Summary
نحن نقدم إجراءات للتحكم في شكل كتلة الخلية الأولى في مصفوفة 3D خارج الخلية للحصول على تشكيل نمط تكرار. ويستخدم جهاز مكعب الذي يحتوي على اثنين من الهلاميات المائية المختلفة تحقيقا للتصوير المتعدد الاتجاهات لتشكيل نمط الأنسجة.
Abstract
إلى حد كبير هو التأكيد على أهمية الثقافات 3D في المختبر في زراعة الخلية/الأنسجة. ومع ذلك، عدم التكرار تجريبية واحدة من قيودها. نتائج قابلة للتكرار قليل من تشكيل نمط تتدهور تحليل الآليات الأساسية للتنظيم الذاتي. الحد من التفاوت في شروط الثقافة الأولية، مثل كثافة الخلية والتوزيع في المصفوفة خارج الخلية (ECM)، أمر حاسم لتعزيز التكرار ثقافة 3D. في هذه المقالة، نبدي إجراء بسيطة لكنها قوية للتحكم في شكل الكتلة الخلية الأولى في 3D مصفوفة خارج الخلية للحصول على تشكيلات نمط التكرار عالية. كانت مختلقة من ميكرومولد بشكل المطلوب باستخدام الطباعة الحجرية التصويرية أو عملية القطع، وأنها شكلت جيب 3D في المحتوى الوارد في مكعب هلام مختلطة (الوراثة). ثم تم حقن الخلايا مركزة للغاية في الجيب حيث أن الشكل الكتلة الخلية المتطابقة مع الشكل العفن ملفقة. الوراثة حسابهم يسمح متعددة الاتجاهات المسح بها التناوب، مما مكن تصوير عالي الدقة والقبض على هيكل الأنسجة كاملة حتى ولو كان يستخدم عدسة التكبير المنخفض. واستخدمت الخلايا الظهارية الشعب الهوائية الإنسان العادي لتبين المنهجية.
Introduction
إلى حد كبير هو التأكيد على أهمية ثقافة 3D، الذي يحاكي البيئات البيولوجية أفضل من لا ثقافة 2D، في خلية/الأنسجة الثقافة1،،من23. التفاعل بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) يوفر إشارات هامة بخصوص morphogenesis4،5. يمكن أن تظهر العديد من تشكيلات الأنسجة إلا في ظل بيئات ثلاثية الأبعاد، مثل عملية قابلة للطي6،7، إينفاجينيشن8، وتشكيل أنبوبي9،10. ومع ذلك، منع العديد من المصاعب الباحثين من التحول إلى تجارب 3D من تجارب 2D على طبق. واحدة من الصعوبات الرئيسية في تجارب 3D هو مسألة التصوير عينات ثلاثية الأبعاد. بالمقارنة مع تجارب مستو، الحصول على صور ثلاثية الأبعاد المناسبة لا تزال صعبة في كثير من الحالات. على وجه الخصوص، الحصول على صورة ثلاثية الأبعاد مناسبة مهمة صعبة عندما يصل حجم العينة مجموعة ملليمتر نظراً لعمق تركيز كبير من عدسات التكبير المنخفض. على سبيل المثال، يصل عمق التنسيق إلى أكثر من 50 ميكرومتر عندما يستخدم من 10 x عدسة التكبير بينما حجم الخلية واحد هو عادة أقل من 10 ميكرون. لتحسين نوعية التصوير، يجري تطوير نظم الفحص المجهري التكنولوجيا العالية (مثلاً، مجهرية اثنين-فوتون11 و نظام الفحص المجهري الضوء-ورقة12)، ولكن محدودة بسبب أسعارها غالية الإتاحة الخاصة بهم. وكبديل لذلك، قد سبق أن وضعت مختلطة هلام مكعب (الوراثة) جهاز13. الجهاز يتكون من نوعين من الهلاميات المائية: [اغروس] هلام دعم وإدارة المحتوى في المؤسسة مثل الكولاجين أو ماتريجيل كهلام ثقافة. الوراثة يسمح لنا بجمع العينة خلال استزراع وتدوير المكعب لتحقيق تصوير متعددة الاتجاهات، الذي يعالج مشكلة العمق البؤري14.
وهناك صعوبة أخرى في تجارب 3D هو على التكرار المنخفض نظراً لقابلية التحكم الفقراء من بيئات 3D. خلافا لثقافة المستوية في طبق بلاستيك، تحدث الاختلافات في الظروف الأولية الثقافة بسهولة في الفضاء 3D محاطة بمادة ناعمة. تباين كبير في النتائج التجريبية تتدهور التحليل التالي وأقنعة الآليات الكامنة. وقد وضعت العديد من التقنيات الهندسية مكانياً محاذاة الخلايا المفردة، مثل بيوبرينتينج،من1516، ألياف النسيج17و18من السقالات، ولكنها تتطلب تجهيزها معقدة أو على وجه التحديد معدات مصممة. وفي المقابل، قمنا بتطوير منهجية لتحقيق المحاذاة لخلية ثلاثية الأبعاد في الوراثة19.
في هذا البروتوكول، يتضح أننا إجراء بسيط مع المعدات المستخدمة عادة للتحكم في الشكل الكتلة الخلية الأولى ثلاثية الأبعاد في الوراثة. أولاً، قد أظهرت عملية التصنيع الوراثة. ثم وضعت ميكرومولدس ملفقة بالطباعة الحجرية التصويرية أو عملية القطع في الوراثة لإنتاج جيب بشكل تعسفي في إدارة المحتوى في المؤسسة. لاحقاً، تم حقن الخلايا عالية الكثافة بعد الطرد المركزي في الجيب للتحكم في شكل الكتلة الخلية الأولى في الوراثة. يمكن تصويرها الكتلة الخلية التي تسيطر عليها تحديداً من اتجاهات عديدة بسبب الوراثة. واستخدمت العادي البشرية الشعب الهوائية (نهبي) الخلايا الظهارية لإثبات السيطرة على شكل كتلة الخلية الأولى والتصوير من الفروع من اتجاهات متعددة لتعزيز نوعية التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تصنيع الجهاز المكعب هلام المختلطة
- إعداد إطار مكعب البولي (PC) أما باستخدام عملية القطع أو طابعة 3D. حجم الإطار جهاز الكمبيوتر يعتمد على حجم العينة. في هذه الدراسة، استخدمنا إطار 5 مم على كل جانب حتى أن كانت الفروع مساحة كافية تمديد خلال استزراع.
- وضع إطار الكمبيوتر على شريحة زجاجية يبرد قبل أو سطح أملس آخر في مربع جليد (< 0 درجة مئوية) (الشكل 1A).
- إضافة 12 ميليلتر من قبل ساخنة 1.5% [اغروس] (w/v) من الوجه العلوي من الإطار مكعب إلى السطح السفلي مع ماصة. السكتة الدماغية الماصة حيث أنه ينتشر [اغروس] لإنشاء سطح مستو (الشكل 1B).
- في غضون دقائق، سوف يمكن علاجه [اغروس]. التقاط الإطار الكمبيوتر بتحريكه إلى حافة الشريحة الزجاجية باستخدام الملقط. علما أن عمودياً التقاط الإطار من الشريحة الزجاجية قد تؤدي إلى فصل من [اغروس] من الإطار مكعب نظراً لقوة لاصقة [اغروس] بين الشريحة الزجاجية (الشكل 1).
- استدارة الإطار مكعب جعل الوجه المفتوحة إلى أسفل، ومن ثم ضع على الشريحة الزجاجية مرة أخرى (الشكل 1).
- كرر الخطوات من 1.3 – 1.5 حتى تمتلئ ثلاثة أسطح [اغروس] (الشكل 1E).
- تشكيل جدار [اغروس] على وجوه الرابع والخامس، إسقاط [اغروس] من على وجه مفتوحة (الشكل 1F). حالما يتم تشكيل جدار [اغروس] على الوجه الخامس، الانتهاء من إعداد الوراثة.
2-تلفيق ميكرومولدس التصويرية أو عملية القطع
- تصنيع بالطباعة التصويرية
- تنظيف المقطر رقاقة سيليكون (Si) عن طريق تنظيف بالموجات فوق الصوتية مع الأسيتون، الكحول الأيزوبروبيل (IPA)، ثم المياه (DI) لمدة 5 دقائق. بعد النيتروجين تهب يفر Si مع النيتروجين، يذوي في فرن على 140 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (الشكل 2A(ط)).
- تدور-معطف طبقة الذبيحة مثل لور ومن الألف إلى الياء يقاوم على رقاقة Si (2,000 لفة في الدقيقة، 30 s) باستخدام تدور المغطى تحت الضوء الأصفر. فور سبين-طلاء، الحرارة رقاقة على لوحة الساخن عند 90 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (الشكل 2A(الثاني)). سمك الطبقة الذبيحة المطلوب هو أكثر من 1 ميكرون حيث أنه يمكن أن يتم الرفع إيقاف العملية بسهولة، ولكن سماكة دقيقة ليس ضروريا.
- مكان يفر على صفيحة ساخنة في 70 درجة مئوية، وثم صفح ورقة سميك مقاوم الضوء سلبية مع سمك المرجوة على طبقة مضحية باستخدام بكرة يد (الشكل 2 ألف(ثالثا))
- ضع خمس دقائق بعد التصفيح، يفر على راصفة قناع للتعرض للأشعة فوق البنفسجية. تعيين النبائط مع النمط المطلوب في مقاومة ورقة وكشف بالأشعة فوق البنفسجية لمدة وقت مناسب. يتم تحديد الوقت التعرض بسمك مقاوم الضوء وكثافة الأشعة فوق البنفسجية. وفي وقت لاحق، مكان يفر على صفيحة لخبز بعد تعرض عند 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها الخبز عند 90 درجة مئوية عن 10 دقيقة (الشكل 2A(رابعا))
- تطوير مقاوم الضوء سلبية عن طريق غمر الرقاقة في البروبيلين غليكول مونوميثيل البروم ثنائي الفينيل اسيتات (بجميا) حتى منطقة لم يتعرضوا يذوب تماما (حوالي 20 دقيقة) (الشكل 2A(v)).
- حل طبقة مضحية باستخدام وكالة تشجيع الاستثمار للتنظيف بالموجات فوق الصوتية لرفع قبالة المجهرية. مرة واحدة هي انشقت المجهرية من يفر، شطف مع الماء دي بالتنظيف بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق (الشكل 2A(vi)).
- تزج العفن في 30 ميليلتر من البوليمر MPC مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية) لتجف عليه تماما. ويبين الشكل 2 العفن بريزم ملفقة.
- تصنيع قالب الاسطوانة
- اختﻻق العفن اسطوانة فولاذية بالحجم المطلوب قبل عملية القطع. بدلاً من ذلك، استخدام الفولاذ المقاوم للصدأ المتاحة تجارياً. (في هذه الدراسة، اسطوانة 600 ميكرون φ هو استخدامها.)
- تزج الصلب اسطوانة في 30 ميليلتر من البوليمر MPC مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية) لتجف عليه تماما.
- تحضير السائل بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) عن طريق خلط راتنج قاعدة ومحفِّز لها (انظر الجدول للمواد) بنسبة 10:1 تليها ولﻵﻻت مع فراغ ولﻵﻻت النظام لمدة 20 دقيقة. ثم يصب PDMS 12-جيدا-طبق.
- تعيين الاسطوانة الفولاذية عمودياً على سطح القمر المنير وثابتة إلى مرحلة z خطي حيث أنه يمكن إدراج عمودياً في السطح PDMS أونكوريد في 12-جيدا--لوحة وضعت على سطح القمر المنير نفسه بتحريك z-المرحلة. احتضان PDMS مع اسطوانة الفولاذ في فرن لمدة 20 دقيقة في 90 درجة مئوية لعلاج. قطع PDMS لتشكيل سطح الجناح حيث أنه يمكن إدراجها في بيبيت في العملية التالية (الشكل 2).
3-التحكم في شكل كتلة الخلية الأولى في المائية
- حقن المحتوى مناسب لثقافة الخلايا المطلوب، مثل الكولاجين والغشاء الاصطناعي، في الوراثة لملء المساحة الثقافة (الشكل 3A).
- تعيين ميكرومولد ملفقة في الوراثة مباشرة أو غير مباشرة مع صاحب مناسبة، كما هو مبين في الشكل 3 (ب). وفي وقت لاحق، مكان الوراثة في CO2 حاضنة لمدة 25 دقيقة في 37 درجة مئوية لعلاج ذلك.
- عناية انتشال ميكرومولد حتى أن لم تتدهور إدارة المحتوى في المؤسسة (الشكل 3). سوف ملفقة الجيب، كشكل القالب المطلوب، في إدارة المحتوى في المؤسسة.
- حصاد الخلايا من طبق مثقف التربسين – يدتا أو ما يعادلها وفقا لأنواع الخلايا. في وقت لاحق، الطرد المركزي في الخلايا للحصول على خلايا عالية التركيز (لثقافة نهبي، 0.25% التربسين-يدتا واحتضان خلايا لمدة 3 دقائق، ثم تطبيق تحييد مع المتوسطة المحتوية على FBS وسينتريفوجينج في 300 x ز 4 دقيقة).
- بعد سينتريفوجينج، إزالة المتوسطة طافية لاختصار الخلايا، وحقن الخلايا عالية التركيز (× 10 3.04 خلايا/ميليلتر للخلايا نهبي) في الجيب في إدارة المحتوى المؤسسي (3D الشكل).
- احتضان الوراثة مع الخلايا في CO2 حاضنة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية حيث أن الخلايا تنقسم إلى الجيب ECM لملء المساحة التي تم إنشاؤها بواسطة ميكرومولدس. إذا المتوسطة المفرط أو خلايا موجودة على السطح العلوي، بعناية إزالة استخدام ماصة.
- وضع الوراثة على صفيحة 24 جيدا وإضافة 100 ميليلتر الوسيلة المناسبة (رقم 3E). للخلايا نهبي، استخدام خليط 1:1 من المتوسطة المتخصصة المتاحة تجارياً نهبي وخلايا بطانية (انظر الجدول للمواد).
- حقن ECM إضافية لإغلاق الجيب في إدارة المحتوى في المؤسسة ومن ثم احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
- أن تهدئة مسخن 1.5% [اغروس] إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية). قطره حوالي 10 ميليلتر من [اغروس] على السطح العلوي للوراثة لإغلاق السطح والحيلولة دون وقوع الخروج الوراثة من خلال استزراع والتصوير (3F الشكل) إدارة المحتوى في المؤسسة. ثم احتضان الوراثة لآخر 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لعلاج [اغروس].
- إضافة المتوسطة لتغطية الوراثة كاملة حيث أن الضغط الاسموزي الذي يمكن أن تساعد في توفير التغذية للخلايا داخل الوراثة.
4. تصوير متعددة الاتجاهات
- الشكل 3D الغازية عدم اعتراف المراقبة متعددة الاتجاهات
- ضع الصحن الثقافة أو جيدا صفيحة تحتوي على الوراثة في مجهر وتوجيه الوراثة إلى الإطار الكاميرا. ثم الحصول على صورة عينة مشرقة على النقيض من الحقل أو المرحلة.
- التقاط وتدوير الوراثة لوضع سطح مختلفة إلى أسفل.
- كرر الخطوتين 4.1.1 و 4.1.2 حتى يتم الحصول على صور من جميع الأطراف الستة.
- التصوير الفلورسنت المناعية بواسطة المراقبة متعددة الاتجاهات
- للتثبيت، تطبيق بارافورمالدهيد 4% للعينة عبر الوراثة في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية) على 20 دقيقة، تليها يشطف اثنين من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
- بيرميبيليزي الوراثة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5% X-100 تريتون لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، ثم يغسل x 3 لمدة 10 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الوراثة مع 10% مصل الماعز في المخزن المؤقت إذا كان (0.2% X-100 تريتون والبومين المصل البقري 0.1% و 0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني) لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لخطوة حظر الأولية.
- لتلطيخ جزيء معين، استخدام الأجسام المضادة المناسبة. لمراقبة هندسة الخلية الجماعية، يمكن استخدام "أليكسا فلور 488 فالويدين" وصمة عار أكتين.
- ضع الوراثة على طبق أسفل زجاج تحت مجهر الليزر أو الفلورسنت والقيام بالمسح من الأطراف الستة للحصول على صورة نموذج كامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
واستخدمت العادية البشرية الشعب الهوائية (نهبي) الخلايا الظهارية لتبين المنهجية مصورة والتحكم في هندسة الخلية الجماعية الأولى لتحقيق شكل اسطوانة وشكل المنشور، على التوالي في بيئة إدارة المحتوى في المؤسسة. وترد نتائج التصوير المتعدد الاتجاهات التي حصل عليها التباين المرحلة فضلا عن تلطيخ فالويدين شكل اسطوانة (الشكل 4 أ، ب) والشكل المنشور (الشكل 4، د). يتم محاذاة الخلايا تأهيلاً مناسباً تسفر عن الشكل الثلاثي الأبعاد المطلوبة في بيئة إدارة المحتوى في المؤسسة. وفي وقت لاحق، الخلايا مثقف لمدة أربعة أيام لتشكيل شكل معين وثم تم تحليلها بواسطة تصوير متعددة الاتجاهات. حجم العينة كبير يجعل من الصعب جداً لالتقاط صورة نسيج كامل من اتجاه واحد؛ إلا أنه يسمح الوراثة التصوير من الجانبين يصل إلى ستة، والكشف عن شكل النسيج كله. يبين الشكل 5 نتائج immunostaining شجرة الشعب الهوائية المتقدمة من الخلايا نهبي. الخلايا نهبي في البداية تسيطر على شكل أسطواني في الوراثة. ثم، كانت معظم الفروع الموجه عمودي على محور أسطواني.
رقم 1: عملية تصنيع جهاز المكعب هلام المختلطة- (أ) يتم تعيين الإطار مكعب البولي في مربع بريكوليد جليد. (ب) [اغروس] (1.5%) يتم حقن لتغطية السطح السفلي. (ج) المكعب هو انزلق التي سيتم جمعها. (د) المكعب استدارة لجعل سطح آخر إلى أسفل. (ﻫ) [اغروس] (1.5%) يتم حقن بشكل آخر [اغروس] الجدار. (و) بعد أن يتم إنتاج جدار [اغروس] لثلاثة وجوه، يتم حقن [اغروس] من خلال مواجهة مفتوحة. شريط الحجم: 5 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: عملية تصنيع ميكرومولدس. (أ) تلفيق عملية ميكرومولد واسطة التصويرية. (ب) نموذج كامل ميكرومولد الشكل المنشور ملفقة بالطباعة الحجرية التصويرية. (ج) ملفقة ميكرومولد مع اسطوانة الصلب. شريط المقياس: (ب) 2 مم، (ج) 10 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عملية التصنيع من التحكم الكتلة الخلية الأولى. (أ) إدارة المحتوى المؤسسي (مثل الكولاجين وماتريجيل) يحقن الوراثة. (ب) يتم تعيين ميكرومولد على الإطار مكعب مع أو بدون حامل. (ج) بعد ECM علاجه، تتم إزالة في ميكرومولد. (د) بعد حقن الخلايا سينتريفوجينج، والكثافة العالية والمحتضنة. يتم تطبيق المتوسطة (E). يتم حقن ECM إضافية (F) تليها [اغروس] لتغطية السطح العلوي للوراثة. شريط الحجم: 5 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التحكم في نتائج الخلية الأولى مع خلايا نهبي. (أ) الصور المرحلة-على النقيض من الخلايا نهبي] التي تسيطر عليها اتخاذها للسطح السفلي والجانبية. الشكل بأكمله يمكن أن تعترف بالمراقبة متعددة الاتجاهات دون الحاجة إلى التصوير الفلورسنت. (ب) الصور Fluorescence الخلايا نهبي] التي تسيطر عليها تلطيخ واكتين. (ج) صور المرحلة-على النقيض من نهبي الخلايا التي تسيطر في شكل المنشور ثلاثي تم التقاطها من السطوح السفلي والجانبية. (د) الصور Fluorescence نهبي الخلايا التي تسيطر في شكل المنشور ثلاثي. شريط الحجم: 100 ميكرومتر. 10 x عدسة التكبير (الفتحة العددية 0.3) تم استخدامه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: إسقاطات نيون الصور التي تم التقاطها عن طريق مسح متعددة الاتجاهات. في البداية كانت الخلايا نهبي الخاضعة لإنتاج شكل أسطواني ومثقف في الوراثة لمدة 4 أيام. وفي وقت لاحق، كان الملون أكتين من فالويدين. كانت ممدود الفروع من الاسطوانة الأولى على طول المحور س، والطول، والحجم، والزاوية من المحور ووضعت على قدم المساواة. تظهر الصورة اليمنى السفلي التخطيطي للمحور x-y-z والشكل عينة. شريط الحجم: 100 ميكرومتر. واستخدمت 10 x عدسة التكبير (0.3 الفتحة العددية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة المعروضة في هذه الورقة هو بسيط ويمكن أن يؤديها دون معدات التكنولوجيا العالية. وفي الوقت نفسه، يمكن الحصول على نتيجة عنصر تحكم شكل كتلة خلية دقيقة في الفضاء ثلاثي الأبعاد للمائية. بعد مراقبة أولية، يمكن أن تنمو الخلايا في الوراثة قدر ما هم مثقف على طبق. يتم إجراء تصوير متعددة الاتجاهات بواسطة تدوير العينة بالوراثة استخدام أي نظام الفحص المجهري، وأنه يعزز إلى حد كبير نوعية التصوير. اختيار المواد للإطار الوراثة وميكرومولد مرونة طالما هم متوافق حيويا. يمكن استخدام طابعة 3D لإنتاج الإطار الوراثة أو ميكرومولد إذا كانت دقة الطابعة ثلاثية الأبعاد كافية للتطبيقات الخاصة بهم. الطريقة المقترحة متوافق مع العديد من الصور تعزيز تكنولوجيات مثل الشفافية الكواشف20،21 وورقه الضوء أنظمة الفحص المجهري. عن طريق استخدام هذه التكنولوجيات، ويمكن تحسين جودة الصورة.
وحدة التخزين [اغروس] وإدارة المحتوى في المؤسسة، والخلايا عالية الكثافة بالحقن يعتمد على حجم الوراثة والعفن. مطلوب عملية يدوية حذراً لا حقن فقاعات الهواء، وإلا سوف تتدهور الفقاعات تشكلت دقة التحكم ونمو الخلايا، ونوعية التصوير.
سوف تحدده عملية تصنيع ميكرومولدس الشكل المطلوب لعنصر التحكم. الطباعة التصويرية يمكن تلفيق للأشكال ثنائية الأبعاد الدقيقة بعمق معين، مثل شكل المنشور يقارب ميكرومتر؛ بيد أنها ليست فعالة مع الأشكال ثلاثية الأبعاد، مثل اسطوانة. عملية التشغيل الميكانيكي يسمح لنا باختلاق الشكل الثلاثي الأبعاد، ولكن بشكل عام، دقة الأبعاد أقل من التصويرية. بعد تلفيق ميكرومولدس، مطلوب طلاء البوليمر فوسفوريلتشوليني (MPC) 2-ميثاكريلويلوكسيثيل على القوالب لمنع التصاق المعني إدارة المحتوى في المؤسسة.
وبالاستفادة من الوراثة، يمكن إجراء تصوير مجهرية مع أو بدون التعرض لليزر في اتجاهات متعددة. يمكن الاعتراف شكل نموذج ثلاثي الأبعاد تقريبا بالمراقبة متعددة الاتجاهات دون وضع العلامات الفلورية؛ هذا الأسلوب لا يسبب أي اختزاع الخلية أثناء المراقبة. وفي المقابل، التصوير الفلورسنت مطلوب للحصول على الشكل نموذج ثلاثي الأبعاد أكثر دقة والتعبير الجزيئي.
قيد طريقة عرض لمراقبة الخلية الأولى أنه لا يمكن تطبيق إلى قالب بشكل ثلاثي الأبعاد معقدة. وقد القالب المراد إزالتها عن طريق التقاط دون تدهور إدارة المحتوى في المؤسسة. وهكذا، العفن محدودة بشكل مستقيم أو مدبب بسيطة. للحصول على عنصر تحكم الشكل أكثر تعقيداً، ثمة حاجة إلى تطوير البروتوكول كذلك.
المنهجية المقترحة لها فائدة واسعة النطاق، ويمكن أن تجري بسهولة في معظم بيئات المختبرات. هذا الإجراء بسيط يمكن التغلب على قيود الثقافة ثلاثية الأبعاد، والتصوير، والتكرار، والمساهمة في تنمية إضافية المطلوبة للثقافة 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفون وجامعة محافظة أوساكا ومعهد كيوشو للتكنولوجيا قد قدم طلب براءة للجهاز المكعب هلام المختلطة، ونيبون الطبية والكيميائية المحدودة للصكوك، وقد يسوق اليابان مؤخرا المكعب. الشركة لم يؤثر أي من تصميم وعملية، والأساليب المذكورة.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها ماليا JSPS كاكينهي (ح 18 04765) وبرنامج لنشر نظام المسار الحيازة، يأمرون، واليابان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
- Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
- Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
- Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
- Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
