilito4,27.

Abbiamo dimostrato in questo KSA AILP riduce la crescita fungina in chicchi di mais. AILP possiede proprietà antifungine di lectine di pianta e ha dimostrato di inibire il α-amilasi, diminuendo la ripartizione dell'amido e limitare la crescita fungina. In vitro gli studi hanno dimostrato che AILP era in grado di inibire a. flavus crescita nel mezzo di crescita artificiale ricco di zucchero patata destrosio brodo (PDB), che indica la sua attività di inibizione della crescita/antimicotico era indipendente della sua inibizione dell'amilasi attività13. Altre lectine impianto isolato dal Urtica dioica (ortica), Hevea brasiliensis (albero della gomma) e tuberi di Solanum tuberosum (patata) mostrano anche simili proprietà antifungine ed ha inibito la crescita di Botrytis cinerea , Pyrenophora triticie Fusarium oxysporum28,29,30,31. Gli inibitori dell'alfa amilasi non solo sono efficaci contro funghi e batteri, ma inoltre sono stati indicati per essere efficaci contro i parassiti di insetto32. Alfa amilasi sono segnalate per essere critico per la normale crescita e sviluppo degli insetti pianta-alimentazione e diversi inibitori della α-amilasi dell'insetto sono stati isolati dalle piante quali grano, fagiolo comune e mais12,33, 34,35. Una significativa riduzione in lunghezza fungina ifale dalle spore esposte agli estratti di foglia grezzo (Figura 5), riduzione della crescita fungina nel mais AILP-esprimendo kernel come dimostrato dalla riduzione della fluorescenza di GFP sia qualitativamente ( Figura 6) e quantitativamente (figura 7A) è probabilmente dovuto a una combinazione delle sue proprietà di inibizione e antimicotico di α-amilasi. Gli esperimenti usando questi mais AILP-esprimendo piante contro altri agenti patogeni e parassiti in futuro sarà di grande interesse per testare la sua efficacia contro diversi fattori di stress biotici di seme e tessuti vegetativi. Le proprietà di inibizione antimicotico e crescita di lectina è stata attribuita principalmente alla sua cross-linking con chitina e inibizione di punta ifale espansione28. Infatti, inibizione in vitro di AILP-mediata di α-amilasi da diverse origini fungine e batteriche hanno mostrato oltre 65% inibizione a patogeni fungini, tra cui a. flavus, Magnaporthe grisea, Helminthosporium victoriaee 41 % di inibizione del patogeno batterico Bacillus subtilis13. I risultati sulla riduzione della crescita di a. flavus qui presentato sono in linea con il ruolo di α-amilasi inibitori come agenti antifungini. Lo studio corrente ulteriore dimostra l'applicazione pratica di tali informazioni utili ottenuti da precedenti studi in vitro.

Riduzione del tenore di aflatossine (figura 7B) in AILP-esprimere linee di mais è possibilmente dovuto inibizione di attività di α-amilasi a. flavus , conducendo diminuita degradazione dell'amido memorizzato e ridotto acquisizione degli zuccheri come un fonte di energia da chicchi di mais durante l'interazione patogeno. Come α-amilasi fungina svolge un ruolo importante nell'abbattere gli amidi del kernel, qualsiasi cambiamento nell'attività α-amilasi fungina di AILP probabile modifica il contenuto di zucchero solubile durante l'infezione del kernel. Contenuto di zuccheri solubili, soprattutto saccarosio e glucosio, è stata altamente correlata con aumento della produzione di aflatossine1 e totale di AFB in mais e altre colture sensibili a. flavus come arachidi36,37. Aumentando il contenuto di saccarosio nei media di crescita artificiale aumenta a. flavus aflatossina produzione38. Altri zuccheri solubili quali glucosio e maltosio contribuiscono positivamente anche alla produzione di aflatossina sia nei mezzi artificiali e seme substrati38. Inibizione dell'attività α-amilasi e riduzione della produzione di micotossine in altri funghi rafforza il ruolo importante di α-amilasi fungine in produzione di tossine durante l'infezione del kernel. Mutanti knockout di alfa-amilasi di F. verticillioides e di a. flavus non è riuscito a produrre la fumonisina B1 e aflatossine rispettivamente dopo l'infezione di chicchi di mais9,10. Similmente, giù-regolamento di a. flavus α-amilasi ridotto significativamente produzione crescita e aflatossina fungina durante il kernel mais infezione11. Una riduzione del 62% - 88% di aflatossina nelle linee transgeniche sono conformi alle precedenti relazioni sul ruolo della α-amilasi in produzione di aflatossina. Deve essere notato che in vitro Kernel Screening Test (KSA) è più rigide rispetto normalmente trovati in condizioni naturali. Condizioni durante l'analisi in vitro sono anche altamente favorevole per la produzione di aflatossina, quindi la variazione percentuale del tenore di aflatossine nelle linee transgeniche potrebbe essere più significativa piuttosto che i numeri assoluti del tenore di aflatossine nei kernel infetti. I risultati presentati qui sono promettenti e futuri esperimenti in condizioni di campo sono importanti per esaminare il potenziale di questi AILP-esprimere linee di mais per resistenza all'aflatossina in uno scenario naturale.

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Disclosures

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Si ringrazia David Meints, Università di Arkansas per la sua assistenza nello sviluppo e l'analisi il mais transgenico durante le prime generazioni. Questo lavoro ha ricevuto il sostegno finanziario del progetto USDA-ARS CRIS 6054-42000-025-00D. Menzione di marchi o prodotti commerciali in questo articolo è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Ministero dell'agricoltura. Politica di pari opportunità di occupazione (EEO) dei USDA-ARS mandati di pari opportunità per tutte le persone e vieta la discriminazione in tutti gli aspetti delle politiche del personale dell'Agenzia, pratiche e operazioni.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

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Inibizione di crescita di <em>Aspergillus flavus</em> e produzione di aflatossina nel mais transgenici che esprimono la α-amilasi inibitore da <em>Dolichos lablab</em> L.
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