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Bioengineering

Repeatable पैटर्न संरचनाओं के लिए एक संकर जेल घन डिवाइस में प्रारंभिक 3 डी सेल क्लस्टर नियंत्रण

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/59214
Automatic Translation
1, 2, 3
1NanoSquare Research Institute, Osaka Prefecture University, 2Department of Bioscience and Informatics, Osaka Prefecture University, 3Department of Biological Functions Engineering, Kyushu Institute of Technology

Summary

हम एक repeatable पैटर्न गठन प्राप्त करने के लिए एक 3 डी extracellular मैट्रिक्स में प्रारंभिक सेल क्लस्टर आकार को नियंत्रित करने के लिए एक प्रक्रिया मौजूद है । ऊतक पैटर्न के गठन के लिए बहु-दिशात्मक इमेजिंग को प्राप्त करने के लिए दो विभिन्न hydrogels युक्त एक घन डिवाइस कार्यरत है ।

Abstract

इन विट्रो 3D संस्कृतियों के महत्व को कोशिका/ऊतक संवर्धन में काफी बल दिया जाता है । हालांकि, प्रयोगात्मक repeatability की कमी इसके प्रतिबंधों में से एक है । पैटर्न के गठन के कुछ repeatable परिणाम उत्पादन स्वयं संगठन अंतर्निहित तंत्र के विश्लेषण को कमजोर करता है । प्रारंभिक संस्कृति की स्थिति में भिन्नता को कम करने, जैसे कोशिका घनत्व और बाह्य मैट्रिक्स (ECM) में वितरण, एक 3 डी संस्कृति के repeatability को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है. इस अनुच्छेद में, हम एक 3 डी extracellular मैट्रिक्स में प्रारंभिक सेल क्लस्टर आकार को नियंत्रित करने के लिए अत्यधिक repeatable पैटर्न संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए एक सरल लेकिन मजबूत प्रक्रिया का प्रदर्शन । एक वांछित आकार के साथ एक माइक्रोओल्ड photolithography या मशीनिंग प्रक्रिया का उपयोग करके निर्मित किया गया था, और यह एक संकर जेल घन में निहित ECM में एक 3 डी जेब का गठन (HGC). उच्च केंद्रित कोशिकाओं तो जेब में इंजेक्शन थे कि सेल क्लस्टर आकार गढ़े मोल्ड आकार के साथ मिलान किया । कार्यरत HGC बहु अपने रोटेशन है, जो उच्च संकल्प इमेजिंग सक्षम और पूरे ऊतक संरचना का कब्जा भले ही एक कम इज़ाफ़ा लेंस इस्तेमाल किया गया था द्वारा दिशात्मक स्कैनिंग की अनुमति दी । सामान्य मानव ब्रोनियल उपकला कोशिकाओं की कार्यप्रणाली को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया.

Introduction

एक 3 डी संस्कृति है, जो बेहतर जैविक वातावरण mimics से एक 2d संस्कृति का महत्व है, काफी सेल में बल दिया/ कोशिकाओं और extracellular मैट्रिक्स (ecm) के बीच बातचीत के लिए महत्वपूर्ण cues प्रदान करता है संरचनाविकास4,5. कई ऊतक संरचनाओं केवल 3 डी वातावरण के तहत उभर सकते हैं, जैसे तह प्रक्रिया6,7,8अंतर्वलन, और ट्यूबलर गठन9,10. हालांकि, कई कठिनाइयों एक डिश पर 2D प्रयोगों से 3 डी प्रयोगों के लिए स्थानांतरण से शोधकर्ताओं को रोकने के । 3 डी प्रयोगों में प्रमुख कठिनाइयों में से एक इमेजिंग 3D नमूनों का मुद्दा है । समतलाकार प्रयोगों के साथ तुलना में, उपयुक्त 3 डी छवियों का अधिग्रहण अभी भी कई मामलों में चुनौतीपूर्ण है । विशेष रूप से, एक उपयुक्त 3 डी छवि प्राप्त करना एक मुश्किल काम है जब नमूना आकार कम-आवर्धन लेंस की बड़ी फोकल गहराई के कारण मिलीमीटर रेंज तक पहुंचता है । उदाहरण के लिए, फोकल गहराई ५० μm से अधिक तक पहुंचती है जब एक 10x आवर्धन लेंस का प्रयोग किया जाता है जबकि एकल कोशिका का आकार सामान्य रूप से 10 μm से कम होता है । इमेजिंग गुणवत्ता बढ़ाने के लिए, उच्च प्रौद्योगिकी माइक्रोस्कोपी सिस्टम विकसित किया जा रहा है (जैसे, दो photon माइक्रोस्कोपी11 और प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी प्रणाली12), लेकिन उनकी उपलब्धता उनके महंगे मूल्य के कारण सीमित है । एक विकल्प के रूप में, हम पहले एक संकर जेल घन (HGC)13डिवाइस विकसित की है । डिवाइस hydrogels के दो प्रकार के होते हैं: एक समर्थन जेल और ऐसे कोलेजन या एक संस्कृति जेल के रूप में matrigel के रूप में एक ecm के रूप में ऐगेरोस । hgc हमें संवर्धन के दौरान नमूना इकट्ठा करने के लिए और घन घुमाएगी बहु-दिशात्मक इमेजिंग, जो फोकल गहराई समस्या14पते को प्राप्त करने की अनुमति देता है ।

3 डी प्रयोगों में एक और कठिनाई उनके कम repeatability 3 डी वातावरण के गरीब नियंत्रणीयता के कारण है । एक प्लास्टिक की डिश पर एक समतलता संस्कृति के विपरीत, प्रारंभिक संस्कृति की स्थिति में बदलाव आसानी से एक नरम सामग्री से घिरा हुआ एक 3 डी अंतरिक्ष में होते हैं । प्रयोगात्मक परिणामों में एक महत्वपूर्ण भिंनता निंनलिखित विश्लेषण बिगड़ती है और अंतर्निहित तंत्र मास्क । कई इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों स्थानिक15,16, फाइबर बुनाई17के रूप में एकल कोशिकाओं, संरेखित करने के लिए विकसित किया गया है, और मचान18, लेकिन वे जटिल preprocessing की आवश्यकता होती है या विशेष रूप से उपकरण तैयार किया । इसके विपरीत, हम एक HGC19में 3 डी सेल संरेखण को प्राप्त करने के लिए एक पद्धति विकसित की है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम एक HGC में 3 डी प्रारंभिक सेल क्लस्टर आकार को नियंत्रित करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया उपकरणों के साथ एक सरल प्रक्रिया सचित्र । सबसे पहले, HGC के निर्माण की प्रक्रिया का प्रदर्शन किया गया । फिर, एक ECM में एक मनमाने ढंग से आकार के साथ एक जेब का उत्पादन करने के लिए HGC में रखा गया था, फोटोनोग्राफी या मशीनिंग प्रक्रिया द्वारा निर्मित माइक्रोबूल्ड्स । बाद में, अत्यधिक घने कोशिकाओं के बाद केंद्रापसारक पॉकेट में इंजेक्शन के लिए HGC में प्रारंभिक सेल क्लस्टर आकार नियंत्रित किया गया । ठीक से नियंत्रित सेल क्लस्टर HGC के कारण कई दिशाओं से imaged हो सकता है । सामान्य मानव ब्रोंशियल उपकला (NHBE) कोशिकाओं इमेजिंग गुणवत्ता बढ़ाने के लिए कई दिशाओं से प्रारंभिक सेल क्लस्टर आकार और शाखाओं की इमेजिंग के नियंत्रण को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।

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Protocol

1. संकर जेल घन उपकरण का निर्माण

  1. एक मशीनिंग प्रक्रिया या एक 3 डी प्रिंटर का उपयोग करके या तो एक पॉलीकार्बोनेट (पीसी) घन फ्रेम तैयार करें । PC फ़्रेम का आकार नमूना आकार पर निर्भर करता है । इस अध्ययन में, हम हर तरफ 5 मिमी की एक फ्रेम का इस्तेमाल किया है ताकि शाखाओं को culturing के दौरान बढ़ाना करने के लिए पर्याप्त स्थान था ।
  2. एक आइस बॉक्स (< 0 डिग्री सेल्सियस) (चित्रा 1a) में एक पूर्व ठंडा कांच स्लाइड या एक और चिकनी सतह पर पीसी फ्रेम प्लेस ।
  3. एक पिपेट के साथ नीचे की सतह पर घन फ्रेम के शीर्ष चेहरे से पूर्व गरम १.५% ऐगेरोस (w/v) के 12 μl जोड़ें । पिपेट स्ट्रोक इतना है कि ऐगेरोस एक सपाट सतह बनाने के लिए फैलता है (चित्र 1b) ।
  4. मिनटों के भीतर ही आगरोज ठीक हो जाएगा । यह चिमटी का उपयोग कर कांच स्लाइड के किनारे करने के लिए फिसलने से पीसी फ्रेम उठाओ । ध्यान दें कि लंबवत कांच की स्लाइड से फ्रेम को ऊपर उठाने से अगरोस और कांच की स्लाइड के बीच चिपकने वाली शक्ति के कारण घन फ्रेम से आगार्ज का अलग-अलग परिणाम हो सकता है (चित्र 1C) ।
  5. खुला चेहरा नीचे बनाने के लिए घन फ्रेम घुमाएं, और फिर कांच स्लाइड पर फिर से जगह (चित्रा 1d) ।
  6. दोहराएं कदम 1.3-1.5 जब तक तीन सतहों ऐगेरोस से भर रहे है (चित्रा 1e) ।
  7. चौथे और पांचवें चेहरे पर एक ऐगेरोस दीवार बनाने के लिए, एक खुले चेहरे से ऐगेरोस ड्रॉप (चित्रा 1f) । एक बार एक ऐगेरोस दीवार पांचवें चेहरे पर बना है, hgc की तैयारी पूरी हो गई है ।

2. फोटोथिग्राफी या मशीनिंग प्रक्रिया द्वारा माइक्रोबूल्ड्स का निर्माण

  1. प्रकाश-चित्रण द्वारा निर्माण
    1. एसीटोन, isopropyl शराब (आइपीएल) के साथ अल्ट्रासोनिक सफाई के माध्यम से एक सिलिकॉन (एसआई) वेफर साफ है, तो 5 मिनट प्रत्येक के लिए आसुत (डि) पानी । नाइट्रोजन के साथ एसआई वेफर उड़ाने के बाद, 20 मिनट के लिए १४० डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में निर्जलीकरण (चित्रा 2a(i)) ।
    2. स्पिन-कोट ऐसे LOR और Az के रूप में एक बलि परत एक स्पिन-पीला प्रकाश के तहत coater का उपयोग करके एसआई वेफर (२,००० rpm, 30 एस) पर विरोध । स्पिन कोटिंग के तुरंत बाद, 3 मिनट के लिए ९० डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वफर गर्मी (चित्रा 2A(द्वितीय)) । बलि की परत की वांछित मोटाई अधिक से अधिक 1 μm है ताकि लिफ्ट प्रक्रिया आसानी से बाहर किया जा सकता है, लेकिन एक सटीक मोटाई आवश्यक नहीं है ।
    3. ७० डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर प्लेस, और फिर एक हाथ रोलर का उपयोग कर बलि परत पर वांछित मोटाई के साथ एक मोटी नकारात्मक photoresist शीट लेमिनेट (चित्रा 2A(iii))
    4. लेमिनेशन के पांच मिनट बाद यूवी एक्सपोजर के लिए वेफर को मास्क एलीकनर पर लगाएं । शीट का विरोध पर वांछित पैटर्न के साथ एक photomask सेट और एक उपयुक्त समय अवधि के लिए यूवी प्रकाश के साथ बेनकाब । एक्सपोजर समय photoresist की मोटाई और यूवी प्रकाश की तीव्रता के द्वारा निर्धारित किया जाता है । बाद में, 5 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर एक के बाद जोखिम सेंकना के लिए एक गर्म थाली पर वेफर प्लेस, ९० ° c पर 10 मिनट के लिए पाक द्वारा पीछा किया । (चित्र 2A(iv))
    5. अउजागर क्षेत्र पूरी तरह से भंग (लगभग 20 मिनट) (चित्रा 2a(v)) जब तक propylene ग्लाइकोल मोनोमेथील ईथर एसीटेट (pgmea) में वेफर डुबके द्वारा एक नकारात्मक photoresist विकसित करना ।
    6. अल्ट्रासोनिक सफाई के लिए आईपीए का उपयोग करके बलि परत भंग microstructure से लिफ्ट । एक बार microstructure वेफर से खुली है, 10 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक सफाई द्वारा DI पानी के साथ कुल्ला (चित्रा 2A(vi)) ।
    7. 30 मिनट के लिए MPC बहुलक के 30 μL में मोल्ड विसर्जित कमरे के तापमान (लगभग 20 डिग्री सेल्सियस) पर पूरी तरह से यह सूखी बाहर । चित्रा 2B गढ़े चश्मे मोल्ड से पता चलता है ।
  2. एक सिलेंडर मोल्ड के निर्माण
    1. एक मशीनिंग प्रक्रिया द्वारा वांछित आकार के साथ एक इस्पात सिलेंडर मोल्ड बनाना । वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध स्टेनलेस स्टील का उपयोग करें । (इस अध्ययन में, एक φ ६०० μm सिलेंडर का उपयोग किया जाता है.)
    2. कमरे के तापमान (लगभग 20 डिग्री सेल्सियस) पर 30 मिनट के लिए MPC बहुलक के 30 μL में सिलेंडर स्टील विसर्जित करने के लिए पूरी तरह से इसे बाहर सूखी ।
    3. तरल पॉलीडिमेथिलसिलॉक्सेन (PDMS) का मिश्रण आधार राल और उसके उत्प्रेरक ( सामग्री की तालिकादेखें) एक 10:1 अनुपात में 20 मिनट के लिए एक वैक्यूम degassing प्रणाली के साथ degassing के बाद द्वारा तैयार । फिर एक 12-अच्छी थाली में PDMS डालो ।
    4. इस्पात सिलेंडर आधार सतह के लंबवत सेट करें और एक रैखिक z-चरण के लिए तय है ताकि यह एक 12 में uncured PDMS सतह में डाला जा सकता है-अच्छी तरह से प्लेट z-मंच हिल द्वारा एक ही आधार सतह पर रखा थाली । इलाज के लिए ९० डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक ओवन में सिलेंडर स्टील के साथ PDMS इनक्यूबेट । एक पार्श्व सतह बनाने के लिए PDMS काटें जिससे कि पिपेट निंन प्रक्रिया में संमिलित किया जा सके (चित्र 2c) ।

3. एक हाइड्रोजेल में प्रारंभिक सेल क्लस्टर आकार को नियंत्रित

  1. इस तरह के कोलेजन और कृत्रिम तहखाने झिल्ली के रूप में वांछित सेल संस्कृति के लिए एक उपयुक्त ECM सुई, HGC में संस्कृति अंतरिक्ष (चित्रा 3A) को भरने के लिए ।
  2. एक उपयुक्त धारक के साथ HGC पर गढ़े माइक्रोओल्ड सीधे या परोक्ष रूप से सेट करें, जैसा कि चित्रा 3Bमें दिखाया गया है । बाद में, HGC एक सह2 इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए यह इलाज के लिए जगह है ।
  3. माइक्रोओल्ड को सावधानी से बाहर उठाएं ताकि ईएसएम (चित्रा 3c) खराब न हो । वांछित मोल्ड आकार के रूप में जेब, ECM में निर्मित किया जाएगा ।
  4. trypsin द्वारा सुसंस्कृत पकवान से फसल कोशिकाओं-EDTA या इसके समकक्ष सेल प्रकार के आधार पर । बाद में, कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज अत्यधिक केंद्रित कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए (nhbe संस्कृति के लिए, ०.२५% trypsin-edta और सेते कोशिकाओं 3 मिनट के लिए लागू होते हैं, तो fbs-युक्त माध्यम और 4 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज के साथ बेअसर) ।
  5. सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद, कोशिकाओं को गाढ़ा करने के लिए supernatant माध्यम को हटा दें, और उच्च केंद्रित कोशिकाओं (३.० × 104 कोशिकाओं/-एल nhbe कोशिकाओं के लिए) की जेब में Ecm (चित्र 3 डी) इंजेक्ट ।
  6. एक सह2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं के साथ hgc को ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते ताकि माइक्रोबूल्ड्स द्वारा बनाई गई जगह को भरने के लिए कोशिकाओं ecm जेब में गिर जाते हैं । यदि ऊपरी सतह पर अत्यधिक मध्यम या कोशिकाएँ मौजूद हों तो सावधानीपूर्वक एक पिपेट का उपयोग करके निकालें.
  7. एक 24-अच्छी थाली पर HGC प्लेस और उपयुक्त माध्यम (चित्रा 3E) के १०० μl जोड़ें । एनएचबी कोशिकाओं के लिए, NHBE और endothelial कोशिकाओं के लिए वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध विशेष माध्यम का एक 1:1 मिश्रण का उपयोग करें ( सामग्री की मेजदेखें) ।
  8. ECM में जेब बंद करने के लिए अतिरिक्त ECM सुई, और फिर 25 मिनट के लिए ३७ ° c पर सेते ।
  9. शांत नीचे पूर्व गरम १.५% कमरे के तापमान के लिए ऐगेरोस (लगभग 20 डिग्री सेल्सियस) । hgc के शीर्ष सतह पर ऐगेरोस के लगभग 10 μl ड्रॉप सतह बंद करने के लिए और संवर्धन और इमेजिंग के दौरान hgc से बाहर गिरने से ecm को रोकने (चित्रा 3f) । फिर, एक और 20 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर agarose इलाज के लिए HGC सेटे ।
  10. संपूर्ण hgc को कवर करने के लिए मध्यम जोड़ें ताकि परासरणी दबाव hgc के अंदर कोशिकाओं को पोषण प्रदान करने में मदद कर सकते हैं ।

4. मल्टी दिशात्मक इमेजिंग

  1. गैर इनवेसिव 3D आकृति बहु-दिशात्मक प्रेक्षण द्वारा मांयता
    1. संस्कृति पकवान या अच्छी तरह से एक खुर्दबीन पर HGC युक्त थाली प्लेस और कैमरा फ्रेम करने के लिए HGC ओरिएंट । फिर, उज्ज्वल फ़ील्ड या चरण कन्ट्रास्ट द्वारा एक नमूना छवि प्राप्त करें ।
    2. उठाओ और HGC घुमाने के लिए एक अलग सतह नीचे जगह है ।
    3. दोहराएं कदम 4.1.1 और 4.1.2 जब तक सभी छह पक्षों से छवियां प्राप्त कर रहे हैं ।
  2. इम्युनो-प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा बहु-दिशात्मक प्रेक्षण
    1. निर्धारण के लिए, 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (लगभग 20 डिग्री सेल्सियस) पर HGC पर नमूने के लिए 4% paraformaldehyde लागू करें, 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के दो rinses द्वारा पीछा किया ।
    2. 4 ° c पर 10 मिनट के लिए ०.५% Triton X-१०० युक्त PBS के साथ HGC Permeabilize, तो PBS के साथ 10 मिनट के लिए 3x धो लें ।
    3. अगर बफर में 10% बकरी सीरम के साथ (०.२% Triton X-१००, ०.१% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, और ०.०५% Tween-20 पीबीएस में) के लिए एक प्राथमिक अवरुद्ध कदम के लिए कमरे के तापमान पर ६० मिनट के लिए सेटे ।
    4. एक विशिष्ट अणु के धुंधला करने के लिए, उपयुक्त एंटीबॉडी का उपयोग करें । करने के लिए सामूहिक कोशिका ज्यामिति का निरीक्षण, Alexa Fluor ४८८ Phalloidin actin दाग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    5. एक गिलास नीचे डिश पर एक लेजर या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत HGC प्लेस और छह पक्षों से स्कैनिंग प्रदर्शन करने के लिए पूरे नमूना छवि प्राप्त करते हैं ।

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Representative Results

सामान्य मानव ब्रोंशियल उपकला (NHBE) कोशिकाओं को सचित्र पद्धति को प्रदर्शित करने और एक ECM वातावरण में क्रमशः एक सिलेंडर आकार और एक चश्मे के आकार को प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक सामूहिक कोशिका ज्यामिति को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । बहु-दिशात्मक इमेजिंग परिणाम द्वारा प्राप्त चरण कन्ट्रास्ट के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक सिलेंडर आकार के phalloidin धुंधला (चित्र 4a, ख) और चश्मे के आकार (चित्रा 4c, डी) प्रस्तुत कर रहे हैं । कोशिकाओं को उपयुक्त ECM वातावरण में वांछित 3 डी आकार उपज के अनुरूप हैं । बाद में, कोशिकाओं को चार दिनों के लिए सभ्य थे एक विशिष्ट आकार बनाने के लिए और फिर बहु-दिशात्मक इमेजिंग द्वारा विश्लेषण किया गया । बड़े नमूना आकार यह काफी मुश्किल एक दिशा से पूरे ऊतक छवि पर कब्जा करने के लिए बनाता है; हालांकि, HGC को छह पक्षों से इमेजिंग की अनुमति दी, पूरे ऊतक आकार खुलासा । चित्रा 5 से पता चलता है कि bronal पेड़ के immunostaining परिणाम nhbe कोशिकाओं से विकसित की है । एनएचबी कोशिकाओं को शुरू में HGC में एक बेलनाकार आकार के लिए नियंत्रित किया गया । तत्पश्चात् अधिकांश शाखाओं को बेलनाकार अक्ष के लंबवत निदेश दिए गए ।

Figure 1
चित्र 1: संकर जेल घन डिवाइस के निर्माण की प्रक्रिया । (क) पॉलीकार्बोनेट घन फ्रेम एक पूर्व कूल्ड आइस बॉक्स पर सेट किया जाता है । (ख) आगरोस (१.५%) नीचे की सतह को कवर करने के लिए इंजेक्शन है । (ग) घन को एकत्रित किया जा सकता है । (घ) एक और सतह को नीचे करने के लिए घन घुमाया जाता है । (ङ) आगरोस (१.५%) एक और ऐगेरोस दीवार के रूप में इंजेक्शन है । (च) तीन चेहरों के लिए एक आगारोज दीवार के उत्पन्न होने के बाद, अग्रोस को खुले चेहरे से इंजेक्ट किया जाता है । स्केल बार: 5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: माइक्रोबूल्ड्स के निर्माण की प्रक्रिया । (क) फोटोग्राफी द्वारा माइक्रोओल्ड के निर्माण की प्रक्रिया । (इ) फोटोग्राफी द्वारा माइक्रोबुल्ड एक गढ़े हुए प्रिज्म आकार का पूर्ण रूप । (ग) सिलिंडर स्टील के साथ निमत माइक्रोओल्ड । स्केल पट्टी: (B) 2 mm, (C) 10 mm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रारंभिक सेल क्लस्टर नियंत्रण के निर्माण की प्रक्रिया । (क) ईजीएम (जैसे, कोलेजन और मैत्रीजेल) को एचजीसी में इंजेक्ट किया जाता है । (ख) माइक्रोओल्ड एक धारक के साथ या उसके बिना घन फ्रेम पर स्थापित किया जाता है । (ग) ईजीएम के ठीक हो जाने के बाद माइक्रोओल्ड को निकाल दिया जाता है । (घ) सेंट्रीफ्यूज होने के बाद अत्यधिक सघन कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है । (ङ) मध्यम का प्रयोग किया जाता है । (च) एगरोस द्वारा अपनाई गई अतिरिक्त ईएसएम को एचजीसी की ऊपरी सतह को कवर करने के लिए इंजेक्ट किया जाता है । स्केल बार: 5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एनएचबी कोशिकाओं के साथ प्रारंभिक सेल नियंत्रण के परिणाम । (क) नीचे और पार्श्व सतह के लिए लिए गए बेलनाल नियंत्रित एनएचबी प्रकोष्ठों के चरण-विपरीत बिंब । पूरे आकार फ्लोरोसेंट इमेजिंग की आवश्यकता के बिना बहु दिशात्मक अवलोकन द्वारा पहचाना जा सकता है । (ख) बेलनानुसार नियंत्रित एनएचबी प्रकोष्ठों के प्रतिदीप्ति बिंब च-ऐक्टिन अभिरंजक होते हैं । (ग) नीचे और पार्श्व सतहों से कब्जाई गई त्रिकोणीय प्रिज्म आकृति में नियंत्रित एनएचबी प्रकोष्ठों की चरण-विपरीत छवियां । (घ) एक त्रिकोणीय प्रिज्म आकार में नियंत्रित एनएचबी प्रकोष्ठों की प्रतिदीप्ति छवियां । स्केल पट्टी: १०० μm. 10x आवर्धन लेंस (०.३ संख्यात्मक अपर्चर) का प्रयोग किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रक्षेपित फ्लोरोसेंट बहु-दिशात्मक स्कैनिंग द्वारा कब्जा कर लिया छवियां । NHBE कोशिकाओं को शुरू में एक बेलनाकार आकार और 4 दिनों के लिए HGC में सुसंस्कृत उत्पादन नियंत्रित किया गया । बाद में, ऐक्टिन phalloidin द्वारा दाग था । शाखाएं x अक्ष के साथ आरंभिक बेलन से लंबी थीं, और अक्ष से लंबाई, आकार और कोण समान रूप से विकसित थे । कम सही छवि x-y-z अक्ष और नमूना आकार की योजनाबद्ध दिखाता है । स्केल बार: १०० μm । एक 10x आवर्धन लेंस (०.३ संख्यात्मक एपर्चर) का प्रयोग किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस पत्र में प्रस्तुत विधि सरल है और उच्च प्रौद्योगिकी उपकरणों के बिना किया जा सकता है । समवर्ती, हाइड्रोजेल के 3 डी अंतरिक्ष में एक सटीक सेल क्लस्टर आकार नियंत्रण परिणाम प्राप्त किया जा सकता है । प्रारंभिक नियंत्रण के बाद, कोशिकाओं के रूप में अधिक के रूप में वे एक डिश पर सभ्य है HGC में विकसित कर सकते हैं । बहु-दिशात्मक इमेजिंग HGC किसी भी माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग कर के साथ नमूना घूर्णन द्वारा किया जाता है, और यह काफी इमेजिंग गुणवत्ता को बढ़ाता है । जब तक वे biocompatible है HGC फ्रेम और माइक्रोओल्ड के लिए सामग्री का विकल्प लचीला है । एक 3 डी प्रिंटर HGC फ्रेम या माइक्रोपुराने उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर 3 डी प्रिंटर की सटीकता उनके अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त है । प्रस्तावित विधि पारदर्शिता अभिकर्मकों20,21 और प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी प्रणाली जैसे कई छवि बढ़ाने प्रौद्योगिकियों के साथ संगत है । इन तकनीकों को नियोजित करके, छवि गुणवत्ता में सुधार किया जा सकता है ।

एगरोस, ECM, और अत्यधिक घने कोशिकाओं के इंजेक्शन की मात्रा HGC और मोल्ड के आकार पर निर्भर करता है । एक सावधान मैनुअल आपरेशन है कि हवा के बुलबुले सुई नहीं है की आवश्यकता है, अन्यथा गठन बुलबुले नियंत्रण की सटीकता, सेल विकास, और इमेजिंग गुणवत्ता खराब हो जाएगा.

माइक्रोबूल्ड्स के निर्माण की प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए वांछित आकार द्वारा निर्धारित किया जाएगा । फोटोल्थोग्राफी एक निश्चित गहराई के साथ सटीक 2D आकृतियों के निर्माण में सक्षम बनाता है, जैसे माइक्रोमीटर के क्रम पर एक प्रिज्म आकार; हालांकि, यह एक सिलेंडर के रूप में 3 डी आकार, के साथ प्रभावी नहीं है । मशीनिंग प्रक्रिया हमें 3 डी आकार बनाना करने के लिए अनुमति देता है, लेकिन सामान्य रूप में, आयामी सटीकता photolithography से कम है । माइक्रोबूल्ड्स के निर्माण के बाद, 2 की कोटिंग-methacryloyloxyethyl फॉस्फोरिलकोलाइन (MPC) molds पर बहुलक ECM पर आसंजन को रोकने के लिए आवश्यक है ।

एक HGC, के साथ या लेजर जोखिम के बिना माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग का लाभ लेने के द्वारा कई दिशाओं में किया जा सकता है । एक 3 डी नमूना आकार लगभग फ्लोरोसेंट लेबलिंग के बिना बहु-दिशात्मक अवलोकन द्वारा पहचाना जा सकता है; इस विधि अवलोकन के दौरान किसी भी सेल invasiveness कारण नहीं है । इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट इमेजिंग एक और अधिक सटीक 3 डी नमूना आकार और आणविक अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।

प्रारंभिक सेल नियंत्रण के लिए प्रस्तुत विधि की बाधा यह है कि यह एक जटिल 3 डी आकार के साथ एक मोल्ड करने के लिए लागू नहीं किया जा सकता है । मोल्ड को बिना ईएसएम के बिगड़ते हुए उठा कर निकालना होगा । इस प्रकार, मोल्ड एक सरल सीधे या पतला आकार तक ही सीमित है । और अधिक जटिल आकार नियंत्रण प्राप्त करने के लिए, प्रोटोकॉल के आगे विकास की जरूरत है ।

प्रस्तावित कार्यप्रणाली में व्यापक उपयोगिता है और इसे अधिकांश प्रयोगशाला परिवेशों में आसानी से संचालित किया जा सकता है । इस सरल प्रक्रिया 3 डी संस्कृति, इमेजिंग की सीमाओं को दूर कर सकते हैं, और repeatability, और आगे के विकास के लिए 3 डी संस्कृति के लिए आवश्यक योगदान करते हैं ।

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Disclosures

लेखक और ओसाका प्रीफेक्चर यूनिवर्सिटी और क्यूशू इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी ने हाइब्रिड जेल क्यूब डिवाइस के लिए पेटेंट आवेदन दायर किया है, और निप्पन मेडिकल और केमिकल इंस्ट्रूमेंट्स कंपनी लिमिटेड, जापान ने हाल ही में क्यूब का व्यावसायीकरण किया है । कंपनी ने किसी भी डिजाइन, प्रक्रिया और विधियों को प्रभावित नहीं किया ।

Acknowledgments

यह काम आर्थिक रूप से JSPS KAKENHI (18H04765) और कार्यक्रम के कार्यकाल ट्रैक प्रणाली, MEXT, जापान के प्रसार के द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plate Corning  Inc. 3513
2-Methoxy-1-methylethyl Acetate FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. 130-10505 PGMEA, CAS: 108-65-6 
4% paraformaldehyde FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. 161-20141 CAS: 30525-89-4
Agarose, low gelling temperature  BioReagent Sigma-Aldrich A9414
Alexa fluor 488 phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
AZ1512 Merck
BEGM bullet kit Lonza CC-3170 Specialized medium for NHBE cells
Bovine Serum Albumin solution (10 %) Sigma-Aldrich A1595
EGM-2 bullet kit Lonza CC-3162 Specialized medium for endothelial cells
Lipidure NOF co. MPC polymer
Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix Corning  Inc. 354230
Normal Goat Serum (10%) Thermo Fisher Scientific 50197Z
Normal human bronchial epithelial cells Lonza CC-2541
SILPOT 184 W/C Dow Corning Co. 3255981 Base resin and catalyst for PDMS
SUEX D300 DJ MicroLaminates, Inc Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)
Triton X-100 (1%) Thermo Fisher Scientific HFH10
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416

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References

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Bioengineering मुद्दा १४५ 3 डी नियंत्रण 3 डी संस्कृति विट्रो प्रयोग में पैटर्न गठन airway शाखाओं बहु-दिशात्मक इमेजिंग
Repeatable पैटर्न संरचनाओं के लिए एक संकर जेल घन डिवाइस में प्रारंभिक 3 डी सेल क्लस्टर नियंत्रण
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Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara,… More

Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations. J. Vis. Exp. (145), e59214, doi:10.3791/59214 (2019).

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