Summary
여기 선물이 분석 Aspergillus flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산 옥수수 커널에서 항진균 단백질을 표현 하는 프로토콜. 우리는 감염 및 실시간으로 성숙한 커널에 곰 팡이의 확산을 모니터링 GFP 표현 A. flavus 긴장을 사용 하 여. 분석 결과 신속 하 고 신뢰할 수 있는, 재현.
Abstract
아플 라 톡 신 오염 식품 및 사료 작물은 전세계 주요 도전 이다. Aflatoxins, Aspergillus flavus (A. flavus) 균에 의해 생산은 실질적으로 옥수수와 인간과 동물 건강에 심각한 위협이 포즈 외 땅콩 같은 다른 기름 풍부한 작물 자르기 값을 줄일 수 있는 강력한 발암 물질. 전통적인 번 식, 저항 관련 된 단백질과 RNA 간섭 (RNAi)의 유전자 변형 식을 포함 하 여 다른 접근-호스트 유도 유전자 침묵의 중요 한 A. flavus 기반 유전자 대상, 평가 되 고 증가 하 아플 라 톡 신 취약 작물에 저항입니다. 과거 연구 A. flavus pathogenesis 및 아플 라 톡 신 생산,이 유전자/효소 제안에 α-아 밀라 아 제의 중요 한 역할은 A. flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산을 줄이기 위해 잠재적인 대상으로 나타났습니다. 이와 관련, 현재 연구 A. flavus에 대 한 옥수수에 Lablab purpureus L. α-아 밀라 아 제 억제제와 같은 단백질 (AILP)의 (제정 CaMV 35S 발기인 통제) 분리 식 평가에 착수 했다. AILP A. flavus α-아 밀라 제 효소의 경쟁적 억제제 이며 콩 공통 lectin-arcelin-α-아 밀라 아 제 억제 물 단백질 가족에 속하는 36 kDa 단백질 이다. 현재 작업 전에 생체 외에서 연구 A. flavus α-아 밀라 제 활동 및 곰 팡이 성장 억제에 AILP의 역할을 시연 했다. 곰 팡이 성장 및 성숙한 커널에서 아플 라 톡 신 생산 GFP 표현 A. flavus 긴장을 사용 하 여 실시간으로에서 감시 되었다. 이 커널 분석 (KSA) 상영은 매우 간단 합니다을 설정 하 고 germplasm 및 유전자 변형 라인의 평가 대 한 감염 및 측정할 수 있는 확산의 범위에 안정적이 고 재현 가능한 데이터를 제공 합니다. GFP 긴장에서 형광 곰 팡이를 밀접 하 게 연관 된 성장 이며, 확장 하 여, 그것은 아플 라 톡 신 값을 잘 상관. 현재 작업의 목표는 아플 라 톡 신 저항을 증가 하는 옥수수 처럼 상업적으로 중요 한 작물에서이 이전 지식을 구현 했다. 우리의 결과 표현 하는 AILP 유전자 변형 옥수수 알갱이, 차례 차례로, 아플 라 톡 신 레벨 62%-88% 감소에 번역에 A. flavus 성장에 35%-72% 감소를 보여 줍니다.
Introduction
Aspergillus, 강했다 Fusarium, 푸른 곰 팡이, 곰 팡이 속으로 mycotoxin 오염 식품의 중요 한 문제 이며, 사료 작물 재배 전세계1,2,3. 이러한 phytopathogenic 버섯 중 Aspergillus 자르기 값과 인간과 동물 건강에 가장 불리 한 충격이 있다. Aspergillus flavus (A. flavus)은 옥수수, 면 실 등 땅콩 기름 풍부한 작물을 감염 하 고 수많은 독성 2 차 대사 산물 (SMs) 뿐만 아니라 강력한 발암 물질, aflatoxins, 생성 한 기회주의적 식물 병원 체 이다. 옥수수는 중요 한 음식 및 전세계 재배 작물을 먹이 이며 A. flavus에의해 오염에 매우 쉽습니다. 아플 라 톡 신 오염에의 경제적 영향을 잃고 및 옥수수에 감소 값으로 686.6 백만 달러/년 미국2 예측 변화 글로벌 기후에, aflatoxins의 영향으로 옥수수에 큰 경제적 손실을 초래할 수 있습니다. 평가 높은 1.68 십억 달러/년 가까운 미래2. 인간과 가축에 aflatoxins의 불리 한 경제 및 건강 효과 감안할 때, 옥수수에 사전 수확 아플 라 톡 신 제어 식품의 아플 라 톡 신 오염 방지 제품을 공급 하는 가장 효율적인 방법을 수 있습니다.
지난 몇 십년에 광범위 하 게 사용 된 옥수수의 아플 라 톡 신 저항에 대 한 주요 사전 수확 제어 접근 시간4의 상당한 금액을 요구 하는 번 식 통해 주로 이다. 최근, biocontrol 대규모 필드 응용 프로그램5,6에서 아플 라 톡 신 감소에서 약간의 성공을 했다. Biocontrol, 게다가 최첨단 분자 도구 ' 호스트 유도 유전자 침묵 ' RNAi 통해 (HIGS) 등의 응용 프로그램 및 저항 관련 단백질의 유전자 변형 식 몇 가지 성공을 했다 A. flavus 성장과 아플 라 톡 신에의 감소에 작은 규모의 실험실 및 현장 연구에 있는 생산. 이러한 접근은 현재 미래 조작 위한 새로운 잠재적인 A. flavus 유전자 표적 식별 이외에 최적화 되 고 있습니다.
유전자 유전자 변형 제어 전략의 잠재적인 대상으로 mycotoxin 생산에 직접 관련 되는, 게다가 곰 팡이 amylases 성공적인 pathogenesis 및 mycotoxin 생산 초기 단계를 유지 하는 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 호스트 공장 감염. 몇 가지 예로 Pythium pleroticum (생강 rhizome 부패의 인과 대리인), Fusarium solani (콜리플라워 윌 트의 인과 대리인), 긍정적인 상관 관계 pathogenicity와 α-아 밀라 제 식 및 활동 사이 를 관찰 했다 7,8. 유전자 녹아웃 또는 최저의 방법을 통해 α-아 밀라 제 활동의 금지는 곰 팡이 성장과 독 소 생산을 부정적인 영향을 줍니다. A. flavus 의 α-아 밀라 제 녹아웃 돌연변이 aflatoxins 전 기판 또는 degermed 옥수수 커널9에 성장 될 때 생산 하지 못했습니다. 마찬가지로, Fusarium verticillioides 에 α-아 밀라 제 녹아웃 스트레인 옥수수 커널10의 감염 시 fumonisin B1 (mycotoxin)을 생산 하지 못했습니다. 더 최근의 연구에서 길버트 외. (2018) 시연 HIGS 통해 A. flavus α-아 밀라 제 식의 아래로 RNAi 기반 노크 크게 감소 옥수수 커널 감염11 시 A. flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산 .
또한 α-아 밀라 제 활동의 특정 억제제는 α-아 밀라 제 식의 다운 레 귤 레이 션으로 비슷한 결과 생산 했습니다. 곰 팡이 저항에는 α-아 밀라 아 제 억제제의 역할에 첫 번째 보고서는 분리와 옥수수 라인 저항 A. flavus12에서 14 kDa 트립 신-α-아 밀라 아 제 억제제의 특성에서 왔다. 더 Lablab purpureus L.13, 히 아 신 스 콩의 씨앗에서 Fakhoury 및 Woloshuk 36 kDa α-아 밀라 아 제 억제제와 같은 단백질 (AILP)의 식별에 의해 식물 종의 수백의 상영. Lectin-arcelin-α-아 밀라 아 제 억제 물 가족에 속하는 AILP 닮은 lectins의 펩 티 드 순서 일반적인 콩14,15보고. 순화 AILP 포유류 trypsin 및 A. flavus 성장 및 conidial 발 아13의 중요 한 금지를 보여주었다 생체 외에서 특성 추가 금지 행위를 발생 하지 않습니다. 제시 하는 보고서 여기 명확 하 게 쇼 α-아 밀라 제 역할을 할 수 제한 하는 병원 체 또는 전 분 (α-아 밀라 제 활동)을 통해 동원 및 중 에너지 원으로 녹는 설탕의 수집에 의존 하는 해충을 제어 방식에서 대상 들 호스트 식물 병원 성 상호 작용입니다.
알파-아 밀레이 스 A. flavus pathogenicity9,,1011, 그리고 강력한 안티-A. flavus 에이전트 (α-아 밀라 제 억제/antigrowth)13, AILP의 중요성을 감안할 때 중요 한 것으로 알려져 있다 Lablab AILP 을 표현 하는 유전자 변형 옥수수 식물 생성 제정 CaMV 35S 발기인에서 유전자. 목표는 옥수수에이 α-아 밀라 아 제 억제 물의 분리 표현식이 A. flavus pathogenesis 및 아플 라 톡 신 생산 옥수수 커널 감염에 대 한 효과 조사 했다. 우리의 결과 AILP를 크게 표현 하는 유전자 변형 옥수수 커널 커널 감염 시 A. flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산 감소를 보여 줍니다.
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Protocol
1. 플라스 미드 구조와 옥수수 변환
- PCR 증폭 Lablab AILP 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 '와 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3' 뇌관을 사용 하 여 삽입. PCR 조건 포함 30 98 ° C에 초기 변성 단계 s (1 단계), 뒤에 98 ° C 10에서 변성 s (2 단계), 55 ° C 30에서 어 닐 링 s (3 단계), 신장 20 72 ° C에서 s (4 단계), 4 단계로 2 단계 31 주기 그리고 내가 및 Pst최종 신장 5 분 수정된 pCAMBIA 1300으로 PCR 제품 벡터 Xba를 사용 하 여 복제를 위한 72 ° C에 단계 나 제한 사이트. 방향 벡터에서 복제 한 AILP 유전자의 순서를 확인 하는 최종 공장 대상 벡터 시퀀스입니다.
- 앞서 설명한 16 Agrobacterium 스트레인 EHA101 최종 벡터 구조 (그림 1)으로 변환 합니다.
- 사용 변형 Agrobacterium 최종 공장 대상 벡터 포함 된 미 숙 옥수수 (지 시 메이 스 L. 안녕 II) 배아 (식물 변환 시설의 아이오와 주립 대학에서 수행)을 변환할 16.
- T0 식물 (26-29 ° C, 16/8 h photoperiod 고압 나 램프 보충) 온실에서 성장 하 고 반복적으로 달성 homozygosity 유전자 변형 특성에 대 한 T6 세대를 self-pollinate.
2. 포자 발 아 시험
- 잎 샘플을 수확 하 고-80 ° c.에 저장 박격포와 유 봉 액체 질소를 사용 하 여 리프 샘플을 갈기. 2 mL microcentrifuge 튜브에 0.5 g으로 무게를 다 십시오, protease 억제제의 17 µ L을 추가 하 고 얼음에 튜브를 배치.
- 튜브 16000 x g에서 10 분 원심 식물 추출 물 0.5 mL microcentrifuge 관에 225 µ L를 전송 하 고 얼음에 놓습니다.
- 15 mL 원심 분리기 튜브에서 Aspergillus flavus 70-1% 감자 포도 당 국물 (w/v)에 GFP의 5 mL 포자 현 탁 액을 준비 합니다. 와 동5 포자/10ml를 haemocytometer와 하 포자 농도 조정 하 고.
주의: A. flavus aflatoxins 생산, 생물 안전 캐비닛에이 곰 팡 두 일을 지휘 한다. - 품 어 PDB에 28 ° C에서 문화 달성 50% 개시의 포자 발 아 포자의 불 룩 한으로 표시 될 때까지.
- 소용돌이 225 µ L 공장 aliquot 25 µ L 포자 솔루션 추출합니다. 간헐적으로 떨고와 28 ° C에서 20 시간에 대 한 샘플을 품 어.
- 현미경 슬라이드 및 측정 길이 세균의 포자 솔루션의 aliquot 25 µ L 튜브 포자 디지털 카메라 소프트웨어를 사용 하 여 합니다. 20 복제 측정의 최소를 사용 하 여 각 라인에 대 한.
참고:이 단계에서 계산에 준비까지 식민지 성장을 중지 하 4 ° C에서 모든 문화를 배치 합니다.
3입니다. 커널 분석 (KSA) 결과 심사
- 60 x 15 mm 페 트리 접시에 4 스냅 캡 (22 m m)를 접착 하 여 KSA 모자를 생성 합니다. 접착제 모자를 사용 하기 전에 48 H 동안 건조를 허용 합니다. 각 KSA 모자 한 의원 (그림 2)를 구성합니다.
- 메 마른 생물 안전 캐비닛에서 70% 에탄올: H2O (v/v) 사각형 검정 트레이 (24 x 24cm)를 스프레이 하 고 공기 건조를 보자. 살 균 크로마토그래피 용지 트레이를 추가. 9 KSA 캡 70% 에탄올 스프레이, 공기 건조, 검정 쟁반에.
- 테스트 중인 각 유전자 변형 옥수수 줄, 20 손상 되지 않은 커널 선택 하 고 50 mL 원심 분리기 튜브에. 70% 에탄올을 추가 하 고 4 분 동안 앉아 보자. 부드럽게 살 균 동안 튜브를 흔들. 부 세 번 살 균 이온된 H2o.에서에서 에탄올과 린스 커널 어
- Aspergillus flavus 70-6 일 오래 된 문화에서 GFP17 V8 매체 (5% 쥬 스 V8, 2 %agar, pH 5.2)에서 자란의 포자 현 탁 액을 준비 합니다.
- 20 mL 살 균 0.02% 트리톤 X-100/이온된 H2O (v/v)을 추가 하 고 메 마른 루프와 포자에서 스크랩. 피펫으로 inoculum와 300 mL의 멸 균 비 커에 장소.
- 0.02와 5 희석 준비 % 트라이 톤 X-100 포자 수는 haemocytometer로 수행. 4 x 106 포자/mL의 농도로 100 mL를 얻기 위해 필요한 경우에 다시 희석.
- 저 어 바 살 균 300 mL 비 커에 커널 넣습니다. 비 커에 inoculum을 추가 합니다.
주의: 솔루션 시작을 하면 inoculum을 커널에 추가 됩니다. 3 분 저 어 접시에 비 커를 놓습니다. 3 분 후 빈 비 커에 inoculum을 붓는 다. - 집게를 사용 하 여 커널 검정 접시 (1 커널/모자)에 배치 합니다. 30 mL 각 검정 트레이 하단에 저온 및 7 일 동안 어둠 속에서 31 ° C에 품 어 추가 합니다.
- 사진에 대 한 커널 준비.
- 현미경 분석 및 사진에 대 한 각 줄에서 옆으로 4 커널 설정 합니다.
참고: 커널 4 ° C에서 사진 촬영을 완료 하기 전에 5 일 보다는 더 이상 저장할 수 없습니다. - A. flavus (그림 3)와 함께 접종 7 일 후에 커널의 사진을 찍을.
- 연 조직 및 이온된 수 커널 깨끗 한 외관. 중심부의 경도 섹션을 수행 하 고 즉시 형광 현미경 사진 촬영.
- 현미경 분석 및 사진에 대 한 각 줄에서 옆으로 4 커널 설정 합니다.
- 커널 분석에 대 한 준비.
- 연 조직 및 이온된 수와 나머지 커널 깨끗 한 외관.
- 1 담당자 15 mL 나사 모자 폴 리 카보 네이트에 구성 장소 4 커널 유리병 포함 2 스테인레스 스틸 볼 즉시 추가 처리 및 분석까지 액체 질소와-80 ° C에 게 튜브를 고정 합니다.
- -80 ° C 냉동 고에서 튜브를 제거 하 고 3 분 1500 rpm에서 균질 화기에 커널 갈기.
참고: 커널에서 액체 질소로 냉동 보관.
4. PCR 검사 유전자 변형 옥수수 커널
- A. flavus 제조업체의 지침에 따라 감염 분쇄 옥수수 커널에서 DNA 분리 kit genomic DNA (gDNA)을 사용 합니다. 간단히, 분쇄 옥수수 알갱이의 10-15 mg 280 µ L 버퍼 F, 20 µ L 효소, 및 3 µ L dithiothreitol (DTT)을 추가 합니다. 품 어 그리고 thermomixer (56 ° C, 1200 rpm, 30 분)에 흔들. 1 분 x 10000 g에서 centrifuge 고 맑은 상쾌한 equilibrated 열 전송. 3 분을 elute gDNA를 1 분 동안 700 x g 에서 원심 분리기 실 온에서 품 어.
- 추출 된 gDNA 20 µ L PCR 반응에서 PCR 키트를 사용 하 여 각 샘플에 대 한 설정의 0.8 µ L를 가져가 라. 제조 업체의 프로토콜에서 권장 thermocycling 조건을 따릅니다. PCR 조건 포함 뒤에 98 ° C 5에서 변성 98 ° C 5 분 (1 단계)에서 초기 변성 단계 s (2 단계), 55 ° C 5에서 어 닐 링 s (3 단계), 신장 20 72 ° C에서 s (4 단계), 4 단계로 2 단계 40 주기 그리고 1 분 (5 단계)를 위한 72 ° C에서 최종 신장 단계.
- 앞으로 뇌관 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3를 사용 하 여 ' 반전 뇌관 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' Lablab AILP 의 존재를 확인 유전자 변형 옥수수 커널에서 유전자.
5. RNA 격리, cDNA 합성 및 반 정량적 RT-PCR
- 받아 무 균 A. flavus 감염 옥수수 커널 이전 RNA 추출-80 ° C에 저장. 하지만 약간의 수정18제조업체의 프로토콜에 따라 총 RNA 격리 키트를 사용 하 여 RNA를 추출 합니다. 추출 버퍼에 무 균된 옥수수 커널 분말의 50 밀리 그램을 추가, 그것은 잘 (vortexing) 없이 1 mL 피펫으로 팁을 사용 하 여 혼합 하 고에 두고 얼음 진행 하기 전에 5-6 분에 대 한 이후 단계 제조 업체의 프로토콜에 설명 된 대로.
- CDNA 제조업체의 프로토콜 18따라 cDNA 합성 키트를 사용 하 여 준비 합니다.
- 반 정량적 RT-PCR에 대 한 PCR 반응 당 undiluted cDNA의 0.5 µ L를 사용 하 여 앞서 설명한18로. 정방향 및 역방향 뇌관 qAILP F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3를 사용 하 여 '와 qAILP-R 5'-CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA-3' 각각 Lablab AILP 유전자 발현을 검출 하 고 전달 하 고 프라이 머 qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ와 qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ 옥수수 ribosomal 구조 유전자 (리브), GRMZM2G02483819 집 유지 유전자로 표현 위한 각각.
6. GFP 정량
- 50 mL를 각각 0.2 M 이수소 나트륨 인산 염 (NaH2포4) 0.2 M 염기 나트륨 인산 염 (Na2HPO4·7H2O) 이온된 H2o.에서에서의 준비
- PH 7.0 소 렌 슨의 인산 염 버퍼의 100 mL을 확인 합니다. PH 7.0, 추가 19.5 mL NaH2포4 주식, 30.5 mL NaHPO4·7H2O 주식, 및 50 mL 이온된 H2o.
- 그리고 25 mg 지상 커널 자료 (신선한 무게, FW) 밖으로 무게 1.0 mL microcentrifuge 튜브에. 원심 분리기 튜브와 30에 대 한 소용돌이에 500 µ L 인산 버퍼를 추가 s.
- 샘플 16000 x g에서 15 분간 원심. 블랙 96 잘 접시에 피펫으로 100 µ L 상쾌한. Fluorometer (여기 485 nm, 방출 528 nm)와 샘플을 읽을.
7. 총 아플 라 톡 신 분석
- 샘플 처리 및 아플 라 톡 신 추출
- 60 ° c.에 2 일 동안 공기 오븐에서 건조 커널 샘플 및 샘플 무게 50 mL 유리 스 토퍼와 삼각 플라스 크에.
- 증기 두건에서 각 플라스 크에 염화 메 틸 렌 25 mL를 추가 합니다.
주의: 염화 메 틸 렌 높은 휘발성 이며 유해 (자극성, 발암 물질)으로 간주 됩니다. 라텍스도 니트 릴 장갑 염화 메 틸 렌 작업에 안전 하다. 사용 하 여 향상 된 유기 용 매 저항 PolyVinylAlcohol 장갑. - 손목 동작 셰이 커에 30 분에 대 한 샘플을 흔들어. 30 분 후에 천천히 붓고 추출 피리 필터 종이 원을 통해 80 mL 비 커. 증기 두건에서 비 커 마른 하룻밤 보자.
- 다음 날, 메 틸 렌 염화 물 (약 5 mL) 내부 주위 물 총 건조 비 커의 테두리, 소용돌이, 2 dram 유리 튜브에 붓는 다. 두고 튜브는 증기 두건에서 하룻밤 건조 하 열.
- 아플 라 톡 신 분석
- 4.0 mL 80% 메탄올을 추가: 이온 H2O (v/v) 튜브.
- 필터링 하는 아플 라 톡 신 추출 키트를 사용 하 여 제공 된 열과 메탄올 솔루션 정화. 제조업체의 지침에 따라 fluorometer와 총 아플 라 톡 신 수준 분석.
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Representative Results
옥수수 변환 및 유전자 변형 식물의 분자 검사
옥수수이 II 라인의 미 성숙한 배아 최종 공장 대상 벡터 CaMV 35S 의 통제 Lablab purpureus AILP 유전자 표현 포함 Agrobacterium tumefaciens EHA101 긴장을 사용 하 여 변형 되었다 발기인입니다. 5 독립적으로 변형 된 옥수수 라인 후속 연구에 대 한 t 6 세대에 전진 되었다. 유전자 변형 옥수수 식물 훨씬 작고 덜 활발 했지만 isogenic 부정적인 제어 식물에 비해 다른 이상이 나타나지 않았다. 대상 AILP 유전자의 PCR 증폭 제어 식물 (그림 4A)에 비해 유전자 변형 옥수수 줄에서 서만 관찰 548 bp amplicon을 보였다. AILP 유전자는 AILP 식이 없는 제어 식물 (그림 4B)에서 관찰 되었다 반면 유전자 변형 라인에 식을 보여주었다.
Aspergillus flavus 잎 분석 결과 포자를 추출
원유 잎 식물 액체 N 및 centrifuging 16000 x g에 의해 준비 되었다 젊은 유전자 변형 옥수수에서 추출 합니다. 초기 단계 출 아 포자는 20 시간 동안 잎 추출 물에 노출 됐다 고 의미 스 포어 hyphal 길이 20 견본에서 기록 되었다. 포자에서 hyphal 길이 부정적인 컨트롤 (그림 5)에 비해 58%-80% 감소를 보여주었다 유전자 변형 잎 추출 물에 노출
Aspergillus flavus 커널 감염 동안 성장
커널 심사 분석 결과 (KSA) 검사 유전자 변형 및 제어 커널에서 A. flavus 의 성장을 위해 수행 되었습니다. 유전자 변형 커널에 AILP 유전자의 표정은 A. flavus 성장을 부정적인 영향을 받습니다. 현재 연구에 사용 된 A. flavus 스트레인 모니터링 수 있는 GFP 기자와 실시간으로 곰 팡이 성장의 정량화에 포함 되어 있습니다. GFP 형광에 있는 뜻깊은 감소 isogenic 부정적인 컨트롤 (그림 6)에 비해 유전자 변형 AILP 커널에 관찰 되었다. AILP 라인 4와 5 보여주었다 뜻깊은 감소 69%와 72%, 곰 팡이 성장에 각각, 다른 라인 뒤 35%-60% 감소 (그림 7A) 제어 커널에 비해 관찰 되었다.
감염 된 커널에 아플 라 톡 신 생산
옥수수에 AILP 유전자의 분리 식 제어 대 유전자 변형 라인에서 아플 라 톡 신 내용의 뜻깊은 감소 귀착되는. 아플 라 톡 신 데이터 제공 여기 감염 된 커널에서 발견 총 아플 라 톡 신 콘텐츠입니다. 아플 라 톡 신 내용에서 62%-88% 감소 (그림 7B) 제어에 비해 AILP 커널에 관찰 되었다. 5 다른 AILP 선 중 4 640 1,498 ng/g 컨트롤 (3,986 ng/g DW) 대 커널에서 DW 사이 다른 라인 뒤 최저 아플 라 톡 신 콘텐츠 (486 ng/g DW), 보였다.
그림 1: 옥수수에 Lablab AILP 유전자의 유전자 변형 식에 대 한 벡터 디자인. 35S = 콜리플라워 모자이크 바이러스 또는 CaMV 제정 발기인; RB = 오른쪽 테두리; LB = 왼쪽된 테두리; nptII = 네오 마이 신 phosphotransferase 대 저항 유전자; nos와 35s 전사 종결자 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 커널 분석 결과 심사. (A, B) 커널 소독 하 고 생물 안전 캐비닛에 메 마른 비 커에 부 어. (C-E) 커널 A. flavus 포자 현 탁 액 접종 (F-H) 소독 집게를 사용 하 여 커널 검정 접시에 놓습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: A. flavus 성장의 현미경 빛. (A) Isogenic 부정 제어입니다. (B-F) 유전자 변형 커널 표현 AILP (라인 1-5) 접종 후 1 주일. 눈금 막대 = 1 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4. 유전자 변형 식물의 분자 심사. 유전자 변형 옥수수 식물 (레인 1-5)의 (A) PCR 확인 포함 하는 Lablab AILP (548 혈압 진단 DNA 조각; C = isogenic 부정적인 제어; 코 2-로그 DNA 사다리 DNA 마커로 사용). Lablab AILP 유전자에서 유전자 변형 옥수수 라인 (레인 1-5)의 (B) 식 RT-PCR를 사용 하 여. 레인 C isogenic 부정적인 컨트롤을 나타냅니다. 옥수수 ribosomal 구조 유전자 (리브),19 집 유지 유전자로 사용 되었다 GRMZM2G024838 (코 2-로그 DNA 사다리: DNA 마커). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5. 원유 잎의 효과 isogenic 부정적인 컨트롤 (neg)에 비해 A. flavus 포자 발 아에 유전자 변형 옥수수 AILP 식물에서 추출. 평균 분리 했다 Dunnett의 posttest ANOVA 후에 수행 됩니다. 뜻깊은 감소의 수준은 별표로 표시 됩니다 (* * *P ≤ 0.0001). 오차 막대 20 샘플에 대 한 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6. 는 A. flavus 스트레인 70-GFP 유전자 변형 커널에서 생물 검정의 1 주 후 AILP을 표현에서 유출 하는 GFP 형광. Isogenic 부정적인 컨트롤 (A) 곰 팡이 감염을 평가 하 고 유전자 변형 커널 (B-F 을 대표 하는 유전자 변형 라인 1-5)에서 사용 되었다. 적어도 4 개의 커널 형광 현미경 아래 각 라인에 대 한 상영 했다. 눈금 막대 = 2 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 는 flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산. (A) A. flavus 70-GFP 감염 및 7 일 후에 커널 심사 분석 결과 옥수수 커널에 성장. 4 생물을 3 개의 독립적인 실험의 평균 각 시간을 복제합니다. GFP 정량화 (상대 형광 단위, RFU)에 isogenic 부정적인 컨트롤에 AILP 을 표현 하는 유전자 변형 옥수수 라인에 곰 팡이 성장을 나타냅니다. 평균 분리 했다 Dunnett의 posttest ANOVA 후에 수행 됩니다. 별표 표시 된 뜻깊은 감소의 수준 (*P ≤ 0.05; * *P ≤ 0.01; * * *P ≤ 0.001). 오차 막대는 4 개의 무작위 생물 복제에 대 한 의미의 표준 오류를 나타냅니다. (B) 7 일 후에 커널 심사 분석 결과 A. flavus 70-GFP 옥수수 커널에 의해 아플 라 톡 신 생산. 12 생물학 복제 및 각 복제의 평균 4 커널 포함. Isogenic 부정적인 제어 (neg)에 비해 유전자 변형 AILP 커널 (1-5 라인에서)에서 아플 라 톡 신 수준. 평균 분리 했다 Dunnett의 posttest ANOVA 후에 수행 됩니다. 별표 표시 된 뜻깊은 감소의 수준 (* *P ≤ 0.01; * * *P ≤ 0.001). 오차 막대는 4 개의 무작위 생물 복제에 대 한 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 곰 팡이 억제로 인해 편견 없는 패널 B 의 데이터를 보려면 추가 그림을 참조 하십시오. GFP 사이의 상관 관계를 닫습니다 RFU 및 아플 라 톡 신 = 값도 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
7 일 후에 커널 심사 분석 결과 곰 팡이 성장 억제 때문에 바이어스를 제거 하기 위해 A. flavus 70-GFP 옥수수 커널에 의해 아플 라 톡 신 생산을 보여 다시 그려야 하는 그림 7B에서 추가 그림 1: 데이터입니다. 값이 아플 라 톡 신 곰 팡이 성장 억제 그림 7B에 GFP RFU 값으로 표현 하 여 분할 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 2: GFP RFU 값 (= 곰 팡이 성장)과 아플 라 톡 신 레벨 사이의 상관 관계를 닫습니다 (r2 = 0.86)는 KSA에 보고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
병원 균과 해충 농업 작물에서 수확량 손실 글로벌 문제20이다. 현재, 합성 살 균 제와 살충제의 응용 프로그램 제어 식물 병원 균과 해충에 대 한 주된 수단 이지만 이러한 바이오 식품 및 사료의 잔류 독성21인간과 동물 건강 심각한 위협을 제기할 수 있다. 식품 및 사료 작물 옥수수의 경제 중요성, 고려에 감소 또는 아플 라 톡 신 오염 제거 가장 중요2,,322입니다. 취약 품종으로 내성 유전자 introgression 통해 기존의 사육은 시간이 걸리는 프로세스와 같은 저항 아니다 항상 안정 된 아플 라 톡 신 저항 이다 polygenic 특색 및 참여 유전자의 표현을 크게 다 함께 환경 매개 변수4의 변화. 대체 방법은 증가 및 호스트 식물 방어 A. flavus 인증제 방식으로 안정화 평가 되 고 있다.
현재 연구에서 우리는 A. flavus에 대 한 옥수수에 히 아 신 스 콩에서 AILP 유전자의 효능을 평가 하기로 결정 했다. AILP α-아 밀라 아 제의 경쟁적인 억제 물 하 고도 항진균 속성을 소유한 다, 우리는 강력한 제정 발기인 CaMV 35S아래이 유전자 표현. 목표는 개발 단계 또는 조직의 종류에 관계 없이 옥수수에이 분리 단백질의 생산을 증가 했다. 유전자 변형 옥수수 라인 (그림 4AB)에서 α-아 밀라 제 유전자의 중요 한 표현 분리 시스템의 안정적인 표현의이 유전자를 지원합니다. 이 부정적인 감염된 AILP 커널 내부 GFP 형광의 공간 배급의 감소와 전반적인 GFP 형광 (그림 6 및 그림 7A) 커널에 있는 감소에서 분명 곰 팡이 성장을 영향을.
커널 심사 분석 결과 (KSA)의 개발 활용 유전자 조작 A. flavus 기자 스트레인 Aequorea 빅토리아18, 해파리에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 인코딩 유전자 표현 23. 어떤 병원 체에 대 한 제어 전략을 고안, 그것은 감염, 확산 및 호스트 식물 또는 조직 내에서 식민지의 모드를 이해 하는 데 필요한. 식민과 aflatoxigenic saprophyte의 확산, A. flavus 는 잘 이해 하기 때문에 저항 하는 병원 체의 유전 규칙 경우, 잘 이해 되지. GFP 표현 A. flavus 긴장의 사용 감염 프로세스와 식민지 실시간으로 추적할 수 있습니다. GFP 긴장과 야생-타입 않았다 하지 다 크게 병원 체 적극성과 아플 라 톡 신 생산23에. 그러나,이 특정 긴장에 GFP 유전자 constitutively 표현된 glyceraldehyde 인산 효소 (gpdA) 유전자 발기인 24 는 곰 팡이 성장을 추적 더 쉽다 통제 배치 됩니다. 그러나, 면 화씨, 옥수수 커널에이 얼룩을 사용 하 여, 우리가 나타났습니다 GFP 형광 곰 팡이에서 집중적으로 곰 팡이 성장과 아플 라 톡 신 레벨18,23사이의 긴밀 한 관계.
아플 라 톡 신을 생산 하는 능력으로 가까운 상관 관계를 설정, gfp omtA ver-125,26 등 아플 라 톡 신 유전자 발기인에 의해 구동 gpd대답 보다 더 적합 한 것 GFP 형광 탐지 및 곰 팡이 성장에도 작은 변화를 실시간으로 측정 가능 하도록 충분히 민감한은 모두 체 외 및 planta에서, 그리고 알 수 없는 항진균 단백질 및 펩 티 드의 금지 활동의 평가 AILP 등11,17,,1823. 또한, 결과 KSA에서 아플 라 톡 신 오염27에 대 한 평가 관하여 저항 또는 취약 옥수수 라인의 필드 성능와 잘 상관 한다.
KSA 화면 고전적인 자란 새로운 종류4 및 유전자 변형 라인11,18우리의 실험실에 매우 유용 하다. 설정 하 고 모든 실험실에서 KSA를 수행 하는 것이 쉽습니다. 하나를 사용 하 여 손상 되지 않은 깨끗 한 커널 호스트 식물 곰 팡이 상호 작용에 대 한 명확한 이해를 계산 될 수 있도록이 분석 결과 수행 해야 합니다. 우리는 일상적으로 우리가 분석 결과 수행 하기 전에 stereomicroscope 아래 우리의 실험실에서 사용 하는 모든 커널 검사. 우리는 KSA에 대 한 고용 조건 높은 습도 (95 %RH) 등 일정 온도 (31 ° C)는 주목 한다. 이러한 조건 하에서 시뮬레이션 된 발 아 과정의 개시, 분석 결과 테스트 씨 외 투의 무결성, 발 아, 동안 및 곰 팡이 켜져 항진균 유전자/단백질을 포함 하 여 커널의 유전 메이크업에 이상적인 조건을 제공 한다 감염입니다. 곰 팡이 감염, 아플 라 톡 신 생산 분야;에서 그들의 발생에 비해 KSA에서 항상 높을 것합니다 그러나, 가까운 상관 관계 설립된4,27되었습니다.
우리 AILP 옥수수 커널에 곰 팡이 성장을 감소이 KSA에서 증명 하고있다. AILP 식물 lectins의 항진균 속성을 소유 하 고 전 분 분해를 감소 하 고 곰 팡이 성장을 제한 α-아 밀라 아 제를 억제 하기 위해 표시 되었습니다. 연구 결과 AILP A. flavus 억제 가능 했다 설명 했다 생체 외에서 설탕이 풍부한 감자 포도 당 국물 (PDB) 인공 성장 매체, 그것의 항진균/성장 저해 행위를 나타내는 성장이 했다 그것의 아 밀라 제 저해의 독립 활동13. 다른 식물 lectins Hevea brasiliensis (고무 나무), 그리고 푸른 풀밭 tuberosum (감자) tubers 또한 비슷한 항진균 속성 표시 Urtica dioica (일반적인 쐐기 풀)에서 고립 되 고 Botrytis cinerea 의 성장을 저해 Pyrenophora tritici및 Fusarium oxysporum28,29,,3031. 알파 아 밀라 제 저 해제는 균 류 및 박테리아에 대 한 효과 뿐만 아니라 그러나 또한 해충32에 대하여 효과적 이기 위하여 보였다. 알파 amylases 정상적인 성장과 식물 먹이 곤충의 개발에 대 한 중요 한 보고는 및 여러 곤충 α-아 밀라 아 제 억제제 밀, 일반 콩, 옥수수12,33, 등 식물에서 고립 되어 있다 34,35. 곰 팡이 포자 원유 잎 추출 물 (그림 5), AILP 표현 옥수수에 곰 팡이 성장에 있는 감소에 노출 hyphal 길이 상당한 감소 커널 같이 GFP 형광의 감소에 의해 질적 ( 그림 6) 양적 (그림 7A) 인 α-아 밀라 제 저해 및 항진균 속성의 조합. 다른 병원 균에 대 한 이러한 AILP을 표현 하는 옥수수를 사용 하 여 실험 식물 그리고 해충 미래에 큰 관심 종자와 식물 조직의 다양 한 생물 스트레스에 대 한 효능을 테스트 됩니다. Lectin의 항진균 및 성장 억제 속성 그것의 cross-linking 틴 및 hyphal 끝 확장28의 억제에 주로 기인 했다. 사실, 다양 한 곰 팡이 및 세균 유래에서 α-amylases의 생체 외에서 AILP 중재 저해 했다 65% 이상 A. flavus, Magnaporthe grisea, Helminthosporium victoriae, 41 등 곰 팡이 병원 균에 억제 세균성 병원 체 새 균의 subtilis13에서 % 억제. 여기에 제시 된 A. flavus 성장의 감소에 있는 결과 항진균 성 대리인으로 α-아 밀라 아 제 억제제의 역할에 맞춰 있습니다. 현재 연구는 더 이전 체 외 연구에서 얻은 유용한 정보의 실용적인 응용 프로그램을 보여 줍니다.
AILP에서 아플 라 톡 신 내용 (그림 7B)에서 감소-옥수수 라인을 표현 가능 하 게 저장 된 전 분의 저하 분석 선도 A. flavus α-아 밀라 제 활동의 저해 때문 이며 수집으로 설탕의 감소는 병원 성 상호 작용 하는 동안 옥수수 커널에서 에너지 소스. 로 곰 팡이 α-아 밀라 제 커널 녹말을 무 너 뜨에 중요 한 역할을, 가능성이 AILP에 의해 곰 팡이 α-아 밀라 제 활동에 어떤 변화는 커널 감염 동안 녹는 설탕 콘텐츠를 변경 합니다. 녹는 설탕, 자당과 포도 당, 특히의 콘텐츠 높은 AFB1 과 총 aflatoxins 옥수수와 땅콩36,37등 다른 A. flavus 취약 작물의 생산 증가 상관 되었습니다. A. flavus 아플 라 톡 신 생산38증가 인공 성장 매체에 자당 콘텐츠 증가 합니다. 다른 녹는 설탕 포도 당, 맥 아당 등도 긍정적인 인공 미디어와 씨앗 기판38에서 아플 라 톡 신 생산에 기여 한다. Α-아 밀라 제 활동 및 다른 버섯에서 mycotoxin 생산에서 감소의 저해 커널 감염 시 독 소 생산에 곰 팡이 α-amylases의 중요 한 역할을 강화 한다. F. verticillioides 와 A. flavus fumonisin B1 및 aflatoxins 각각 다음 옥수수 커널9,10의 감염을 생산 하지 못했습니다의 알파-아 밀라 제 녹아웃 돌연변이. 마찬가지로, 다운 레 귤 레이 션의 A. flavus α-아 밀라 제는 크게 옥수수 커널 감염11동안 곰 팡이 성장 및 아플 라 톡 신 생산 감소. 유전자 변형 라인에서 아플 라 톡 신에 62%-88% 감소는 아플 라 톡 신 생산에 α-아 밀라 아 제의 역할에 더 이른 보고에 따라. 그것 생체 외에서 커널 심사 분석 결과 (KSA)는 자연 조건 하에서 일반적으로 발견 보다 더 엄격한 하는 것을 주의 될 것 이다. 생체 외에서 시험 하는 동안 조건 되므로 또한 매우 아플 라 톡 신 생산에 대 한 대조 유전자 변형 라인에서 아플 라 톡 신 내용에서 백분율 변화 감염 커널에서 아플 라 톡 신 콘텐츠의 완전 한 숫자 보다 더 의미 있는 수 있습니다. 여기에 제시 된 결과 유망 하 고 필드 조건 하에서 미래 실험은이 AILP의 가능성을 검사 하는 것이 중요-자연 시나리오에서 아플 라 톡 신 저항에 대 한 옥수수 라인을 표현.
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Disclosures
저자는 전혀 충돌의 관심이 없다.
Acknowledgments
우리는 데이비드 Meints, 알칸사 스의 대학 초기 세대 중 유전자 변형 옥수수를 분석에 그의 원조에 대 한 감사 합니다. 이 작품 미국 농 무부-ARS 크리스틴 프로젝트 6054-42000-025-00D의 재정 지원을 받았다. 상호 또는이 문서에서 상용 제품의 언급만을 목적으로 특정 정보를 제공 하 고 미국 농 무부에 의해 승인 또는 추천을 의미 하지는 않습니다. 미국 농 무부-ARS의 동등한 고용 기회 (EEO) 정책 모든 사람을 위한 기회 균등을 명령 하 고 기관의 인사 정책, 관행 및 작업의 모든 측면에서 차별 금지.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Caisson | ||
| Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
| C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
| Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
| Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
| Ethanol | |||
| FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
| Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
| Force Air Oven | VWR | ||
| FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
| Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
| Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves | Ansell | 012-15-554 | |
| Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| liquid Nitrogen | |||
| Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
| Methanol | |||
| Methylene Chloride | |||
| Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
| Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
| Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
| Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
| Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
| Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
| Potato Dextrose Broth | |||
| Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
| Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
| Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
| Stir Plate | |||
| Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| V8 juice | Campbell's | ||
| Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |
References
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