Summary
우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.
Abstract
생체 외에서 3D 문화의 중요성은 세포/조직 문화에 상당히 강조 했다. 그러나, 실험적인 반복성의 부족의 제한 중 하나입니다. 패턴 형성의 몇 반복 결과 악화 자기 조직 기본 메커니즘의 분석. 셀 밀도 등은 세포 외 기질 (ECM)에 배포 초기 문화 조건에 변화를 줄이는 것은 3D 문화의 반복성을 향상 시키기 위해 중요 한. 이 문서에서는 높은 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 간단 하지만 강력한 절차를 설명 합니다. 원하는 모양으로 micromold 사진 평판 또는 머시닝 프로세스를 사용 하 여 조립 되었다 그리고 그것은 하이브리드 젤 큐브 (HGC)에 포함 된 ECM에서 3D 포켓을 형성. 셀 클러스터 모양이 조작된 형 모양으로 일치 되도록 농축된 셀 했다 다음 주머니에 주입 됩니다. 고용된 HGC 허용 다 방향 회전, 저 배율 렌즈를 사용 하더라도 고해상도 이미징 및 전체 조직 구조의 캡처를 사용 하도록 설정 하 여 검색. 정상적인 인간의 기관지 상피 세포는 방법론을 설명 하기 위해 사용 되었다.
Introduction
2D 문화 보다 더 나은 생물 환경 모방, 3D 문화의 중요성은 세포/조직 문화1,2,3에 상당히 강조 했다. 세포와 세포 외 기질 (ECM) 간의 상호 작용 morphogenesis4,5에 관한 중요 한 단서를 제공합니다. 많은 조직 형성 접는 과정6,7, invagination8, 관 형성9,10등 3D 환경 아래 에서만 나타날 수 있습니다. 그러나, 수많은 어려움 2D 실험에서 3D 실험 접시에 이동에서 연구원을 방지 합니다. 3D 실험에 큰 어려움 중 하나는 이미징 3D 샘플 문제입니다. 평면 실험에 비해, 적절 한 3D 이미지의 수집 아직도 많은 경우에 도전 이다. 특히, 적절 한 3D 이미지를 얻는 때 어려운 작업 샘플 크기 때문에 낮은 확대 렌즈의 큰 초점 깊이 밀리미터 범위에 도달. 단일 셀의 크기는 일반적으로 10 µ m 10 배 확대 렌즈를 사용할 때 예를 들어 초점 깊이 50 µ m에 도달 합니다. 이미지 품질을 향상 시키기 위해, 높은-기술 현미경 시스템 개발 되 고 있다 (예를 들어, 두 광자 현미경11 및 빛 시트 현미경 시스템12), 하지만 그들의 가용성 때문에 그들의 비싼 가격 제한 됩니다. 대신, 우리는 이전 하이브리드 젤 큐브 (HGC) 장치13를 개발 했습니다. 장치 hydrogels 두 가지 유형의 구성: 지원 젤과 콜라겐 등 ECM 또는 문화 젤으로 Matrigel agarose. HGC는 경작 하는 동안 샘플을 수집 하 고14의 초점 깊이 문제 해결 하는 다 방향 영상을 달성 하기 위해 큐브를 회전 수 있습니다.
3D 실험에서 또 다른 어려움은 그들의 낮은 반복성 3D 환경의 가난한 제어력 때문 이다. 플라스틱 접시에 평면 문화와 달리 초기 문화 조건에 변화는 쉽게 부드러운 소재에 의해 포위 하는 3D 공간에서 발생 합니다. 실험 결과에 중요 한 변화 악화 다음 분석 하 고 근본적인 메커니즘을 마스크. 많은 공학 기술 공간 bioprinting15,16,17과 비 계18, 섬유와 같은 단일 셀에 맞게 개발 되었습니다 하지만 그들은 복잡 한 전처리 필요 하거나 특별히 설계 된 장비입니다. 반면, 우리 HGC19에서 3D 셀 맞춤을 달성 하기 위한 방법론을 개발 했습니다.
이 프로토콜에서 우리는 HGC에 3D 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 일반적으로 사용된 하는 장비와 간단한 절차 설명. 첫째, HGC는의 제작 과정을 시연 했다. 다음, 사진 평판 또는 가공 공정에 의해 조작 하는 micromolds는 ECM에서 임의의 모양 가진 주머니 생산 HGC에 배치 했다. 그 후, 원심 분리 후 고집적 세포는 HGC에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하는 주머니에 주입 했다. 정확 하 게 제어 셀 클러스터는 HGC 때문에 여러 방향에서 몇 군데 될 수 있습니다. 정상적인 인간의 기관지 상피 (NHBE) 세포 이미징 품질 향상을 위한 여러 방향에서 초기 셀 클러스터 모양 제어 및 이미징의 보여 주기 위해 사용 되었다.
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Protocol
1입니다. 하이브리드 젤 큐브 장치 제조
- 폴 리카 보 네이트 (PC) 큐빅 프레임 가공 공정 또는 3D 프린터를 사용 하 여 준비 합니다. PC 프레임의 크기는 샘플의 크기에 따라 달라 집니다. 이 연구에서 우리가 사용 5mm의 프레임 양쪽에 분기 했다 경작 하는 동안 길게 하기에 충분 한 공간.
- 사전 냉각된 유리 슬라이드 또는 얼음 상자에 다른 부드러운 표면에 PC 프레임을 배치 (< 0 ° C) (그림 1A).
- 피 펫과 아래쪽 표면에 큐빅 프레임의 상단 면에서 미리가 열된 1.5 %agarose (w/v)의 12 µ L를 추가 합니다. 평평한 표면 (그림 1B)를 만드는 데는 agarose 확산을 피펫으로 뇌졸중.
- 분 내는 agarose 완 치 될 것입니다. 핀셋을 사용 하 여 유리 슬라이드의 가장자리에 그것을 밀어서 PC 프레임을 선택 합니다. 참고는 수직 유리 슬라이드에서 프레임을 따기는 agarose 및 유리 슬라이드 (그림 1C) 사이의 접착 력 때문에 입방 프레임에서 agarose의 분리에 발생할 수 있습니다.
- 큐빅 프레임, 오픈 얼굴을 확인 하 고 다음 다시 (그림 1D) 유리 슬라이드에 장소를 회전 합니다.
- 1.3-1.5 단계를 반복 하 여 3 개의 표면 agarose (그림 1E)으로 가득 차 있습니다.
- 네 번째 및 다섯 번째 면에는 agarose 벽을 형성 하는 오픈 페이스 (그림 1 층)에서 사용는 agarose을 드롭. Agarose 벽은 다섯 번째 얼굴에 형성 하 고, 일단은 HGC 준비 완료 됩니다.
2. 사진 평판 또는 가공 공정에 의해 micromolds의 제조
- 사진 평판으로 제조
- 클린 아세톤, 이소프로필 알코올 (IPA)와 초음파 청소를 통해 실리콘 (Si) 웨이퍼 다음 증류수 (디) 각 5 분. 질소 질소로 Si 웨이퍼를 불고, 후 오븐에서 20 분 (그림 2A(i)) 동안 140 ° C에 탈수.
- 스핀 코트 LOR Az 등 희생 층 Si 웨이퍼에 저항 (2000 rpm, 30 s) 노란 조명 아래에서 spin coater를 사용 하 여. 스핀 코팅 후 즉시 3 분 (그림 2A(ii)) 동안 90 ° C에 뜨거운 접시에 웨이퍼를 열. 희생 층의 원하는 두께 리프트 과정을 수행할 수 있습니다 쉽게, 하지만 정확한 두께 필요 이상의 1 µ m를.
- 70 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓고 핸드 롤러 (그림 2A(iii))를 사용 하 여 희생 레이어에 원하는 두께가 두꺼운 부정적인 감광 시트를 라미네이트
- 박판, 후 5 분 자외선 노출에 대 한 마스크 aligner에 웨이퍼를 놓습니다. 시트 저항에 원하는 패턴으로 포토 마스크를 설정 하 고 적절 한 시간 동안 자외선과 노출. 노출 시간 감광 제 두께 UV 빛의 강도 의해 결정 됩니다. 그 후, 10 분 (그림 2A(iv))에 대 한 90 ° C에서 굽기 다음 5 분 동안 60 ° C에서 사후 노출 빵에 대 한 뜨거운 접시에 웨이퍼를 배치
- 노출 되지 않은 지역 (약 20 분)를 완전히 해산 될 때까지 프로필 렌 글리콜 monomethyl 에테르 아세테이트 (PGMEA)에 웨이퍼를 immersing 하 여 부정적인 감광 제를 개발 (그림 2A(v)).
- 리프트 오프는 미세 초음파 청소를 위한 IPA를 사용 하 여 희생 층을 분해. 미세 웨이퍼에서 벗는, 일단 10 분 (그림 2A(vi))에 대 한 초음파 청소 하 여 디 물으로 씻어.
- 완전히 밖으로 건조 상 온 (약 20 ℃)에서 30 분 동안 MPC 폴리머의 30 µ L에서 금형을 담가. 그림 2B 조작된 프리즘 형을 보여줍니다.
- 실린더 형의 제작
- 원하는 크기와 강철 실린더 형 머시닝 프로세스에 의해 조작. 또는 사용 하는 상용 스테인리스. (본이 연구에서는 φ 600 µ m 실린더 사용 됩니다.)
- 완전히 밖으로 건조 상 온 (약 20 ℃)에서 30 분 동안 MPC 폴리머의 30 µ L의 실린더 스틸을 담가.
- 기본 수 지와 그것의 촉매를 혼합 하 여 액체입니다 (PDMS)를 준비 ( 재료의 표참조) 20 분 동안 시스템을 degassing 진공 기체 제거 다음 10:1 비율에서. 다음 12 잘 판에는 PDMS를 붓는 다.
- 설정 강철 실린더 데이텀 표면에 수직 하 고 고정 선형 z 단계를 12-잘-접시 z 단계를 이동 하 여 동일한 데이텀 표면에 배치 uncured PDMS 표면에 수직으로 삽입 될 수 있다. 치료를 위한 90 ° C에서 20 분 동안 오븐에 실린더 강철 PDMS를 품 어. PDMS는 피펫으로 다음 과정 (그림 2C)에 삽입 될 수 있도록 측면 서피스를 잘라.
3. 제어는 히드로에서 초기 셀 클러스터 모양을
- 문화 공간 (그림 3A)을 채우기 위해 HGC에 콜라겐 등 인공 지하실 막, 원하는 세포 배양에 대 한 적절 한 ECM를 삽입할.
- 설정 조작된 micromold는 HGC에 직접 또는 간접적으로 적절 한 홀더를 가진 그림 3B와 같이. 그 후, 그것을 치료에 대 한 37 ° C에서 25 분 CO2 배양 기에는 HGC를 놓습니다.
- ECM (그림 3C)을 악화 하지 않는다 그래야는 micromold 밖으로 조심 스럽게 들어올립니다. 주머니, 원하는 형 모양으로 것 이다 날조 될 ECM에.
- 트립 신-EDTA 또는 세포 유형에 따라 그에 상응 하 여 배양된 접시에서 세포를 수확. 그 후, 원심 농축된 세포를 세포 (NHBE 문화, 0.25 %trypsin-EDTA 적용 및 셀 3 분 동안 품 어 다음 매체 FBS를 포함 하 고 4 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuging와 중화).
- Centrifuging, 후 셀, 압축 하는 표면에 뜨는 매체를 제거 하 고 ECM (그림 3D)에 있는 주머니에 매우 집중된 셀 (3.0 × 104 셀 / µ L NHBE 세포에 대 한)를 주입 합니다.
- 세포는 micromolds에 의해 만들어진 공간을 채우기 위해 ECM 주머니에 대비한 37 ° C에서 20 분 CO2 배양 기에 셀 HGC를 품 어. 과도 한 매체 또는 셀 위쪽 표면에 존재 하는 경우 신중 하 게는 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.
- 24 잘 판에는 HGC를 놓고 적절 한 매체 (그림 3E)의 100 µ L를 추가 합니다. NHBE 세포에 대 한 상용 전문된 매체의 1:1 혼합물을 사용 하 여 NHBE 및 내 피 세포 ( 재료의 표참조).
- 주사는 ECM에 주머니를 닫고 다음 25 분 동안 37 ° C에서 품 어 추가 ECM.
- 실내 온도 (대략 20 ° C)에 preheated 1.5 %agarose 식혀. 약 10 µ L 표면을 경작 하 고 (그림 3 층) 이미징 동안에 HGC 떨어지는에서 ECM을 방지 HGC의 위쪽 표면에 agarose의 드롭. 그런 다음 치료는 agarose를 37 ° C에서 또 다른 20 분 HGC를 품 어.
- 삼투성 압력에 HGC 내부 세포에 영양을 제공 하 수 있도록 전체 HGC 커버를 추가 합니다.
4. 다 방향 영상
- 다 방향 관측에 의해 비-침략 적 3 차원 형상 인식
- 문화 접시 또는 잘 접시 포함 하는 현미경에 HGC 놓고 카메라 프레임에 HGC 방향을 지정 합니다. 그런 다음, 밝은 분야 또는 단계 대비 하 여 샘플 이미지를 얻을.
- 선택 하 고 아래로 다른 서피스를 HGC 회전.
- 4.1.1와 4.1.2 단계를 반복 하 여 모든 6 개 사이드 로부터 이미지를 얻을 수 있습니다.
- 다 방향 관측 하 여 면역 형광 이미징
- 고정, 적용 4 %paraformaldehyde 샘플에 실내 온도 (대략 20 ° C)에 HGC 이상 20 분, 10 분에 대 한 PBS의 두 린스 다음.
- PBS 가진 HGC permeabilize 4 ° C에서 10 분에 대 한 Triton X-100 다음 PBS 가진 10 분 동안 3 배 세척 0.5% 포함 된.
- 만약 버퍼에 10% 염소 혈 청으로 HGC를 품 어 (0.2% 트라이 톤 X-100, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 및 0.05 %PBS 트윈-20) 기본 차단 단계에 대 한 실 온에서 60 분에 대 한.
- 특정 분자의 얼룩에 대 한 적절 한 항 체를 사용 합니다. 관찰 하기 위해 집단 셀 형상, 알 렉 사 Fluor 488 Phalloidin 말라 얼룩을 사용할 수 있습니다.
- 레이저 또는 형광 현미경 유리 하단 접시에는 HGC를 놓고 전체 샘플 이미지를 얻기 위해 6 측면에서 검색을 수행 합니다.
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Representative Results
정상적인 인간의 기관지 상피 (NHBE) 셀 그림된 방법론을 설명 하 고 실린더 모양 및 ECM 환경에서 각각 프리즘 모양 초기 집단 셀 형상을 제어 하 사용 되었다. 단계 대조로 phalloidin 실린더 모양 (그림 4AB)와 (그림 4CD) 프리즘 모양의 얼룩 다 방향 이미징 결과 표시 됩니다. 셀은 ECM 환경에서 원하는 3D 형태를 적절 하 게 정렬 됩니다. 그 후, 세포는 4 일 특정 모양에 대 한 교양 되었고 다 방향 영상에 의해 분석 되었다. 큰 샘플 크기 어려운 꽤 한 방향;에서 전체 조직 이미지 그러나, HGC는 전체 조직 모양을 드러내는 영상 최대 6 개의 측면에서 허용. 그림 5 는 NHBE 세포에서 개발 기관지 나무의 immunostaining 결과 보여 줍니다. NHBE 셀 처음에 HGC에 원통 모양에 통제 되었다. 다음, 대부분의 원통형 축에 수직으로 지시 했다.
그림 1: 하이브리드 젤 큐브 소자의 제조 공정. 폴 리 카보 네이트 큐빅 프레임 precooled 얼음 상자에 설정 (A). (B) Agarose (1.5%) 바닥 표면에 주입 됩니다. (C)는 큐브를 수집 올랐다는. (D)는 큐브 다운 또 다른 표면 수 있도록 회전 합니다. (E) Agarose (1.5%) 또 다른 agarose 벽을 형성 하기 위하여 주사 된다. (F) agarose 오픈 얼굴을 통해 주입 후 agarose 벽 3 면에 대 한 생산. 눈금 막대: 5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: micromolds의 제조 공정. (A) 제조 포토 리소 그래피에 의해 micromold의 프로세스. (B) 포토 리소 그래피에 의해 조작된 프리즘 모양 micromold의 완전 한 형태. (C) micromold 실린더 강철 날조. 스케일 바: (B) 2 m m, (C) 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 초기 셀 클러스터 제어의 제조 공정. (A) ECM (예를 들어, 콜라겐과 Matrigel)는 HGC 주입. (B)는 micromold 또는 홀더 없이 큐빅 프레임에 설정 됩니다. (C) ECM 후 치료, micromold는 제거 됩니다. (D) centrifuging, 고집적 세포를 주입 하 여 인 큐베이 팅 후. (E) 매체 적용 됩니다. (F) 추가 ECM agarose 뒤는 HGC의 상단 표면을 커버 하 주입 됩니다. 눈금 막대: 5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 초기 셀의 결과 NHBE 세포와 제어. (A) 아래와 옆 표면에 대 한 원통 제어 NHBE 셀의 위상 대조 이미지. 전체 셰이프 형광 이미징 필요 없이 다 방향 관측에 의해 인식 될 수 있습니다. (B) 원통 제어 NHBE 셀 F 말라 얼룩의 형광 이미지. (C)는 NHBE의 단계 대조 이미지 하단 및 측면 표면에서 캡처한 삼각형 프리즘 모양에서 제어 하는 셀. (D)는 삼각형 프리즘 모양에서 제어 NHBE 셀의 형광 이미지. 눈금 막대: 100 µ m. 10 배 확대 렌즈 (0.3 숫자 조리개)는 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 다 방향 검색 하 여 캡처한 형광 이미지를 예상. NHBE 셀 처음 원통형 모양을 생산 하 고 4 일 동안에 HGC에서 경작. 그 후, 말라 했다 phalloidin에 의해 얼룩이 진다. 지점에서 x 축 초기 실린더에서 길쭉한 했다 그리고 길이, 크기, 그리고 각 축에서 동일 하 게 개발 되었다. 낮은 오른쪽 이미지는 x-y-z 축과 샘플 모양의 회로도 보여준다. 눈금 막대: 100 µ m. 10 배 확대 렌즈 (0.3 숫자 조리개) 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 문서에 소개 된 방법은 간단 하 고 높은-기술 장비 없이 수행할 수 있습니다. 동시에, 히드로의 3D 공간에서 정확한 셀 클러스터 모양을 제어 결과 얻을 수 있습니다. 초기 제어 후 셀 만큼 그들은 접시에 교양으로 HGC에서 성장할 수 있다. 다 방향 영상 HGC 어떤 현미경 시스템을 사용 하 여 함께 샘플을 회전 하 여 수행 되 고 크게 이미징 품질을 향상 시킵니다. HGC 프레임 및 micromold에 대 한 자료의 선택은 그들은 생체로 서 유연한입니다. 3D 프린터의 정확도 그들의 응용 프로그램에 대 한 충분 한 경우 HGC 프레임 또는 micromold를 생산 하는 3 차원 프린터를 사용할 수 있습니다. 제안된 된 방법 투명도 약20,21 및 빛 시트 현미경 시스템 등의 기술을 강화 하는 많은 이미지와 호환 됩니다. 이러한 기술을 채용 하 여 이미지 품질을 개선할 수 있습니다.
주입 하는 agarose, ECM, 및 고집적 셀의 볼륨 HGC 및 금형 크기에 따라 달라 집니다. 공기 방울을 주입 하지 않는 주의 수동 작업은 필요한, 그렇지 않으면 거품 형성 제어, 세포 성장, 및 이미징 품질의 정확성을 저하 됩니다.
micromolds의 제조 공정 제어를 원하는 모양에 의해 결정 됩니다. 사진 평판 수 마이크로미터;의 순서는 프리즘 모양 등 특정 깊이와 정확한 2D 도형 제작 그러나, 실린더 등 3D 도형으로 효과적입니다. 머시닝 프로세스 3D 형태를 조작 수 있습니다 하지만 일반적 차원 정확도 사진 평판 보다 낮은. 후에 micromolds의 제조, 금형에 2 methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) 폴리머의 코팅 ECM에 접착을 방지 하기 위해 필요 합니다.
HGC는를 이용 하 여 현미경 이미징 또는 레이저 노출 없이 여러 방향에서 수행할 수 있습니다. 3D 샘플 모양 인식 될 수 있다 약 다 방향 관측에 의해 형광 라벨; 없이 이 메서드는 관찰 하는 동안 어떤 셀 침해를 발생 하지 않습니다. 반면, 형광 이미징이 보다 정확한 3D 샘플 모양과 분자 식을 얻기 위해 필요 합니다.
초기 셀 컨트롤에 대 한 제시 방법의 제약은 복잡 한 3 차원 형상으로 몰드에 적용할 수 없습니다. 형은 ECM 악화 없이 선택 하 여 제거할 수 있다. 따라서, 금형 간단한 직선 또는 테이퍼 모양에 제한 됩니다. 더 복잡 한 모양 제어를 얻기 위해 추가 프로토콜의 개발은 필요 하다.
제안 된 방법론 광범위 한 유틸리티 있으며 대부분의 실험실 환경에서 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 간단한 절차는 3D 문화, 이미징, 및 반복성의 한계를 극복 하 고 3 차원 문화에 필요한 추가 개발을 수 있습니다.
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Disclosures
저자와 오사카 부립 대학 규슈 공업 대학교 하이브리드 젤 큐브 장치, 그리고 일본 의료 및 화학 기기 (주)에 대 한 특허 출원을 신청한, 일본 최근 큐브를 상용화 했다. 회사는 디자인, 프로세스 및 기술 된 방법의 영향을 주지 않았다.
Acknowledgments
이 작품은 JSP KAKENHI (18 H 04765) 및 임기 추적 시스템 보급, 문 부 과학성, 일본 프로그램에 의해 재정적으로 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
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