Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتحليل نمو رشاشيه الخنزير وإنتاج الأفلاتوكسين في حبات الذرة معربا عن البروتينات المضادة للفطور. استخدام سلالة الإعراب عن التجارة والنقل (أ) الخنزير نحن رصد العدوى وانتشار الفطريات في حبات ناضجة في الوقت الحقيقي. المقايسة سريعة وموثوق بها، واستنساخه.
Abstract
تلوث الأفلاتوكسين في المحاصيل الغذائية والعلفية يمثل تحديا كبيرا في جميع أنحاء العالم. الأفلاتوكسين، التي تنتجها الفطريات الخنزير رشاشيه (الخنزير (أ)) من المواد المسرطنة القوية التي تقلل إلى حد كبير قيمة محصول الذرة والمحاصيل الغنية النفط الأخرى مثل الفول السوداني إلى جانب مما يشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان والحيوان. نهج مختلفة، بما في ذلك التربية التقليدية، والتعبير المعدلة وراثيا المقاومة المرتبطة البروتينات، والجيش الملكي النيبالي التدخل ([رني])-على أساس إسكات الجينات التي يسببها المضيف الحرج الخنزير (أ) يجري تقييم أهداف الجينات، زيادة المقاومة الأفلاتوكسين في المحاصيل عرضه. وقد أظهرت الدراسات السابقة دوراً هاما من α-الأميليز في إنتاج المرضية والافلاتوكسين الخنزير (أ) ، مما يشير إلى هذا الجين/الإنزيم هدف محتمل للحد من نمو الخنزير (أ) وإنتاج الأفلاتوكسين. وفي هذا الصدد، وأجريت الدراسة الحالية تقييم تعبير مغايرة (تحت سيطرة المروج 35S كامب التأسيسي) بروتين مثبط مثل α-الأميليز purpureus لابلاب L. (أيلب) في الذرة ضد الخنزير (أ). أيلب هو بروتين 36-كاتشين، الذي هو مثبط تنافسي لأنزيم الأميليز α الخنزير (أ) ، وينتمي إلى أسرة بروتين مثبط يكتين – أرسلان – α-الأميليز المشتركة فول. وقد أثبتت الدراسات في المختبر قبل العمل الحالي دور أيلب في تثبيط النشاط α-الأميليز الخنزير (أ) ونمو الفطريات. وتم رصد نمو الفطريات وإنتاج الأفلاتوكسين في حبات ناضجة في الوقت الحقيقي باستخدام سلالة الإعراب عن بروتينات فلورية خضراء الخنزير (أ) . بسيط جداً لإعداد نواة هذا الفحص المقايسة (المملكة العربية السعودية) ويوفر بيانات موثوقة واستنساخه في الإصابة ومدى انتشار التي يمكن قياسها كمياً لتقييم الأصول الوراثية وخطوط محوره وراثيا. الأسفار من إجهاد بروتينات فلورية خضراء النمو ارتباطاً وثيقا للفطريات، واستطراداً، أنها مرتبطة جيدا لقيم الأفلاتوكسين. وكان هدف العمل الحالي لتطبيق هذه المعرفة السابقة في محصول تجارياً هاما مثل الذرة لزيادة مقاومة الأفلاتوكسين. نتائجنا تشير إلى انخفاض 35%-72% في نمو الخنزير (أ) في حبات الذرة المعدلة وراثيا معربا عن أيلب التي، بدورها، ترجمت إلى 62%-88% انخفاضا في مستويات الأفلاتوكسين.
Introduction
تلوث ميكوتوكسين من أجناس الفطريات، رشاشيه، تحززو Penicilliumو م هو مشكلة رئيسية للغذاء وتغذية المحاصيل المزروعة في جميع أنحاء العالم1،،من23. من بين هذه الفطريات فيتوباثوجينيك، قد رشاشيه أعلى الأثر السلبي على قيمة المحاصيل وصحة الإنسان والحيوان. رشاشيه الخنزير (الخنزير (أ)) هو ممرض مصنع انتهازية التي تصيب المحاصيل الزيتية غنية مثل الذرة والزيت والفول السوداني وينتج المواد المسرطنة القوية، الأفلاتوكسين، فضلا عن العديد من الأيض الثانوية السامة (SMs). الذرة غذاء هاما وتغذية المحاصيل التي تزرع في جميع أنحاء العالم وهو عرضه للتلوث الخنزير (أ). تفقد الآثار الاقتصادية للتلوث الأفلاتوكسين في وانخفاض قيمة في الذرة يمكن أن يكون قدر مبلغ 686.6 مليون في السنة في الولايات المتحدة2 مع التغيرات المتوقعة في المناخ العالمي، وتأثير الأفلاتوكسين يمكن أن يسفر عن خسائر اقتصادية أكبر في الذرة مع تقديرات مرتفعة في المستقبل القريب2دولار 1.68 بیلیون عام. ونظرا للآثار الاقتصادية والصحية الضارة من الأفلاتوكسين في البشر والماشية، مراقبة الأفلاتوكسين قبل الحصاد في الذرة قد تكون الطريقة الأكثر فعالية لمنع تلوث الأفلاتوكسين في الأغذية والأعلاف المنتجات.
نهج المراقبة قبل الحصاد الكبرى للمقاومة الأفلاتوكسين في الذرة التي تم استخدامها على نطاق واسع في العقود القليلة الماضية أساسا من خلال تربية، الأمر الذي يتطلب قدرا كبيرا من الوقت4. في الآونة الأخيرة، لذالك قد حققت بعض النجاح في الحد من الأفلاتوكسين في نطاق واسع مجال التطبيقات5،6. وإلى جانب لذالك، تطبيق الأدوات الجزيئية المتطورة مثل '"المضيفة التي يسببها الجينات إسكات"' (هيجس) من خلال [رني] والتعبير المحورة وراثيا من البروتينات المرتبطة بالمقاومة قد حققت بعض النجاح في الحد من نمو الخنزير (أ) والافلاتوكسين الإنتاج في الدراسات المختبرية والميدانية الصغيرة الحجم. ويجري حاليا الأمثل هذه النهج بالإضافة إلى تحديد جديد الخنزير ألف مورثة أهدافا محتملة للتلاعب مستقبلا.
بالإضافة إلى الجينات التي تشارك مباشرة في إنتاج ميكوتوكسين كأهداف محتملة من استراتيجيات مكافحة المحورة وراثيا، أظهرت amylases الفطرية تلعب دوراً حاسما في الحفاظ على النجاح في إنتاج المرضية وميكوتوكسين خلال المراحل المبكرة الإصابة بالنبات المضيف. عدد قليل من الأمثلة على بيثيوم بليروتيكوم (عامل السببية تعفن رهيزومي الزنجبيل)، سولاني الفوزاريوم (وكيل المسببة الذبول قرنبيط)، حيث لوحظ الارتباط الإيجابي بين الإمراضية و α-الأميليز التعبير والنشاط 7،8. تثبيط النشاط α-الأميليز أما عن طريق خروج المغلوب الجينات أو النهج ضربة قاضية يؤثر تأثيراً سلبيا على إنتاج النمو والسمية الفطرية. وكان المسخ خروج المغلوب α-الأميليز من الخنزير (أ) غير قادر على إنتاج الأفلاتوكسين عندما تزرع في النشا الركيزة أو ديجيرميد حبات الذرة9. وبالمثل، في فيرتيسيليويديس مغزلاويه فشل عبئا خروج المغلوب α-الأميليز لإنتاج الفيومونيزين ب1 (ميكوتوكسين) خلال العدوى من حبات الذرة10. في دراسة حديثة، أظهر جيلبير et al. (2018) أن تدق على أساس [رني] أسفل الخنزير ألف- α-الأميليز التعبير من خلال هيجس انخفاضا ملحوظا الخنزير (أ) النمو والافلاتوكسين الإنتاج خلال العدوى نواة الذرة11 .
مثبطات محددة من النشاط α-الأميليز قد أسفرت أيضا عن نتائج مماثلة كما تم الحصول عليها من أسفل-تنظيم التعبير α-الأميليز. وجاء التقرير الأول بشأن دور المانع α-الأميليز في مقاومة الفطريات من عزل وتوصيف مثبط التربسين-α-الأميليز كاتشين 14 من خطوط الذرة مقاومة الخنزير (أ)12. كذلك فحص عدة مئات من الأنواع النباتية فاخوري ووولوشوك أدت إلى تحديد بروتين مثبط مثل α-الأميليز كاتشين 36 (أيلب) من بذور الفول صفير، لابلاب purpureus ل13. وأفادت تسلسل الببتيد ليكتينس أيلب تشبه لعائلة المانع يكتين – أرسلان – α-الأميليز المشتركة فول14،15. أيلب المنقي لا يحمل أي نشاط المثبطة نحو التربسين الثدييات وكذلك توصيف في المختبر أظهرت تثبيط كبيرة الخنزير (أ) النمو والإنبات كونديل13. التقارير المقدمة هنا وضوح يظهر α-الأميليز يمكن أن تخدم كهدف في نهج الرقابة للحد من مسببات الأمراض أو الآفات التي تعتمد على تعبئة النشا (من خلال نشاط α-الأميليز) واقتناء السكريات القابلة للذوبان كمصدر للطاقة خلال هذه الممرضة التفاعل مع النباتات المضيفة.
الأميليز ألفا ومن المعروف أن تكون حاسمة في الخنزير (أ) القدرة الإمراضية9،10،11، ونظرا لأهمية أيلب بوصفها ' مكافحة قوية-الخنزير ألف عامل (α-الأميليز تثبيط/لﻹنصاف)13، نحن تولد النباتات الذرة المعدلة وراثيا التي تعرب عن لابلاب أيلب الجينات تحت المروج كامب 35S التأسيسي. وكان الهدف التحقيق إذا كان تعبير مغايرة لهذا المانع α-الأميليز في الذرة فعالة ضد الخنزير (أ) إنتاج المرضية والافلاتوكسين أثناء الإصابة بنواة الذرة. نتائجنا تثبت أن حبات الذرة المعدلة وراثيا معربا عن أيلب إلى حد كبير انخفاض إنتاج الخنزير (أ) النمو والافلاتوكسين أثناء الإصابة بالنواة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-بلازميد بنيات وتحويل الذرة
- [بكر] تضخيم لابلاب أيلب إدراج استخدام كبسولة تفجير 5 '-تاتكتاجاكتاجتجاتاككاتجكتكك-3' و 5 '-أتاكتجكاجاتجكاتجكاجاجتاجتاكتج-3'. تتضمن الشروط PCR خطوة أولية تمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 30 s (الخطوة 1)، تليها تمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 10 s (الخطوة 2)، الصلب في 55 درجة مئوية لمدة 30 ق (الخطوة 3)، استطالة عند 72 درجة مئوية 20 s (الخطوة 4)، دورات 31 من الخطوة 2 إلى الخطوة 4 ، وخطوة استطالة نهائي عند 72 درجة مئوية لأدنى 5 استنساخ متجهة المنتج بكر في بكامبيا تعديل 1,300 استخدام Xbaأنا و الباسيفيكيأنا مواقع التقييد. تسلسل ناقل الوجهة المحطة النهائية لتأكيد الاتجاه وتسلسل الجين أيلب المستنسخة في الناقل.
- تحويل الضغط المتبعة EHA101 مع بناء ناقلات النهائية (الشكل 1) كما سبق وصف 16.
- استخدام تحويل المتبعة التي تحتوي على ناقل الوجهة المحطة النهائية لتحويل أجنة الذرة غير ناضجة (ميس زيا L. مرحبا-ثانيا) (يقوم على مصنع تحويل مرفق من جامعة ولاية آيوا) 16.
- تنمو النباتات0 تي في الدفيئة (26-29 درجة مئوية؛ كبيرة ح 16/8 وتستكمل مع "الضغط العالي" نا-مصابيح) وسيلفبوليناتي مرارا وتكرارا للحصول على جيل6 ر لتحقيق هوموزيجوسيتي للسمات المعدلة وراثيا.
2-بوغ إنبات الإنزيم
- حصاد نبات العينات وتخزينها في-80 درجة مئوية. طحن عينات أوراق بقذائف الهاون والمدقة باستخدام النتروجين السائل. تزن بها ز 0.5 في أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل وإضافة 17 ميليلتر من مثبطات البروتياز، ووضع أنابيب على الجليد.
- الطرد المركزي أنابيب لمدة 10 دقائق في س 16,000 ز. نقل ميليلتر 225 لاستخراج مصنع لأنابيب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل ووضع على الجليد.
- في أنبوب الطرد مركزي 15 مل، إعداد تعليق سبور 5 مل الخنزير رشاشيه 70 – التجارة والنقل في مرق سكر العنب البطاطا 1% (w/v). دوامة وضبط تركيز بوغ إلى5 10 جراثيم/مل مع هايموسيتوميتير.
تنبيه: الخنزير (أ) ينتج الأفلاتوكسين، ينبغي أن تجري جميع الأعمال مع هذا الفطر في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء. - احتضان في PDB عند 28 درجة مئوية حتى الثقافة يحقق 50% بدء الإنبات بوغ كما هو مبين بانتفاخ من الجراثيم.
- استخراج الكوة 25 ميليلتر بوغ حل إلى مصنع ميليلتر 225 ودوامه. احتضان عينات لمدة 20 ساعة في 28 درجة مئوية مع الهز متقطعة.
- أنابيب ميليلتر 25 الكوة بوغ الحل شريحة المجهر وقياس طول الجرثومية جراثيم استخدام برنامج الكاميرا الرقمية. استخدام الحد ني قياسات 20 تكرار لكل خط.
ملاحظة: في هذه المرحلة، وضع جميع الثقافات في 4 درجات مئوية لوقف نمو مستعمرة حتى جاهزة الاعتماد.
3-نواة الفحص المقايسة (المملكة العربية السعودية)
- بناء قبعات السعودية بالالتصاق 4 قبعات المفاجئة (22 مم) في طبق بتري 60 × 15 ملم. تسمح الغراء الجافة عن 48 ساعة قبل استخدام أحرف استهلالية. ويشكل كل كاب السعودية النائب واحد (الشكل 2).
- في سلامة بيولوجية عقيمة مجلس الوزراء، رش صينية مربعة الحشري (24 سم x 24 سم) مع 70% إيثانول: ح2س (v/v) والسماح للهواء الجاف. إضافة اللوني العقيمة من الورق إلى علبة الورق. رش 9 السعودية قبعات مع الإيثانول 70%، السماح للهواء الجاف، ووضع في علبة الحشري.
- لكل خط الذرة المعدلة وراثيا يجري اختبارها، حدد 20 حبات غير التالفة ووضع في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي. إضافة الإيثانول 70% والسماح للجلوس لمدة 4 دقائق. بلطف يهز أنابيب أثناء التعقيم. من أجل إيقاف حبات الإيثانول وشطف ثلاث مرات في العقيمة منزوع H2o.
- إعداد تعليق بوغ الخنزير رشاشيه 70 – التجارة والنقل17 من ثقافة قديمة يوم 6 نمت في المتوسط V8 (5% عصير V8، أجار 2%، 5.2 درجة الحموضة).
- إضافة 20 مل العقيمة 0.02% تريتون العاشر-100/منزوع ح2س (v/v) وإلغاء إيقاف جراثيم مع حلقة عقيمة. بيبيت إيقاف العدوى ومكان في كوب معقم 300 مل.
- إعداد 5 إضعاف إضعاف مع 0.02% X-100 تريتون، ثم إجراء إحصاء سبور مع هايموسيتوميتير. تمييع مرة أخرى إذا لزم الأمر للحصول على 100 مل بتركيز 4 × 106 بوغ/مل.
- ضع حبات في كوب معقم 300 مل مع شريط إثارة. أضف العدوى للكأس.
تنبيه: تؤدي إضافة حبات للعدوى الحل إلى البداية. ضع الكأس على طبق من إثارة لمدة 3 دقائق. بعد 3 دقائق، من أجل إيقاف العدوى إلى الكأس فارغ. - استخدام ملقط، ضع حبات في الطبق الحشري (1 نواة في كاب). إضافة منزوع الماء إلى أسفل كل علبة الحشري 30 مل واحتضان في 31 درجة مئوية في الظلام لمدة 7 أيام.
- إعداد حبات للتصوير الفوتوغرافي.
- خصصت 4 حبات من كل سطر للتحليل المجهري والتصوير الفوتوغرافي.
ملاحظة: يمكن تخزين حبات عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد على 5 أيام قبل الانتهاء من التصوير. - التقاط صور لحبات بعد سبعة أيام تطعيم مع الخنزير (أ) (الشكل 3).
- نظيفة من الخارج من حبات مع الأنسجة اللينة والمياه. أداء قطاعات طولية من حبات والتقاط صور فوتوغرافية تحت مجهر فلوري فورا.
- خصصت 4 حبات من كل سطر للتحليل المجهري والتصوير الفوتوغرافي.
- إعداد حبات للتحليل.
- نظيفة من الخارج من حبات المتبقية مع الأنسجة اللينة والمياه.
- 4 مكان الحبوب، التي تشكل 1 مندوب، في البولي ملولبة 15 مل فيال تحتوي على 2 كرات الصلب المقاوم للصدأ. فورا تجميد قارورة في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة والتحليل.
- إزالة قنينات من الثلاجة-80 درجة مئوية وطحن الحبوب في الخالطون في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: الاحتفاظ بحبات المجمدة بالنتروجين السائل.
4-بكر فرز حبات الذرة المعدلة وراثيا
- استخدام مواد عزل الحمض النووي لعزل الحمض النووي (جدنا) من مسحوق حبات الذرة المصابة مع الخنزير (أ) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. بإيجاز، إضافة 280 ميليلتر المخزن المؤقت و و 20 ميليلتر حوزتي 3 ميليلتر ديثيوثريتول (DTT) 10-15 ملغ من مسحوق حبات الذرة. احتضان ويهز في ثيرموميكسير (56 درجة مئوية، 1,200 لفة في الدقيقة، 30 دقيقة). الطرد المركزي في س 10,000 ز لمدة 1 دقيقة ونقل المادة طافية واضحة لعمود متوازن. احتضان في درجة حرارة الغرفة 3 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في 700 x ز لمدة 1 دقيقة الوت جدنا.
- تأخذ 0.8 ميليلتر من جدنا المستخرجة لإعداد رد بكر 20 ميليلتر لكل عينة باستخدام مجموعة أدوات PCR. اتبع الشروط ثيرموسيكلينج كما أوصى في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. تتضمن الشروط PCR خطوة أولية تمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (الخطوة 1) تليها تمسخ عند 98 درجة مئوية 5 s (الخطوة 2)، الصلب في 55 درجة مئوية 5 s (الخطوة 3)، واستطالة عند 72 درجة مئوية 20 s (الخطوة 4)، دورات 40 من الخطوة 2 إلى الخطوة 4 ، وخطوة نهائية استطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (الخطوة 5).
- استخدام التمهيدي إلى الأمام 5 '-تاتاككاكككككاتككجتجت-3' وعكس التمهيدي 5 '-أجكتكجاجكاااجاككا-3' للتأكد من وجود لابلاب أيلب الجينات في حبات الذرة المعدلة وراثيا.
5-الجيش الملكي النيبالي العزلة وتوليف كدنا، وشبه كمي RT-PCR
- خذ تجانس الخنزير ألف إصابة حبات الذرة التي تم تخزينها مسبقاً في-80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي. استخراج الحمض النووي الريبي استخدام عدة عزل الحمض النووي الريبي مجموع وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة ولكن مع تعديل طفيف18. بعد إضافة 50 ملغم مسحوق نواة الذرة المتجانس في المخزن المؤقت للاستخراج، مزجها جيدا (بدون فورتيكسينج) باستخدام تلميح بيبيت 1 مل وترك الأمر على الجليد لمدة 5-6 دقائق قبل الشروع بالخطوات التالية كما هو موضح في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- إعداد كدنا استخدام عدة توليف كدنا وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة 18.
- استخدام 0.5 ميليلتر من كدنا غير مخفف كل تفاعل PCR لشبه كمي RT-PCR كما سبق وصف18. استخدام أجهزة الإشعال إلى الأمام وعكس قايلب إف 5 '-تكككاكاجكاكتاكتج-3' قايلب-ص 5 '-كجتجتكجاجاجاككتاجاتا-3' على التوالي الكشف عن أيلب لابلاب التعبير الجيني، وإلى الأمام وعكس كبسولة تفجير قريب-و 5ʹ-جكتجكتتااجاغت-3ʹ وقريب-R 5ʹ-تكاجتككاكتككاجاتج-3ʹ على التوالي للتعبير عن الذرة ريبوسومال الهيكلية الجينات (الضلع)، GRMZM2G02483819 كجين حفظ البيت.
6-التجارة والنقل كوانتيتيشن
- إعداد 50 مل كل من 0.2 M فوسفات الصوديوم (نة2بو4) و 0.2 متر مائي فوسفات الصوديوم (Na2هبو4·7H2س) بواسطة H2o.
- تشكل 100 مل pH 7.0 سورنسون الفوسفات المخزن المؤقت. لدرجة الحموضة 7.0، إضافة 19.5 مل نة2بو4 الأسهم ومل 30.5 نابو4·7H2س الأسهم ومنزوع 50 مل ح2o.
- تزن 25 ملغ الأرض نواة مواد (الوزن الطازج، مهاجم) ووضع في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.0. إضافة 500 ميليلتر الفوسفات العازلة لأنبوب الطرد المركزي ودوامه لمدة 30 ثانية.
- الطرد المركزي عينات لمدة 15 دقيقة في س 16,000 ز. بيبيت 100 ميليلتر المادة طافية في لوحة سوداء 96 جيدا. قراءة العينات مع فلوروميتير (الإثارة 485 نانومتر، الانبعاثات 528 nm).
7-تحليل الأفلاتوكسين المجموع
- استخراج عينة والأفلاتوكسين والتجهيز
- عينات نواة جافة في فرن هواء قسري لمدة يومين في 60 درجة مئوية. وزن العينات وطرأت 50 مل قارورة Erlenmeyer بسداده زجاجية.
- في غطاء دخان، إضافة كلوريد الميثيلين 25 مل لكل قارورة.
تنبيه: كلوريد الميثيلين شديدة التقلب وتعتبر خطرة (مسرطن مهيجة،). قفازات مطاط لا النتريل آمنة للعمل مع "كلوريد الميثيلين". استخدام قفازات أحجام مقاومة للمذيبات العضوية في تحسن. - هز العينات لمدة 30 دقيقة على شاكر عمل معصم. بعد 30 دقيقة، صب ببطء المقتطف من خلال دائرة مخدد تصفية ورق في الكأس 80 مل. واسمحوا قنينة جافة بين عشية وضحاها في غطاء دخان.
- وفي اليوم التالي بخ كلوريد الميثيلين (حوالي 5 مل) حول الداخل ريم من قنينة جافة ودوامه حولها وصب في قنينة زجاجية 2 درام. فتح قارورة إجازة لتجف في غطاء دخان بين عشية وضحاها.
- تحليل الأفلاتوكسين
- إضافة الميثانول 80% مل 4.0: منزوع ح2س (v/v) في قنينة.
- استخدام مجموعة الأفلاتوكسين استخراج مواد لتصفية تنقية الميثانول الحل مع العمود المتوفرة. تحليل مستويات إجمالي الأفلاتوكسين مع فلوروميتير، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحويل الذرة والفحص الجزيئي للنباتات المعدلة وراثيا
تم تحويل الأجنة غير ناضجة من الذرة مرحبا-ثانيا خطوط استخدام سلالة EHA101 tumefaciens المتبعة التي تحتوي على ناقل الوجهة المحطة النهائية معربا عن الجين أيلب purpureus لابلاب الخاضعة لسيطرة كامب 35S مروج. كانت متقدمة خمس خطوط الذرة محولة بشكل مستقل لتوليد T6 للدراسات اللاحقة. نباتات الذرة المعدلة وراثيا كانت أصغر بكثير وأقل قوة ولكن لم تظهر أي تشوهات أخرى مقارنة بمحطات المراقبة السلبية اسوي. أظهرت [بكر] تضخيم الجينات المستهدفة أيلب أمبليكون bp 548، لاحظت فقط في خطوط الذرة المعدلة وراثيا مقارنة بمحطات التحكم (الشكل 4 أ). أظهر الجين أيلب التعبير في الأسطر المعدلة وراثيا في حين لم يلاحظ أي تعبير أيلب في محطات التحكم (الشكل 4 باء).
رشاشيه الخنزير مقتطفات بوغ المقايسة مع أوراق
أوراق الخام يستخرج من الذرة المعدلة وراثيا الشباب أعدها مصانع طحن في سائل ن وسينتريفوجينج في 16,000 س ز. جراثيم الإنبات في مرحلة مبكرة قد تعرضت لاستخراج أوراق لمدة 20 ساعة وسجلت طول سبور يعني أصله من عينات 20. طول أصله من جراثيم يتعرضون لمستخلصات نبات المعدلة وراثيا أظهرت انخفاضا 58%-80% مقارنة بمراقبة سلبية (الشكل 5)
رشاشيه الخنزير النمو خلال الإصابة بالنواة
وأجرى مقايسة فحص النواة (السعودية) لدراسة نمو الخنزير (أ) في الحبوب المعدلة وراثيا والتحكم. التعبير عن الجين أيلب في الحبوب المعدلة وراثيا سلبا على نمو الخنزير (أ) . سلالة الخنزير (أ) المستخدمة في الدراسة الحالية تحتوي على بروتينات فلورية خضراء المراسل الذي تمكن من رصد والتقدير الكمي لنمو الفطريات في الوقت الحقيقي. ولوحظ تخفيض كبير في التجارة والنقل الأسفار في حبات أيلب المعدلة وراثيا مقارنة بمراقبة سلبية اسوي (الشكل 6). أيلب خطوط 4 و 5 أظهرت انخفاضا كبيرا في نمو الفطريات، 69 في المائة و 72 في المائة، على التوالي، تليها الخطوط الأخرى حيث لوحظ انخفاض 35%-60% بالمقارنة مع حبات التحكم (الشكل 7 أ).
إنتاج الأفلاتوكسين في حبات المصابة
تعبير مغايرة للجين أيلب في الذرة أدت إلى خفض كبير في محتوى الأفلاتوكسين في الأسطر المعدلة وراثيا مقابل عنصر التحكم. توفير بيانات الأفلاتوكسين هنا هو محتوى الأفلاتوكسين مجموع الكشف في حبات المصابة. ولوحظ انخفاض نسبة 62%-88% في محتوى الأفلاتوكسين في حبات أيلب بالمقارنة مع عنصر التحكم (الشكل 7). من بين 5 خطوط أيلب مختلفة، أظهرت 4 خط محتوى الأفلاتوكسين أدنى (من 486 نانوغرام/غرام وزن جاف)، تليها خطوط أخرى تتراوح بين 640-1,498 نانوغرام/غرام وزن جاف في حبات مقابل التحكم (3,986 نانوغرام/غرام وزن جاف).
رقم 1: تصميم ناقل للتعبير المعدلة وراثيا جين أيلب لابلاب في الذرة. 35S = فيروس تبرقش القنبيط أو مروج كامب التأسيسي؛ م ع = الحد الأيمن؛ رطل = الحد الأيسر؛ نبتيي = النيوميسين فوسفوترانسفيراسي-كاناميسين المقاومة الجينات؛ غ و 35s = المنهون النسخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نواة الفحص المقايسة. (أ وب) تعقيم الحبوب وتصب في كوب معقم في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء. (ج-ه) تلقيح الألباب مع تعليق بوغ الخنزير (أ) . (F – H) استخدام ملقط عقيمة، ضع حبات في صحن الحشري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الضوء ميكروجرافس الخنزير (أ) نمو. (أ) مراقبة سلبية اسوي. (ب-و) الحبوب المعدلة وراثيا معربا عن أيلب (خطوط 1-5) أسبوع واحد بعد التطعيم. مقياس بار = 1 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4- الفحص الجزيئي للنباتات المعدلة وراثيا- (أ) بكر تأكيدا لنباتات الذرة المعدلة وراثيا (الممرات 1-5) التي تحتوي على أيلب لابلاب (548 bp التشخيص الحمض النووي جزء؛ ج = اسوي مراقبة سلبية؛ NEB 2-سجل الحمض النووي سلم المستخدمة كعلامة الحمض النووي). (ب) التعبير عن الجينات أيلب لابلاب في خطوط الذرة المعدلة وراثيا (الممرات 1-5) استخدام RT-PCR. يمثل "ج لين" اسوي مراقبة سلبية. الذرة ريبوسومال الهيكلية الجينات (الضلع)، GRMZM2G02483819 كجين حفظ البيت (NEB 2-سجل سلم الحمض النووي: علامة الحمض النووي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5- تأثير النفط الخام نبات تستخرج من النباتات أيلب الذرة المعدلة وراثيا على الإنبات بوغ الخنزير (أ) بالمقارنة مع عنصر تحكم سلبية اسوي (الراتب)- وكان به فصل يعني posttest دونيت في بعد ANOVA. تتم الإشارة إلى مستويات انخفاض كبير بالعلامات النجمية (* * *P ≤ 0.0001). أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ القياسي للوسائل لعينات العشرين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6- Fluorescence بروتينات فلورية خضراء النابعة من الخنزير (أ) سلالة 70-التجارة والنقل في الحبوب المعدلة وراثيا معربا عن أيلب بعد أسبوع واحد من العينة- واستخدمت عناصر سلبية اسوي (A) لتقييم العدوى الفطرية، وانتشر في الحبوب المعدلة وراثيا (ب-و تمثل الخطوط المعدلة وراثيا 1-5). تم فحص حبات على الأقل أربعة لكل خط تحت مجهر فلوري. شريط مقياس = 2 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
7 الرقم: إنتاج الخنزير النمو ووالافلاتوكسين. (أ) الإصابة الخنزير ألف- 70-التجارة والنقل والنمو في حبات الذرة بعد 7 أيام في "مقايسة فحص النواة". في المتوسط ثلاث تجارب مستقلة مع أربعة البيولوجية وإنشاء نسخ متماثلة في كل مرة. التجارة والنقل الكمي (في "وحدات Fluorescence النسبي"، رفو) يشير إلى نمو الفطريات في خطوط الذرة المعدلة وراثيا معربا عن أيلب إلى عنصر تحكم سلبية اسوي. وكان به فصل يعني posttest دونيت في بعد ANOVA. هو إلى مستويات انخفاض كبير بواسطة العلامات النجمية (*P ≤ 0.05؛ * *P ≤ 0.01؛ * * *P ≤ 0.001). أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ القياسي للوسائل لأربع تجارب معشاة replicates البيولوجية. (ب) إنتاج الأفلاتوكسين من 70 ألف-الخنزير -بروتينات فلورية خضراء في حبات الذرة بعد 7 أيام في "مقايسة فحص النواة". الواردة في المتوسط 12 replicates البيولوجية وتكرار كل أربع حبات. مستويات الأفلاتوكسين في حبات أيلب المعدلة وراثيا (البنود 1-5) بالمقارنة مع عنصر تحكم سلبية اسوي (neg). وكان به فصل يعني posttest دونيت في بعد ANOVA. هو إلى مستويات انخفاض كبير بواسطة العلامات النجمية (* *P ≤ 0.01؛ * * *P ≤ 0.001). أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ القياسي للوسائل لأربع تجارب معشاة replicates البيولوجية. انظر "الشكلين تكميلية" لعرض البيانات في لوحة ب خالية من التحيز بسبب تثبيط الفطرية. إغلاق الارتباط بين بروتينات فلورية خضراء = رفو والأفلاتوكسين كما يتم توفير القيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 1: بيانات 7B الشكل رسم لإظهار إنتاج الأفلاتوكسين من 70 ألف-الخنزير -بروتينات فلورية خضراء في حبات الذرة بعد 7 أيام في "مقايسة فحص النواة" للقضاء على التحيز بسبب تثبيط نمو الفطريات. تم تقسيم قيم الأفلاتوكسين بتثبيط نمو الفطريات ممثلة كقيم التجارة والنقل-رفو في الشكل 7B. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 2: إغلاق الارتباط بين قيم التجارة والنقل-رفو (= نمو الفطريات) ومستويات الأفلاتوكسين (ص2 = 0.86) أفادت بالمملكة العربية السعودية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العائد الخسائر في المحاصيل الزراعية بسبب مسببات الأمراض والآفات هو مشكلة عالمية20. حاليا، هو تطبيق لمبيدات الآفات ومبيدات الفطريات الاصطناعية الوسيلة الغالبة للسيطرة من مسببات الأمراض النباتية والآفات، ولكن سمية المتبقية من هذه بيوشميكلس في الأغذية والأعلاف يمكن أن تشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان والحيوان21. ونظرا للأهمية الاقتصادية للذرة كالأغذية والمحاصيل العلفية، خفض أو القضاء على التلوث الأفلاتوكسين من الأهمية بمكان2،3،22. التربية التقليدية من خلال الجينات المقاومة إينتروجريشن إلى أصناف عرضه عملية تستغرق وقتاً طويلاً، وهذه المقاومة ليست دائماً مستقرة كما المقاومة الأفلاتوكسين سمة جينائي والتعبير عن الجينات المشاركة تختلف بشكل ملحوظ مع التغييرات في البارامترات البيئية4. ويجري تقييم نهج بديلة لزيادة واستقرار الدفاع النبات المضيف ضد الخنزير (أ) بطريقة ecofriendly.
في الدراسة الحالية، ولقد اخترنا لتقييم فعالية الجينات أيلب من حبوب صفير في الذرة ضد الخنزير (أ). مثبط تنافسي من α-الأميليز أيلب وأيضا يملك الخصائص المضادة للفطور، أعربنا عن هذا الجين تحت مروج تأسيسي قوية كامب 35S. والهدف زيادة إنتاج هذا البروتين مغايرة في الذرة بغض النظر عن نوع النسيج أو مرحلة النمو. تعبير كبير من الجينات α-الأميليز في خطوط الذرة المعدلة وراثيا (الشكل 4 أ، ب) يدعم تعبير مستقر لهذا الجين في نظام مغايرة. وهذا أثر سلبا على نمو الفطريات وكما يتبين من الانخفاض في التوزيع المكاني للأسفار بروتينات فلورية خضراء داخل حبات أيلب المصابة وانخفاض في الأسفار التجارة والنقل العام في حبات (الشكل 6 و الشكل 7 أ).
تطوير التحليل فحص النواة (السعودية) يستخدم المهندسة وراثيا سلالة مراسل الخنزير (أ) التعبير عن جينات ترميز البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) من قنديل البحر فيكتوريا أيكووريا18، 23-وضع استراتيجيات التحكم لأي مسببات المرض، من الضروري فهم وضع الإصابة، تنتشر والاستعمار داخل النبات المضيف أو الأنسجة. أن الاستعمار وانتشار سابروفيتي أفلاتوكسيجينيك، الخنزير (أ) ليس جيدا فهم سبب التنظيم الوراثي للمقاومة لمسببات المرض، في حالة وجود واحدة، ليست مفهومة جيدا. استخدام سلالة الإعراب عن بروتينات فلورية خضراء الخنزير (أ) يجعل من الممكن تتبع في الوقت الحقيقي بعملية العدوى والاستعمار. سلالة بروتينات فلورية خضراء وفي البرية من النوع لم تختلف كثيرا في الممرض العدوانية والافلاتوكسين إنتاج23. ومع ذلك، يوضع الجين بروتينات فلورية خضراء في هذه السلالة خاصة تحت سيطرة جليسيرالديهيدي مؤثرا عن الفوسفات نازعة (gpdA) الجينات المروج 24 التي أكثر ملائمة لتتبع نمو الفطريات. ومع ذلك، استخدام هذه وصمة عار على الزيت وحبات الذرة، أظهرنا علاقة وثيقة بين التجارة والنقل fluorescence المنبثقة من الفطريات لنمو الفطريات والأفلاتوكسين مستويات18،23.
بروتينات فلورية خضراء يقودها مروجي الجينات الأفلاتوكسين مثل الصريحةألف أو25، فير-126 إقامة علاقة وثيقة مع القدرة على إنتاج الأفلاتوكسين، سوف يكون أكثر مناسبة من gpdألف الأسفار بروتينات فلورية خضراء حساسة بما يكفي للسماح بالكشف والقياس في الوقت الحقيقي حتى التغيرات الصغيرة في نمو الفطريات، على حد سواء في المختبر و في بﻻنتا، وتقييم الأنشطة المثبطة الببتيدات والبروتينات المضادة للفطور غير معروف مثل أيلب وغيرها11،،من1718،23. وبالإضافة إلى ذلك، يرتبط النتائج من المملكة العربية السعودية أيضا مع الأداء الميداني لخطوط الذرة مقاومة أو عرضه فيما يتعلق بالتقييم ل التلوث الأفلاتوكسين27.
المملكة العربية السعودية مفيد جداً في المختبر للشاشة ولدت كلاسيكي جديد الأصناف4 وخطوط المعدلة وراثيا11،18. من السهل إعداد وتنفيذ المملكة العربية السعودية في أي مختبر. يحتاج المرء إلى استخدام حبات نظيفة سليمة لتنفيذ هذا التحليل بحيث يمكن تقييم فهم واضح للتفاعل النباتات الفطرية المضيف. نحن تفحص بشكل روتيني جميع حبات التي نستخدمها في المختبر تحت ستيريوميكروسكوبي قبل القيام الفحص. تجدر الإشارة إلى أن الظروف التي نتبعها للمملكة العربية السعودية تشمل رطوبة عالية (95% رطوبة نسبية) ودرجة حرارة ثابتة (31 درجة مئوية). مع بداية عملية محاكاة الإنبات في ظل هذه الظروف، الفحص يوفر ظروفا مثالية لاختبار سلامة معطف البذور والتركيب الوراثي للحبوب بما في ذلك الجينات المضادة للفطور/البروتينات قيد التشغيل أثناء الإنبات، و/أو الفطريات العدوى. إنتاج الأفلاتوكسين والعدوى الفطرية ستكون دائماً أعلى في المملكة العربية السعودية مقارنة بوقوعها في هذا الميدان؛ ومع ذلك، كان ارتباط وثيق المنشأة4،27.
لقد أظهرنا في هذه المملكة العربية السعودية أن أيلب يحد من نمو الفطريات في حبات الذرة. أيلب يملك الخصائص المضادة للفطور من نبات ليكتينس، وقد ثبت أن تمنع α-الأميليز، انهيار النشا في التناقص، ويحد من نمو الفطريات. في المختبر أثبتت الدراسات أن أيلب قادرة على تثبيط الخنزير (أ) وكان النمو في البطاطا الغنية بالسكر سكر العنب مرق (PDB) النمو الصناعي المتوسط، تشير إلى نشاطها تثبيط النمو مضاد/مستقلة تثبيط الأميليز 13من النشاط. ليكتينس النباتات الأخرى معزولة من dioica قراص (نبات القراص المشتركة)، البرازيلية Hevea (شجرة المطاط)، ودرنات البطاطا (البطاطس) كما تظهر خصائص المضادة للفطور مماثلة وأعاقت نمو أسود Botrytis ، تبقع tritici، و oxysporum مغزلاويه28،29،،من3031. مثبطات الأميليز ألفا ليست فقط فعالة ضد الفطريات والبكتيريا ولكن قد تبين أيضا أن تكون فعالة ضد الآفات الحشرية32. Amylases ألفا يقال أن تكون حاسمة بالنسبة للنمو الطبيعي وتطوير حشرات تغذية النبات، وقد تم عدة الحشرات α-الأميليز مثبطات معزولة من النباتات مثل القمح والفاصوليا الشائعة، و الذرة12،33، ،من 3435. انخفاض كبير في طول أصله الفطرية من جراثيم عرضه لورقة النفط الخام مقتطفات (الشكل 5)، انخفاض في نمو الفطريات في الذرة أيلب-الإعراب عن حبات كما يتبين من الحد الأسفار بروتينات فلورية خضراء نوعيا ( 6 الشكل) والكمية (الشكل 7 أ) ربما بسبب مزيج من خصائصه تثبيط ومضاد α-الأميليز. تجارب باستخدام هذه الذرة أيلب-الإعراب عن محطات ضد الأخرى المسببة للأمراض والآفات في المستقبل سوف تكون ذات أهمية كبيرة لاختبار فعاليتها ضد الضغوطات الحيوية متنوعة من البذور والأنسجة النباتية. خصائص تثبيط النمو ومضاد يكتين يعزى أساسا إلى به العابرة للربط مع كيتين وتثبيط التوسع تلميح أصله28. في الواقع، أظهرت تثبيط أيلب بوساطة في المختبر من α-أميلاسيس من أصول الفطرية والبكتيرية المختلفة ما يزيد على 65% تثبيط في مسببات الأمراض الفطرية بما في ذلك الخنزير (أ)، و رمادية ماجنابورثي، Helminthosporium victoriae، و 41 تثبيط % في مسببات المرض البكتيري Bacillus نجحت13. وتتماشى النتائج في الحد نمو الخنزير (أ) المقدمة هنا دور مثبطات α-الأميليز باعتبارها العوامل المضادة للفطور. الدراسة الحالية أيضا يوضح التطبيق العملي لهذه المعلومات المفيدة التي تم الحصول عليها من الدراسات في المختبر في وقت سابق.
انخفاض في محتوى الأفلاتوكسين (الشكل 7) في أيلب-الإعراب عن خطوط الذرة هو ربما بسبب تثبيط النشاط α-الأميليز الخنزير (أ) ، مما أدى إلى انهيار تقلص من النشويات المخزنة، وخفضت الحصول على السكريات مصدر للطاقة من حبات الذرة أثناء التفاعل المسببة للأمراض. كما الفطرية α-الأميليز دوراً هاما في كسر النشويات النواة، يغير أي تغيير في نشاط الأميليز α الفطرية أيلب المحتمل محتوى السكر للذوبان أثناء الإصابة بالنواة. وقد كان محتوى السكريات قابل للذوبان، لا سيما السكروز والجلوكوز، ارتباطاً وثيقا مع زيادة إنتاج الأفلاتوكسين1 ومجموعة AFB في الذرة وغيرها من المحاصيل الخنزير (أ) عرضه مثل الفول السوداني36،37. زيادة محتوى السكروز في وسائط النمو الصناعي يزيد إنتاج الأفلاتوكسين الخنزير (أ) 38. إيجابيا أيضا المساهمة الأخرى السكريات قابل للذوبان مثل الجلوكوز والمالتوز إنتاج الأفلاتوكسين في وسائل الإعلام مصطنعة والبذور ركائز38. تثبيط النشاط α-الأميليز وانخفاض إنتاج ميكوتوكسين في الفطريات الأخرى يعزز دور هام من α-أميلاسيس الفطرية في إنتاج السم أثناء الإصابة بالنواة. خروج المغلوب الأميليز ألفا طفرات فيرتيسيليويديس واو و الخنزير (أ) فشلت في تحقيق الفيومونيزين ب1 والأفلاتوكسين بعد الإصابة من حبات الذرة9،10على التوالي. وبالمثل، أسفل-تنظيم الخنزير ألف- α-الأميليز تخفيض كبير إنتاج النمو والافلاتوكسين الفطرية خلال نواة الذرة العدوى11. 62 88 ٪ تخفيض الأفلاتوكسين في الأسطر المعدلة وراثيا وفقا لتقارير سابقة عن دور α-الأميليز في إنتاج الأفلاتوكسين. جدير بأن في المختبر نواة الفحص المقايسة (المملكة العربية السعودية) أكثر صرامة من العثور عليها عادة في ظل الظروف الطبيعية. الظروف أثناء الفحص في المختبر أيضا مواتية جداً لإنتاج الأفلاتوكسين، ذلك النسبة المئوية للتغير في محتوى الأفلاتوكسين في الأسطر المعدلة وراثيا قد يكون أجدى بدلاً من الأرقام المطلقة لمحتوى الأفلاتوكسين في حبات المصابة. النتائج المعروضة هنا واعدة والتجارب المقبلة في ظل أوضاع ميدانية هامة دراسة إمكانات هذه أيلب-الإعراب عن خطوط الذرة لمقاومة الأفلاتوكسين ضمن سيناريو طبيعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد المؤلفون لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن نشكر ديفيد مينتس، جامعة أركنسو لمساعدته في وضع وتحليل الذرة المعدلة وراثيا خلال الأجيال المبكرة. هذا العمل وتلقى دعم مالي من وزارة الزراعة-أرس "المراكز الجهوية للاستثمار" المشروع 6054-42000-025-00D. الإشارة إلى الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المادة هو فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من قبل "وزارة الزراعة الأمريكية". سياسة وزارة الزراعة أرس الفرصة (تكافؤ) ولايات تكافؤ الفرص لجميع الأشخاص ويحظر التمييز في جميع جوانب سياسات شؤون الموظفين التابعة للوكالة، والممارسات والعمليات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Caisson | ||
| Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
| C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
| Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
| Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
| Ethanol | |||
| FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
| Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
| Force Air Oven | VWR | ||
| FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
| Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
| Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves | Ansell | 012-15-554 | |
| Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| liquid Nitrogen | |||
| Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
| Methanol | |||
| Methylene Chloride | |||
| Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
| Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
| Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
| Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
| Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
| Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
| Potato Dextrose Broth | |||
| Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
| Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
| Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
| Stir Plate | |||
| Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| V8 juice | Campbell's | ||
| Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |
References
- Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
- Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
- Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
- Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
- Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
- Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
- Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
- Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
- Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
- Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
- Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
- Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
- Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
- Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
- Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
- Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
- Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
- Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
- Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
- Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
- Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
- Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
- Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
- Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
- Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
- Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
- Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
- Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
- Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
- Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
- Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
- Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
- Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
- Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
- Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
- Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
- Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
- Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).
