Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Første 3D celle klynge kontroll i en Hybrid Gel kube enhet for repeterbare mønster formasjoner

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/59214
Automatic Translation
1, 2, 3
1NanoSquare Research Institute, Osaka Prefecture University, 2Department of Bioscience and Informatics, Osaka Prefecture University, 3Department of Biological Functions Engineering, Kyushu Institute of Technology

Summary

Vi presenterer en prosedyre for å kontrollere den første celle klynge figuren i en 3D ekstracellulær matrix å få en repeterbar mønster formasjon. En kubikk enhet som inneholder to forskjellige hydrogels er ansatt å oppnå flere retninger bildebehandling for vev mønster formasjonen.

Abstract

Betydningen av i vitro 3D kulturer er betydelig vektlagt i cellen/vev kultur. Mangel på eksperimentell repeterbarhet er imidlertid en av sine begrensninger. Noen repeterbare resultater av mønster formasjon forverres analyse av mekanismene bak selv-organisering. Redusere variasjonen i første oppdrettsforholdene, som cellen tetthet og distribusjon i den ekstracellulære matrisen (EFM), er avgjørende for å forbedre repeatability av en 3D kultur. I denne artikkelen viser vi en enkel men robust prosedyre for å kontrollere den første celle klynge figuren i en 3D ekstracellulær matrix å få svært repeterbare mønster formasjoner. En micromold med en ønsket form ble fabrikkert med klima og jordsmonn eller en maskinering prosess, og det dannet en 3D lomme i ECM i en hybrid gel kube (HGC). Høykonsentrert celler ble deretter injisert i lommen slik at celle klynge figuren fabrikkerte mold figuren. Den ansatt HGC tillatt multi-directional skanning av roteringen, som aktivert høyoppløselig bildebehandling og erobringen av hele vev strukturen selv om en lav forstørrelse objektiv ble brukt. Normal menneskelig bronkial epitelceller ble brukt til å demonstrere metodikken.

Introduction

Betydningen av en 3D kultur, som bedre etterligner biologiske miljøer enn en 2D kultur, er betydelig vektlagt i cellen/vev kultur1,2,3. Samspillet mellom cellene og ekstracellulær matrix (EFM) gir viktig signaler om morphogenesis4,5. Mange vev formasjoner kan dukke opp under 3D-miljøer, som folding prosessen6,7, invagination8og rørformede formasjon9,10. Tallrike vanskelighetene forhindrer imidlertid forskere skifter til 3D eksperimenter fra 2D eksperimenter på et fat. En av de store vanskelighetene 3D eksperimenter er spørsmålet om tenkelig 3D prøver. Sammenlignet med planar eksperimenter, er oppkjøp av aktuelle 3D-bilder fortsatt utfordrende i mange tilfeller. Spesielt er å få en passende 3D image en vanskelig oppgave når utvalgsstørrelsen når millimeter området på grunn av den store fokal dybden av lav-forstørrelse linser. For eksempel når fokal dybde mer enn 50 µm når en 10 x forstørrelse linsen brukes mens den enkelt cellen er vanligvis mindre enn 10 µm. For å forbedre bildebehandling, høyteknologiske mikroskopi systemer blir utviklet (f.eks to-fotonet mikroskopi11 og lyset arks mikroskopi systemet12), men deres tilgjengelighet er begrenset på grunn av deres dyr pris. Som et alternativ, har vi tidligere utviklet en hybrid gel kuben (HGC) enheten13. Enheten består av to typer hydrogels: agarose som en støtte gel og en ECM som kollagen eller Matrigel som en kultur gel. HGC tillater oss å samle prøven under dyrking og rotere kuben for å oppnå flere retninger bildebehandling, hvilke adresser focal dybde problemet14.

En annen vanskelighet 3D eksperimenter er deres lave repeterbarhet på grunn av det dårlige controllability av 3D-miljøer. I motsetning til en plan kultur på en plast rett oppstår variasjoner i de første oppdrettsforholdene lett i et 3D-rom omgitt av et mykt materiale. En betydelig variasjon i de eksperimentelle resultatene forverres følgende analyse og masker de underliggende mekanismene. Mange tekniske teknologier er utviklet for å justere romlig enkelt celler, for eksempel bioprinting15,16, fiber veving17, og stillas18, men de krever kompleks forbehandling eller spesielt designet utstyr. I kontrast, har vi utviklet en metode for å oppnå 3D cellejustering i en HGC19.

I denne protokollen illustrert vi en enkel prosedyre med brukte utstyr kontrollerer 3D første celle klynge formen i en HGC. Først ble fabrikasjon prosessen med HGC demonstrert. Deretter ble micromolds fabrikkert av klima og jordsmonn eller en maskinering prosess plassert i HGC å produsere en lomme med en vilkårlig figur i en ECM. Deretter ble svært tette celler etter sentrifugering injisert i lommen kontrollere første celle klynge figuren i HGC. Nøyaktig regulert celle klyngen kan avbildes fra mange retninger på grunn av HGC. Normal menneskelig bronkial (NHBE) epitelceller ble brukt til å demonstrere kontroll av den første celle klynge figuren og bildebehandling grenene fra flere retninger for forbedring av tenkelig kvaliteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabrikasjon av hybrid gel kube enhet

  1. Forberede en polykarbonat (PC) kubikk ramme ved å bruke en maskinering prosess eller en 3D-skriver. Størrelsen på PC rammen avhenger av utvalgsstørrelsen. I denne studien brukte vi en ramme av 5 mm på hver side slik at greinene hadde nok plass til å forlenge under dyrking.
  2. Plasser PC rammen på et pre-avkjølt glass lysbilde eller en annen myk overflate i en isen boksen (< 0 ° C) (figur 1A).
  3. Legge til 12 µL av forvarmet 1,5% agarose (w/v) fra oversiden av kubikk rammen til bunnen med en pipette. Stryke pipette slik at agarose sprer seg for å opprette en flat overflate (figur 1B).
  4. Innen minutter, vil på agarose bli kurert. Plukke opp PC rammen ved å skyve det til kanten av glasset lysbildet ved hjelp av pinsett. Merk at loddrett plukke opp rammen fra av objektglass kan resultere i frakobling av agarose fra kubikk rammen på grunn av den selvklebende kraften mellom agarose og glass lysbildet (figur 1 c).
  5. Rotere kubikk rammen for å gjøre åpne ansiktet ned, og plasser på glass lysbildet igjen (figur 1 d).
  6. Gjenta trinn 1.3-1,5 til tre overflater er fylt med agarose (figur 1E).
  7. For å danne en agarose vegg på fjerde og femte ansiktene, innom agarose fra et åpent ansikt (figur 1F). Når en agarose vegg er dannet i femte ansiktet, er utarbeidelse av HGC fullført.

2. fabrikasjon av micromolds av klima og jordsmonn eller en maskinering prosess

  1. Fabrikasjon av klima og jordsmonn
    1. Rent destillert en silikon (Si) wafer via ultralyd med aceton, isopropylalkohol (IPA), deretter (DI) vann for 5 min. Etter nitrogen blåser Si kjeks med nitrogen, tørke i en ovn ved 140 ° C i 20 min (figur 2A(i)).
    2. Spin-coat en oppofrende lag som LOR og Az motstår på Si kjeks (2000 rpm, 30 s) ved hjelp av en spin-coater under gult lys. Umiddelbart etter spinn-belegg, varme kjeks på en stekeplate ved 90 ° C i 3 minutter (figur 2A(ii)). Ønsket tykkelse av oppofrende laget er mer enn 1 µm slik at løft av prosessen kan utføres enkelt, men en nøyaktig tykkelse er ikke nødvendig.
    3. Plasser kjeks på en varm plate på 70 ° C, og deretter laminat en tykk negative photoresist ark med ønsket tykkelse på oppofrende laget med en hånd roller (figur 2A(iii))
    4. Fem minutter etter laminering, plassere kjeks på en maske aligner for UV-stråling. Angi en photomask med ønsket mønster på arket motstå og utsette med UV-lys for en passende tid varighet. Eksponeringstid bestemmes av tykkelsen på photoresist og intensiteten av UV-lyset. Deretter plasser kjeks på en varm plate for en post-eksponering bake på 60 ° C i 5 min, etterfulgt av bakervarer på 90 ° C i 10 minutter (figur 2A(iv))
    5. Utvikle en negativ photoresist ved immersing kjeks i propylenglykol monomethyl Eter acetate (PGMEA) til ueksponerte området er fullstendig oppløst (ca 20 min) (figur 2A(v)).
    6. Oppløse oppofrende laget med IPA for ultralyd for å løfte av mikrostrukturen. Når mikrostrukturen skrelles fra kjeks, skyll med DI vann av ultralyd i 10 min (figur 2A(vi)).
    7. Fordype mold i 30 µL av MPC polymer i 30 min ved romtemperatur (ca 20 ° C) helt tørke den ut. Figur 2B viser fabrikkerte prisme mold.
  2. Fabrikasjon av en sylinder form
    1. Dikte en stål sylinder mold med ønsket størrelse av en maskinering prosess. Alternativt bruke kommersielt tilgjengelige rustfritt stål. (I denne studien, en φ 600 µm sylinder brukes.)
    2. Fordype sylinder stålet i 30 µL av MPC polymer i 30 min ved romtemperatur (ca 20 ° C) helt tørke den ut.
    3. Forbereder flytende polydimethylsiloxane (PDMS) ved å blande base harpiks og dens katalysator (se Tabell for materiale) i 10:1 forholdet etterfulgt av avgassing med et vakuum avgassing systemet for 20 min. Så helle PDMS i en 12-vel-plate.
    4. Angi stål sylinderen vinkelrett på datum overflaten og fast til en lineær z-fase slik at den vinkelrett kan settes i uherdet PDMS overflaten i en 12-vel-plate plassert på samme datum overflaten ved å flytte z-scenen. Inkuber PDMS med sylinder stålet i en ovn i 20 minutter ved 90 ° C for herding. Kutte PDMS å danne en flanke overflate slik at Pipetter kan settes inn på følgende prosess (figur 2C).

3. kontrollere første celle klynge figur i en hydrogel

  1. Sette inn en passende ECM for ønsket cellekultur, som kollagen og kunstig kjelleren membran, i HGC å fylle kultur rommet (figur 3A).
  2. Angi den ferdige micromold på HGC direkte eller indirekte med en passende holder, som vist i figur 3B. Deretter plasser HGC i en CO2 inkubator for 25 min ved 37 ° C i herding det.
  3. Forsiktig løfte ut micromold slik at ECM ikke forringes (Figur 3 c). Lommen, ville som ønsket mold figur, være fabrikasjon i ECM.
  4. Høste celler fra kulturperler parabolen av trypsin-EDTA eller tilsvarende avhengig av celletyper. Deretter sentrifuge cellene for å få svært konsentrert celler (for NHBE kultur, bruke 0,25% trypsin-EDTA ruge celler for 3 min, og nøytralisere med FBS inneholder medium og sentrifugering på 300 x g for 4 min).
  5. Sentrifugering, fjerne supernatant medium å kondensere cellene og injisere Høykonsentrert celler (3.0 × 104 celler/µL for NHBE celler) i lommen ECM (figur 3D).
  6. Inkuber HGC med celler i en CO2 inkubator for 20 min på 37 ° C slik at cellene faller i ECM lommen til tomrommet skapt av micromolds. Hvis overdreven middels eller celler finnes på overflaten, forsiktig fjerne bruker en pipette.
  7. Legg til HGC på en 24-godt-tallerken og legge 100 µL av passende medium (figur 3E). For NHBE celler, kan du bruke en 1:1 blanding av kommersielt tilgjengelige spesialiserte medium for NHBE og endotelceller (se Tabell for materiale).
  8. Sette inn flere ECM å lukke lommen ECM og deretter ruge på 37 ° C for 25 min.
  9. Avkjøl forvarmet 1,5% agarose til romtemperatur (ca 20 ° C). Slipp ca 10 µL av agarose på overflaten av HGC å lukke overflaten og forhindre ECM falt ut av HGC under dyrking og imaging (figur 3F). Deretter ruge HGC for en annen 20 min på 37 ° C for å kurere agarose.
  10. Legge til medium for å dekke hele HGC slik at osmotisk trykk kan hjelpe i å gi næring til cellene innenfor HGC.

4. multi-directional bildebehandling

  1. Ikke-invasive 3D form anerkjennelse av flere retninger observasjon
    1. Plasser kultur parabol eller godt plate inneholder HGC på et mikroskop og orientere HGC til kameraet rammen. Så, få et testbilde ved lyse felt eller fase kontrast.
    2. Plukke opp og roter HGC for å plassere en annen overflate ned.
    3. Gjenta trinn 4.1.1 og 4.1.2 til bilder fra alle sider seks side.
  2. Immuno-fluorescerende bildebehandling av flere retninger observasjon
    1. For fiksering, gjelde 4% paraformaldehyde prøven over HGC ved romtemperatur (ca 20 ° C) for 20 min, etterfulgt av to skyller av PBS i 10 min.
    2. Permeabilize HGC med PBS med 0,5% Triton X-100 i 10 min ved 4 ° C, deretter vaske 3 x i 10 min med PBS.
    3. Inkuber HGC med 10% geit serum hvis-buffer (0,2% Triton X-100, 0,1% bovin serum albumin, og utgjør 0,05% Tween-20 i PBS) for 60 min ved romtemperatur for en primær blokkerer steg.
    4. Flekker av et bestemt molekyl, bruke aktuelle antistoffer. For å observere kollektive celle geometri, benyttes Alexa Fluor 488 Phalloidin stain utgangen.
    5. Plasser HGC på et glass bunnen rett under mikroskop laser eller fluorescerende og utføre skanning fra seks sider å få hele utvalget bildet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Normal menneskelig bronkial (NHBE) epitelceller ble brukt til å demonstrere illustrert metodikken og kontrollere første kollektive celle geometrien for å oppnå en sylinder form og et prisme form, henholdsvis i ECM miljø. Flere retninger tenkelig resultatene av kontrast samt phalloidin farging av en sylinder form (figur 4AB) og prisme figuren (figur 4CD) presenteres. Cellene justeres passende for å gi ønsket 3D form i ECM-miljøet. Deretter cellene var utdannet i fire dager til en spesifikk figur og deretter ble analysert av flere retninger tenkelig. Stor utvalgsstørrelsen gjør det ganske vanskelig å fange opp hele vev bildet fra én retning; imidlertid tillatt HGC imaging fra opptil seks sider, avsløre hele vev form. Figur 5 viser immunostai-resultatet av bronkial treet fra NHBE cellene. NHBE cellene var opprinnelig kontrollert til sylinderform i HGC. Da var de fleste av grenene rettet vinkelrett sylindriske aksen.

Figure 1
Figur 1: fabrikasjon prosessen hybrid gel kube enhet. (A) polykarbonat kubikk rammen er satt på en forkjøles isen boksen. (B) Agarose (1,5%) injiseres for å dekke bunnen. (C) kuben er gled skal samles. (D) kuben roteres for å gjøre en annen overflate ned. (E) Agarose (1,5%) injiseres for å danne en annen agarose vegg. (F) etter en agarose vegg produseres for tre ansikter, agarose injiseres gjennom en åpen ansikt. Skala bar: 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: fabrikasjon prosessen med micromolds. (A) fabrikasjon med en micromold av klima og jordsmonn. (B) full form av en fabrikkert prisme figur micromold av klima og jordsmonn. (C) fremstille micromold med sylinder stål. Skala bar: (B) 2 mm, (C) 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: fabrikasjon prosessen første celle klynge kontroll. (A) ECM (f.eks kollagen og Matrigel) injiseres i HGC. (B) i micromold ligger på kubikk rammen med eller uten en. (C) etter ECM er herdet, micromold er fjernet. (D) etter sentrifugering, meget kompakt celler er injisert og ruges. (E) Medium brukes. (F) ekstra ECM etterfulgt av agarose er injisert for å dekke overflaten av HGC. Skala bar: 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: resultatene av første celle kontroll med NHBE celler. (A) kontrast bilder av cylindrically kontrollert NHBE cellene tatt for bunnen og lateral overflaten. Hele figuren kan bli gjenkjent av flere retninger observasjon uten fluorescerende bildebehandling. (B) fluorescens bilder av cylindrically kontrollert NHBE cellene flekker F-utgangen. (C) kontrast bilder av NHBE cellene kontrollert i en trekantet prisme figur tatt fra bunnen og lateral overflater. (D) fluorescens bilder av NHBE cellene kontrollert i en trekantet prisme figur. Skala bar: 100 µm. 10 x forstørrelse linsen (0,3 numeriske blenderåpning) ble brukt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: anslått fluorescerende bilder tatt av flere retninger skanning. NHBE cellene var opprinnelig kontrollert for å produsere sylinderform og kultivert i HGC for 4 dager. Deretter var utgangen farget av phalloidin. Greinene var langstrakte fra første sylinderen langs x-aksen, og lengde, størrelse og vinkel fra aksen var like utviklet. Nedre høyre bilde viser skjematisk av x-y-z -aksen og eksempel figuren. Skala bar: 100 µm. En 10 x forstørrelse linsen (0,3 numeriske blenderåpning) ble brukt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden presentert i dette papiret er enkel og kan utføres uten høyteknologisk utstyr. Samtidig, kan en presis celle klynge figur kontroll resultatet i 3D-rom av hydrogel oppnås. Etter den innledende kontrollen, kan cellene vokse i HGC som de er kultivert på et fat. Flere retninger avbilding utføres av roterende prøven med HGC med noen mikroskopi-systemet, og det betydelig forbedrer tenkelig kvaliteten. Valget av materialer for HGC ramme og micromold er fleksible så lenge de er biokompatible. En 3D-skriver kan brukes til å produsere HGC rammen eller micromold hvis nøyaktigheten av 3D-skriver er tilstrekkelig for programmer. Den foreslåtte metoden er kompatibel med mange bildet bedre teknologi som åpenhet reagenser20,21 og lys arks mikroskopi systemer. Ved hjelp av disse teknologiene, kan bildekvaliteten forbedres.

Volumet av agarose, ECM og svært tette celler skal injiseres avhenger av HGC og mold størrelsen. En forsiktig manuell operasjon som luftbobler ikke injiserer er nødvendig, ellers bobler dannet vil svekkes nøyaktigheten av kontroll, cellevekst og tenkelig kvalitet.

Fabrikasjon prosessen med micromolds bestemmes av ønsket fasong kontroll. Klima og jordsmonn gjør fabrikasjon av presise 2D figurer med en viss dybde, for eksempel et prisme figuren på mikrometer; men er det ikke effektivt med 3D-former, for eksempel en sylinder. Maskinering prosessen tillater oss å dikte 3D form, men generelt dimensjonale nøyaktigheten er lavere enn klima og jordsmonn. Etter fabrikasjon av micromolds, er belegg av 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer på formene krevde å forhindre vedheft på ECM.

Ved hjelp av en HGC, kan mikroskopiske bildebehandling med eller uten laser eksponering utføres i flere retninger. En 3D eksempel figur som kan gjenkjennes ca av flere retninger observasjon, uten fluorescerende merking; Denne metoden medfører ikke noen celle invasiveness under observasjon. Derimot er fluorescerende imaging nødvendig for å få en mer nøyaktig 3D eksempel form og molekylære uttrykk.

Begrensningen av presentert metoden for første cellekontroll er at det ikke kan brukes på en mold med en kompleks 3D-form. Mold må fjernes ved å plukke opp uten svekkes ECM. Dermed er mold begrenset til en enkelt rett eller konisk form. For å få mer kompleks figur kontroll, er videre utvikling av protokollen nødvendig.

Foreslåtte metodikken har omfattende verktøy og lett kan gjennomføres i de fleste av de laboratorium miljøene. Denne prosessen kan overvinne begrensningene til 3D kultur, bildebehandling og repeterbarhet, og bidra til videre utvikling kreves for 3D kultur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne og Osaka Prefecture University og Kyushu Institute of Technology har arkivert en patent på en hybrid gel kube enhet, og Nippon medisinsk og kjemiske instrumenter Co Ltd, Japan har nylig kommersialisert kuben. Selskapet påvirke ikke noen av design, prosess og metodene som er beskrevet.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av JSPS KAKENHI (18H 04765) og skal spre tid sporet System, MEXT, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plate Corning  Inc. 3513
2-Methoxy-1-methylethyl Acetate FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. 130-10505 PGMEA, CAS: 108-65-6 
4% paraformaldehyde FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. 161-20141 CAS: 30525-89-4
Agarose, low gelling temperature  BioReagent Sigma-Aldrich A9414
Alexa fluor 488 phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
AZ1512 Merck
BEGM bullet kit Lonza CC-3170 Specialized medium for NHBE cells
Bovine Serum Albumin solution (10 %) Sigma-Aldrich A1595
EGM-2 bullet kit Lonza CC-3162 Specialized medium for endothelial cells
Lipidure NOF co. MPC polymer
Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix Corning  Inc. 354230
Normal Goat Serum (10%) Thermo Fisher Scientific 50197Z
Normal human bronchial epithelial cells Lonza CC-2541
SILPOT 184 W/C Dow Corning Co. 3255981 Base resin and catalyst for PDMS
SUEX D300 DJ MicroLaminates, Inc Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)
Triton X-100 (1%) Thermo Fisher Scientific HFH10
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
  3. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  4. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  5. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  6. Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
  7. Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
  8. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
  9. Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
  10. Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  11. Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  12. Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
  13. Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
  14. Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
  15. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
  16. Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  17. Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
  18. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
  19. Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
  20. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  21. Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).

Tags

Bioteknologi problemet 145 3D-kontroll 3D kultur i vitro eksperiment mønster formasjon airway grener multi-directional bildebehandling
Første 3D celle klynge kontroll i en Hybrid Gel kube enhet for repeterbare mønster formasjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara,… More

Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations. J. Vis. Exp. (145), e59214, doi:10.3791/59214 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter