Summary
反復可能なパターン形成を取得する 3 D 細胞外マトリックスの初期細胞クラスター形状を制御するための手順を紹介します。組織パターン形成のための多方向の画像を達成するために 2 つの異なるゲルを含む立方デバイスを採用します。
Abstract
3 D 培養の重要性は、細胞培養でかなり強調されます。ただし、実験の再現性の欠如は、その制限の 1 つです。自己組織化メカニズムの解析を低下パターン形成のいくつかの反復可能な結果を生成します。セル密度と細胞外マトリックス (ECM) の分布などの初期培養条件の変化を減らすことは、3次元培養の再現性を強化することが重要です。この記事では、再現性の高いパターン形成を取得する 3 D 細胞外マトリックスの初期細胞クラスター形状を制御するためのシンプルだが強力な手順を示しています。所望の形状とマイクロモールドは、フォトリソグラフィ法や加工法を使用して作製した、ハイブリッド ゲル キューブ (HGC) に含まれる ECM で 3 D ポケットが形成されました。高濃度細胞は、細胞クラスター形状試作金型の形状と一致するよう、ポケットに注入されました。採用の HGC 許可でも、低倍率のレンズを使用した高解像度イメージングと全体の組織構造のキャプチャを有効にその回転走査型多方向。正常ひと気管支上皮細胞は、方法論を示すため使用されました。
Introduction
二次元文化よりもよりよい生物的環境を模倣する 3 D 文化の重要性は、細胞・組織培養1,2,3でかなり強調されます。細胞と細胞外マトリックス (ECM) との間の相互作用は、形態形成4,5について重要な手がかりを提供します。多くの組織の形成は、折りたたみプロセス6、7、陥入8、管状形成9,10などの 3 D 環境の下でだけ現れることができます。ただし、多くの困難は、皿の上実験 2 D から 3 D の実験へと移行研究者を防ぐ。3 D の実験で主な困難の 1 つは、画像の 3 D サンプルの問題です。平面実験と比較して、適切な 3 D 画像の取得はまだ多くの場合困難です。特に、サンプル サイズ低倍率レンズの大きな焦点深度によりミリ波領域に達すると困難な作業は、適切な 3 D 画像を得るします。たとえば、焦点深度は、倍率 × 10 を使用すると、単一のセルのサイズが通常よりも少ない 10 μ m 以上 50 μ m を達する。画像品質を高めるためには、ハイテク顕微鏡システムが開発されている (例えば、2 光子励起顕微鏡11と光シート顕微鏡システム12)、彼らはその高価な価格により限られてが。代わりに、我々 はこれまでハイブリッド ゲル キューブ (HGC) デバイス13をした.デバイスは、ゲルの 2 種類で構成されています: サポート ゲル、コラーゲンなど ECM または文化ゲルとしてマトリゲル agarose。HGC 培養中にサンプルを収集し、アドレスを焦点深度の問題14多方向画像を達成するためにキューブを回転させることができます。
3 D の実験のもう一つの難しさは、3 D 環境の悪い制御により、低再現性です。プラスチックの皿に平面文化とは異なり、初期培養条件の変化は簡単に柔らかい素材で囲まれた 3 D 空間で発生します。実験結果では有意な変化は、次の分析を劣化し、基になるメカニズムをマスクします。空間的バイオプリンティング15,16、17、および足場18、織物繊維などの単一のセルを配置する多くの工学技術が開発されているが、複雑な前処理が必要か具体的には設計された機器。対照的に、HGC19の 3 D セルの配置を達成するための方法論を開発しました。
このプロトコルでは、一般的に使用される装備、HGC の 3 D の初期細胞クラスターの形を制御するための簡単な手順を示します。まず、HGC の作製プロセスを示した。その後、フォトリソグラフィ法や加工法により作製した micromolds は、ECM の任意形状のポケットを生成する HGC に置かれました。その後、遠心分離後の高密度の細胞は、HGC の初期細胞クラスター形状を制御するポケットに注入しました。正確に制御された細胞のクラスターは、HGC のため多くの方向から描出できた。正常ひと気管支上皮 (NHBE) 細胞は、画像品質を高めるための複数方向から初期細胞クラスター形状の制御と枝の画像を示すため使用されました。
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Protocol
1. ハイブリッド ゲル キューブ デバイスの作製
- ポリカーボネート (PC) 立方体フレーム加工や 3 D プリンターを使用していずれかを準備します。PC フレームのサイズは、サンプル サイズに依存します。本研究では、枝が培養中に延長する十分なスペースを持っていたようにそれぞれの側に 5 mm のフレームを使用しました。
- 予冷のガラス スライドまたはアイス ボックスで別の滑らかな表面に PC フレームを配置 (< 0 の ° C) (図 1 a)。
- ピペットと底面に四角い枠の上面から事前に加熱された 1.5% の agarose (w/v) の 12 μ L を追加します。Agarose 広がる平らな面 (図 1 b) を作成するのには、ピペットをストロークします。
- 分以内に、agarose が治ります。ピンセットを使用してスライド ガラスの端にスライドさせて、PC フレームをピックアップします。Agarose とガラス スライド (図 1) との間の付着力により立方体のフレームから寒天を取り外すときに垂直方向にスライド ガラスからフレームを拾う可能性があることに注意してください。
- 開いて顔を作る、その後再びガラス スライド (図 1) の立方体フレームを回転させます。
- 手順 1.3-1.5 を繰り返して 3 つのサーフェスは、アガロース (図 1E) で満ちています。
- 4 番目と 5 番目の顔に agarose 壁を形成するには、オープンフェイス (図 1 階) から agarose をドロップします。5 の顔作成されたアガロース壁は、HGC の準備は完了です。
2. フォトリソグラフィ法や加工法による micromolds の作製
- フォトリソグラフィによる作製
- きれいなアセトン、イソプロピル アルコール (IPA) と超音波洗浄によるシリコンウェハ (Si) では、その 5 分 (DI) が、蒸留水。窒素窒素 Si ウエハを吹いて後、20 分 (図 2 a(i)) の 140 ° C のオーブンで脱水します。
- ロアやアリゾナ州など犠牲層 Si 基板上レジスト スピン コート (2,000 rpm, 30 s) 黄色の光の下でスピンコーターを使用しています。スピン コーティング後すぐに 3 分 (図 2 a(ii)) 90 ° C のホット プレートにウェハを加熱します。犠牲層の所望の厚さ、リフトオフ プロセスは簡単に実施することができますが、正確な厚みは必要ありません、以上 1 μ m であります。
- 70 ° C のホット プレートにウェハを置き、ハンド ローラー (図 2 a(iii)) を使用して犠牲層を所望の厚さの厚いネガ型フォトレジスト シートを積層
- ラミネート後の 5 分は、紫外線暴露のマスクアにウェハを配置します。シート抵抗の所望のパターンとフォトマスクを設定し、適切な時間のために紫外光を用いた公開します。露光時間はレジストの厚さと紫外線の強度によって決定されます。その後、60 ° C、5 分、10 分 (図 2 a(iv)) 90 ° C で焼成の順で露光後ベーク用ホット プレート上のウェハを配置します。
- 非公開エリア (約 20 分) を完全に溶解するまで、プロピレングリコールモノメチル エーテル アセテート (PGMEA) 内のウェハを浸すことによってネガ型フォトレジストを開発 (図 2 a(v))。
- 超音波洗浄の微細構造から持ち上げて IPA を使用して犠牲層を溶解します。ウェハから微細構造を剥がして、一度 10 分 (図 2 a(vi)) には超音波洗浄で DI 水ですすぎます。
- 30 分間室温 (約 20 ° C) に完全に乾くの MPC ポリマーの 30 μ L で金型を浸します。図 2 bは、製作されたプリズム金型を示しています。
- 円筒金型の作製
- 加工プロセスによって希望のサイズと鋼製円筒金型を作製します。また、市販のステンレス鋼を使用します。(本研究では、φ 600 μ m シリンダーは使用される)。
- 30 分間室温 (約 20 ° C) に完全に乾くの MPC ポリマーの 30 μ L のシリンダー鋼を浸します。
- ベース樹脂とその触媒を混合することによって液体ポリジメチルシロキサン (PDMS) を準備 (材料表参照) 後 20 分間システムを脱気真空脱ガスに 10:1 の比率で。その後、12 ウェル プレートで、PDMS を注ぐ。
- 鋼製円筒データム平面に垂直になるようにとセット固定線形 z 段 z ステージを移動することによって同じデータム サーフェス上に配置 12 ウェル プレートで未硬化の PDMS 表面に垂直に挿入できます。硬化のための 90 ° C で 20 分間オーブンでシリンダー鋼を PDMS を孵化させなさい。次のプロセス (図 2) で、ピペットを挿入できるように、側面サーフェスを形成する PDMS をカットします。
3. ハイドロゲルの初期細胞クラスター形状の制御
- 文化の領域 (図 3 a) に HGC にコラーゲンと人工基底膜など、必要な細胞培養のための適切な ECM を挿入します。
- 設定捏造マイクロモールド HGC の直接または間接的適切なホルダー付き図 3Bに示すように。その後、それを硬化の 37 ° C で 25 分の CO2インキュベーターに HGC を配置します。
- ECM (図 3) を劣化しないように、慎重に、マイクロモールドを取り出します。ポケットの ECM ので必要な金型形状としてが作製されます。
- トリプシン-EDTA や細胞の種類によって等価で培養皿から細胞を採取します。その後、高濃度の細胞を取得する細胞を遠心分離機 (NHBE 文化の 0.25% トリプシン-EDTA を適用 3 分のセルをインキュベートし、FBS を含む中、4 分の 300 × gで遠心分離の効果を中和するため)。
- 遠心分離後、細胞を凝縮して上清培地を取り除き、高濃度細胞 (3.0 × 104細胞/μ L NHBE 細胞) を注入 (図 3 D) の ECM のポケット。
- セルは、micromolds によって作成されたスペースを埋めるための ECM ポケットに落ちるように、37 ° C で 20 分のための CO2インキュベーター内のセルに HGC を孵化させなさい。過剰な媒体または細胞が表面に存在する場合は、ピペットを使用して慎重に取り外します。
- 24 ウェル プレートに HGC を配置し、適切な媒体 (図 3E) の 100 μ L を追加します。NHBE 細胞 NHBE と血管内皮細胞 (材料の表を参照) を市販の専門媒体の 1:1 の混合物を使用します。
- ECM でポケットを閉じるし、25 分の 37 ° C で、孵化させなさい他の ECM を注入します。
- 室温 (約 20 ° C) に予熱した 1.5% の agarose を冷やします。ECM が養殖とイメージング (図 3 f) の間に HGC から落下するを防止し表面を閉じて HGC の上面に agarose の約 10 μ L をドロップします。その後、37 ° C で別の 20 分間 agarose を治すための HGC を孵化させなさい。
- 浸透圧は、HGC の中の細胞に栄養を提供することで助けることができるので、全体の HGC をカバーする媒体を追加します。
4. 多方向画像
- 多方向観察による非侵襲的 3次元形状認識
- 培養皿または顕微鏡の HGC を含むウェル プレートを配置し、カメラのフレームに HGC を方向づけます。その後、明るいフィールドまたは位相コントラストによるサンプル画像を取得します。
- ピックアップし、別の面を下に置くに HGC を回転させます。
- 4.1.1 と 4.1.2 の手順を繰り返して、すべての六つの側面からの画像が得られます。
- 多方向観察による免疫蛍光イメージング
- 固定のため PBS の 10 分間のリンス 2 つ続いて、20 分間のサンプルに HGC 室温 (約 20 ° C) の上の 4% パラホルムアルデヒドを適用しています。
- PBS の HGC を permeabilize 0.5% を含む 4 ° C で 10 分間のトリトン X-100 PBS で 10 分の 3 x を洗います。
- 場合バッファーで 10% ヤギ血清 HGC を孵化させなさい (0.2% トリトン X-100、0.1% ウシ血清アルブミン、0.05 %pbs でトゥイーン 20) 主なブロッキングのため室温で 60 分。
- 特定の分子の染色、適切な抗体を使用します。集合的なセル形状を観察するには、Alexa Fluor 488 ファロイジンをアクチンを染色する使用できます。
- レーザーや蛍光顕微鏡でガラス底皿の上 HGC を置き、サンプル全体の画像を得るための六つの側からスキャンを実行します。
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Representative Results
正常ひと気管支上皮 (NHBE) 細胞は、図解の方法論を示し、円筒形と ECM 環境でそれぞれのプリズム形状を達成するために初期集団細胞ジオメトリをコントロールに使用されました。ファロイジン染色シリンダー形状 (図 4 a, B) とプリズムの形状 (図 4、D) のと同様、段階の対照によって多方向撮像結果が掲載されています。セルは適当に ECM 環境で必要な 3次元形状を生成するために配置されます。その後、細胞は特定の形状を形成する 4 日間の培養し、多方向のイメージングを行った.大規模なサンプル サイズはそれに非常に困難 1 つの方向から全体の組織のイメージをキャプチャするにはただし、HGC は、全体組織形状を明らかに最大六つの側面からのイメージ投射を可能しました。NHBE 細胞から成長した気管支樹の染色結果を図 5に示します。NHBE 細胞は、HGC の円筒形状に制御された最初。その後、枝のほとんどは円筒の軸に対して垂直に監督だった。
図 1: ハイブリッド ゲル キューブ デバイスの作製プロセス。(A) ポリカーボネート立方フレーム冷却アイス ボックスに設定します。(B) Agarose (1.5%)底面をカバーするために注入されます。(C) キューブを収集する滑り落ちた(D) キューブを回転してダウン別の表面を作る。(E) Agarose (1.5%)別の agarose の壁を形成するために注入されます。(F) agarose agarose 壁を 3 つの面の製作、オープンフェイス注入しました。スケール バー: 5 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: micromolds の作製プロセス。(A) 製作によるマイクロモールドのプロセス。(B) 写真平版によって作製したプリズム形状マイクロモールドの完全なフォーム。(C) シリンダー鋼マイクロモールド作製します。スケール バー: 2 mm、(C) (B) 10 mmこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 3: クラスター制御は初期細胞の作製プロセス。HGC が注入される (A) ECM (コラーゲンとマトリゲルなど)。(B)、マイクロモールドは、立方体のフレーム ホルダーの有無で設定されます。(C) 後、ECM の硬化、マイクロモールドは削除されます。(D) 遠心、高密度セルを注入して培養後。(E) 媒体が適用されます。(F) 追加 ECM アガロースに続いては、HGC の上面をカバーする注入されます。スケール バー: 5 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: NHBE 細胞の初期細胞の結果を制御します。(A) 下部と水平面は、円筒制御 NHBE 細胞の位相差像。全体の形状は、蛍光イメージングを必要とせず、多方向観察による認識でした。(B) F アクチン染色円筒制御 NHBE 細胞の蛍光画像。(C)、NHBE の位相差像セル底・外側面からキャプチャされた三角プリズムの形状を制御します。(D) 三角形のプリズム形状の制御 NHBE 細胞の蛍光画像。スケール バー: 100 μ m. 10 倍レンズ (開口数 0.3) で使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 多方向スキャン蛍光画像を投影します。NHBE 細胞最初円筒形状を生成する制御, HGC で 4 日間培養.その後、アクチンはファロイジンによって汚されました。枝は、x 軸に沿って初期のシリンダーから伸長され、軸からの角度、サイズ、長さを均等にしました。下の右の画像は、 x ・ y ・ z軸と試料形状の模式図を示しています。スケール バー: 100 μ m。倍率 (0.3 開口数) × 10 が使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本稿で紹介した方法は簡単、ハイテク機器なく実行できます。同時に、ハイドロゲルの 3 D 空間で正確なセル クラスター形状制御結果が得られます。最初のコントロールの後、皿に培養すると、同じくらい、HGC の細胞が伸長できます。多方向の画像が、顕微鏡を用いた HGC とサンプルを回転させることにより実行され、画像の品質が向上します。彼らは生体適合性がある限り、HGC フレームとマイクロモールド用材料の選択は柔軟です。3 D プリンターは、3 D プリンターの精度が彼らのアプリケーションのために十分である場合、HGC フレームやマイクロモールドを生成する使用ことがあります。提案手法は透明性試薬20,21光シート顕微鏡システムなどの技術を向上させる多くのイメージと互換性が。これらの技術を採用し、画像の品質を向上できます。
アガロース、ECM、および高密度細胞に注入する量は、HGC と金型のサイズによって異なります。空気の泡を注入しない慎重な手動操作が必要で、はじける泡が制御、細胞の成長および画像品質の精度を悪化させる以外の場合。
Micromolds の製造プロセスは、コントロールに所望の形状によって決定されます。フォトリソグラフィによりマイクロメートルの順序のプリズムの形状など、ある特定の深さと正確な 2次元形状の作製ただし、円柱などの 3 D 形状と効果的です。加工は、3 D 形状を作製する私たちをことができますが、一般に、寸法精度はフォトリソグラフィより低い。後、micromolds の作製、金型に 2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン ホスホリルコリン (MPC) ポリマーのコーティングは ECM の付着を防ぐために必要です。
HGC の利点を生かして、複数の方向にレーザ露光なし顕微鏡画像を実行できます。3 D サンプル形状は、蛍光標識; なし多方向観察による約認識できます。このメソッドでは、観測中に任意細胞侵襲性は発生しません。対照的に、蛍光イメージングより正確な 3 D サンプル形状と分子式を取得するため必要です。
初期セル コントロールの提示法の制約は、それが複雑な 3 D 形状と金型に適用することはできませんです。金型に ECM を劣化させることがなくピックアップして削除します。したがって、金型は、単純な直線またはテーパー形状に制限されます。さらにより複雑な形状の制御を得るためには、プロトコルの開発が必要です。
提案された方法論の幅広い用途があり研究室環境のほとんどで簡単に実施することができます。この簡単な手順は、3次元培養、イメージング、および再現性の限界を克服するし、三次元培養に必要なさらなる発展に貢献できます。
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Disclosures
著者、大阪府立大学、九州工業大学はハイブリッド ゲル キューブ デバイス、日本医療や化学計測器 (株) の特許出願を提出した、日本は最近、キューブを製品化しました。当社は、デザイン、プロセス、および説明する方法のいずれかを影響しませんでした。
Acknowledgments
この作品は、日本学術振興会科研費 (18 H 04765) とテニュア ・ トラック制度の普及、文部科学省、日本プログラムによって支えられた財政的に。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
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