Summary
Apresentamos um procedimento para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter uma formação de padrão repetitivo. Um dispositivo cúbico contendo dois diferentes hidrogel é empregado para conseguir imagens multi-direcional para formação de padrão de tecido.
Abstract
A importância das culturas in vitro de 3D é consideravelmente enfatizada em cultura de células/tecidos. No entanto, a falta de reprodutibilidade experimental é uma das suas restrições. Produzir alguns resultados reproduzíveis de formação padrão deteriora-se a análise dos mecanismos subjacentes a auto-organização. Reduzir a variação em condições de cultura inicial, tais como a densidade celular e distribuição na matriz extracelular (ECM), é crucial para melhorar a repetibilidade de uma cultura 3D. Neste artigo, vamos demonstrar um procedimento simples mas eficiente para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter formações padrão altamente repetitivo. Um micromold com uma forma desejada foi fabricado usando fotolitos ou um processo de usinagem, e formou-se um bolso 3D em ECM contido em um cubo de gel de híbrido (HGC). Células altamente concentradas então foram injetadas no bolso, para que a forma de aglomerado celular combinado com a forma do molde fabricado. O trabalhador assalariado HGC permitido multi-direcional digitalização por sua rotação, o que permitiu a geração de imagens de alta resolução e captura a todo da estrutura do tecido mesmo que utilizou-se uma lente de ampliação baixa. Normais células epiteliais brônquicas humanas foram usadas para demonstrar a metodologia.
Introduction
A importância de uma cultura 3D, que melhor imita ambientes biológicos do que uma cultura 2D, é consideravelmente enfatizada em cultura de células/tecidos1,2,3. A interação entre as células e matriz extracelular (ECM) fornece pistas importantes sobre a morfogênese4,5. Muitas formações de tecido podem surgir apenas em ambientes 3D, como o dobramento processo6,7, invaginação8e formação tubular9,10. No entanto, inúmeras dificuldades impedem pesquisadores mudando a experiências 3D de experimentos 2D em um prato. Uma das principais dificuldades em experiências 3D é a questão da imagem 3D amostras. Em comparação com experimentos planares, aquisição de imagens 3D apropriadas é ainda um desafio em muitos casos. Em particular, a obtenção de uma imagem 3D é uma tarefa difícil quando o tamanho da amostra atinge o intervalo milímetros devido a grande profundidade focal das lentes de ampliação baixa. Por exemplo, a profundidade focal atinge mais de 50 µm quando uma lente de ampliação de 10x é usado enquanto o tamanho da célula única é normalmente inferior a 10 µm. Para melhorar a qualidade de imagem, sistemas de microscopia de alta tecnologia estão sendo desenvolvidos (por exemplo, dois fotões microscopia11 e sistema de microscopia de luz-folha12), mas sua disponibilidade é limitada devido ao seu preço caro. Como alternativa, temos desenvolvido anteriormente um híbrido gel de cubo (HGC) dispositivo13. O dispositivo é composto por dois tipos de hidrogel: agarose como um gel de apoio e um ECM como colágeno ou Matrigel como um gel de cultura. O HGC nos permite coletar a amostra durante o cultivo e girar o cubo para alcançar a imagem multi-direcional, que aborda o problema de profundidade focal14.
Outra dificuldade em experiências 3D é sua baixa repetibilidade devido a pobre controlabilidade dos ambientes 3D. Ao contrário de uma cultura planar sobre um prato de plástico, facilmente ocorrer variações nas condições de cultura inicial em um espaço 3D, rodeado por um material macio. Uma variação significativa nos resultados experimentais deteriora-se a seguinte análise e mascara os mecanismos subjacentes. Muitas tecnologias de engenharia têm sido desenvolvidas para alinhar espacialmente células únicas, tais como bioprinting15,16, fibra tecelagem17e andaimes18, mas eles exigem complexo pré-processamento ou especificamente equipamento projetado. Em contraste, nós desenvolvemos uma metodologia para atingir o alinhamento da célula 3D em uma HGC19.
Neste protocolo, ilustramos um procedimento simples com equipamentos comumente usados para controlar a forma de aglomerado de pilha inicial 3D em uma HGC. Demonstrou-se em primeiro lugar, o processo de fabricação do HGC. Então, micromolds fabricadas por fotolitografia ou um processo de usinagem foram colocados no HGC para produzir um bolso com uma forma arbitrária em um ECM. Posteriormente, células altamente densas após centrifugação foram injetadas no bolso para controlar a forma de aglomerado de pilha inicial no HGC. O cluster de célula precisamente controlada poderia ser fotografado partir de várias direções por causa do HGC. Normal humano brônquica (NHBE) células epiteliais foram usadas para demonstrar o controle da forma de aglomerado de pilha inicial e a imagem latente dos ramos de múltiplas direções para melhorar a qualidade de imagem.
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Protocol
1. fabricação de dispositivo de cubo híbrido gel
- Prepare um quadro cúbicos de policarbonato (PC) usando um processo de usinagem ou uma impressora 3D. O tamanho da moldura PC varia de acordo com o tamanho da amostra. Neste estudo, usamos uma moldura de 5 mm de cada lado para que os ramos tinham espaço suficiente para alongar durante o cultivo.
- Coloque o quadro de PC sobre uma lâmina de vidro previamente resfriado ou outra superfície lisa em uma caixa de gelo (< 0 ° C) (figura 1A).
- Adicione 12 µ l de pré-aquecido agarose 1,5% (p/v) da face superior do quadro cúbico para a superfície de fundo com uma pipeta. Acaricie a pipeta para que a agarose espalha-se para criar uma superfície plana (figura 1B).
- Minutos depois, a agarose vai ser curado. Buscar o quadro de PC deslizando-a para a borda do vidro slide usando uma pinça. Observe que verticalmente, pegando o quadro da lâmina de vidro pode resultar em desanexação do agarose do quadro cúbico devido a força magnética entre o agarose e a lâmina de vidro (Figura 1).
- Gire o quadro cúbico para fazer o rosto aberto para baixo e coloque sobre a lâmina de vidro novamente (Figura 1).
- Repita as etapas de 1,3-1,5 até três superfícies estão cheias de agarose (Figura 1E).
- Para formar uma parede de agarose nos quarto e quinto rostos, largue o agarose de uma face aberta (Figura 1F). Uma vez uma parede de agarose é formada na face do quinta, a preparação do HGC é concluída.
2. fabricação de micromolds por fotolitografia ou um processo de usinagem
- Fabricação por fotolitografia
- Limpar um wafer de silício (Si), através de limpeza ultra-sônica com acetona, álcool isopropílico (IPA), então (DI) água destilada por 5 min cada. Depois de nitrogênio soprando a bolacha de Si com nitrogênio, desidrata-se em um forno a 140 ° C por 20 min (Figura 2A(i)).
- Rotação-casaco uma camada sacrificial como LOR e Az resiste na bolacha de Si (2.000 rpm, 30 s) usando um aplicador-rotação sob luz amarela. Imediatamente após o giro-revestimento, aqueça a hóstia num prato aquecido a 90 ° C por 3 min (Figura 2A(ii)). A espessura desejada da camada sacrificial é mais do que 1 µm, para que o elevador fora de processo pode ser realizado facilmente, mas uma espessura exata não é necessária.
- Coloque a bolacha em um prato quente a 70 ° C e então laminado uma folha grossa fotorresiste negativo com a espessura desejada na camada sacrificial, usando um rolo de mão (Figura 2A(iii))
- Cinco minutos após a laminação, coloque a bolacha em um alinhador de máscara para exposição aos raios UV. Definir uma Fotomáscara com o padrão desejado em resistir a folha e expor com luz UV para uma duração de tempo apropriado. O tempo de exposição é determinado pela espessura do fotorresiste e a intensidade da luz UV. Posteriormente, coloque a bolacha sobre uma chapa quente para um Asse pós-exposição a 60 ° C por 5 min, seguido por cozimento a 90 ° C por 10 min. (Figura 2A(iv))
- Desenvolver um negativo fotorresiste imergindo a hóstia em propileno glicol acetato de éter monometílico (PGMEA) até que a área não exposta é completamente dissolvida (aproximadamente 20 min) (Figura 2A(v)).
- Dissolva a camada sacrificial usando IPA para limpeza ultra-sônica para decolar a microestrutura. Uma vez que a microestrutura é descascada fora de wafer, enxague com água por limpeza ultra-sônica por 10 min (Figura 2A(vi)).
- Mergulhe o molde em 30 µ l do polímero MPC durante 30 min à temperatura ambiente (cerca de 20 ° C) para secar completamente. Figura 2B mostra o molde do prisma fabricados.
- Fabricação de um molde do cilindro
- Fabrica um molde do cilindro de aço com tamanho desejado por um processo de usinagem. Como alternativa, use comercialmente disponível de aço inoxidável. (Neste estudo, um cilindro de 600 µm φ é usado.)
- Mergulhe o aço do cilindro em 30 µ l do polímero MPC durante 30 min à temperatura ambiente (cerca de 20 ° C) para secar completamente.
- Preparar o líquido polydimethylsiloxane (PDMS) através da mistura de resina de base e o catalisador (ver Tabela de materiais) na proporção de 10:1, seguida de desgaseificação com um vácuo de desgaseificação sistema por 20 min. Em seguida, despeje o PDMS em uma 12-bem-placa.
- Conjunto o cilindro de aço fixo e perpendicular à superfície de referência para uma z-fase linear para que pode ser introduzida perpendicularmente na superfície PDMS não polimerizada em uma 12--placa colocada na mesma superfície datum movendo o estágio-z. Incube o PDMS com o aço do cilindro em um forno por 20 min a 90 ° C para a cura. Corte o PDMS para formar uma superfície de flanco para que a pipeta pode ser inserida no processo de seguir (Figura 2).
3. forma de cluster inicial da célula em um hidrogel de controle
- Injete um ECM apropriado para a cultura de célula desejada, tais como colágeno e artificial da membrana basal, o HGC para preencher o espaço de cultura (Figura 3A).
- Defina o micromold fabricado sobre o HGC direta ou indiretamente com um suporte adequado, como mostrado na Figura 3B. Posteriormente, coloque o HGC numa incubadora de CO2 por 25 min a 37 ° C para curá-la.
- Cuidadosamente Retire o micromold para que o ECM não se deteriora (Figura 3). O bolso, como a forma do molde desejado, será fabricado em ECM.
- Colher células do prato cultivada por tripsina – EDTA ou seu equivalente, dependendo dos tipos de célula. Posteriormente, Centrifugar as células para obter células altamente concentradas (para cultura NHBE, aplicar 0,25% do trypsin-EDTA e incubar as células por 3 min, depois neutralizar com meio contendo FBS e centrifugação a 300 x g durante 4 min).
- Após a centrifugação, remover o sobrenadante médio para condensar as células e injetar células altamente concentradas (3,0 × 104 células / µ l de células NHBE) no bolso o ECM (Figura 3D).
- Incube a HGC com células numa incubadora de CO2 por 20 min a 37 ° C para que as células se enquadram o bolso de ECM para preencher o espaço criado pelo micromolds. Se meio excessivo ou células estão presentes na superfície superior, Retire cuidadosamente com uma pipeta.
- Coloque o HGC um 24-bem-prato e adicionar 100 µ l de meio apropriado (Figura 3E). Para as células NHBE, use uma mistura de 1:1 do meio especializado comercialmente disponível para NHBE e células endoteliais (ver Tabela de materiais).
- Injete ECM adicional para fechar o bolso em ECM e então incubar a 37 ° C por 25 min.
- Arrefecer pré-aquecido agarose 1,5% à temperatura ambiente (cerca de 20 ° C). Queda de aproximadamente 10 µ l do agarose para a superfície superior da HGC para fechar a superfície e impedir que o ECM fora o HGC durante o cultivo e a imagem (Figura 3F). Em seguida, incube o HGC por mais 20 minutos a 37 ° C para curar o agarose.
- Adicione médio para cobrir o HGC inteira para que a pressão osmótica pode ajudar no fornecimento de nutrientes para as células dentro do HGC.
4. imagem multi-direcional
- Reconhecimento de forma não-invasiva 3D pela observação multi-direcional
- Coloque o prato de cultura ou bem placa contendo o HGC em um microscópio e orientar o HGC para o quadro da câmera. Em seguida, obter uma imagem de exemplo de contraste de fase ou campo brilhante.
- Pegar e rodar o HGC para colocar uma superfície diferente para baixo.
- Repita as etapas 4.1.1 e 4.1.2 até imagens de todos os seis lados são obtidas.
- Imagem de imuno-fluorescente por observação multi-direcional
- Para fixação, aplique paraformaldeído 4% da amostra sobre o HGC à temperatura ambiente (cerca de 20 ° C) por 20 min, seguido de duas lavagens de PBS por 10 min cada.
- Permeabilize a HGC com PBS contendo 0,5% Triton X-100 por 10 min a 4 ° C, e depois lavar 3 x por 10 min com PBS.
- Incubar a HGC com 10% de soro de cabra em tampão IF (0,2% Triton X-100, albumina de soro bovino 0,1% e 0,05% Tween-20 em PBS) para 60 min à temperatura ambiente para uma etapa preliminar de bloqueio.
- Para a coloração de uma molécula específica, use o anticorpo adequado. Para observar a geometria de cela coletiva, Alexa Fluor 488 faloidina pode ser usada para manchar a actina.
- Coloque um prato fundo de vidro sob um microscópio laser ou fluorescente a HGC e realizar a digitalização a partir de seis lados para obter a imagem de toda a amostra.
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Representative Results
Normal humano brônquica (NHBE) células epiteliais foram usadas para demonstrar a metodologia ilustrada e controlar a geometria inicial célula coletiva para alcançar uma forma do cilindro e uma forma de prisma, respectivamente, em um ambiente de ECM. São apresentados os resultados de imagem multi-direcional obtidos por contraste de fase, bem como a faloidina coloração de uma forma de cilindro (Figura 4AB) e a forma de prisma (Figura 4D). As células estão devidamente alinhadas para produzir a forma desejada 3D no ambiente de ECM. Posteriormente, as células foram cultivadas por quatro dias formar uma forma específica e em seguida foram analisadas pela imagem latente multi-direcional. O tamanho de amostra grande dificulta bastante capturar a imagem de todo tecido de uma direção; no entanto, o HGC permitido imagens de até seis lados, revelando a forma inteira de tecido. A Figura 5 mostra os resultados de imunocoloração da árvore brônquica, desenvolvido a partir das células NHBE. As células NHBE inicialmente eram controladas de uma forma cilíndrica no HGC. Então, a maioria dos ramos eram direcionada perpendicular ao eixo cilíndrico.
Figura 1: processo de fabricação do dispositivo de cubo híbrido gel. (A) o quadro cúbicos de policarbonato é definido em uma caixa de gelo pré-resfriada. (B) Agarose (1,5%) é injetado para cobrir a superfície inferior. (C), o cubo é deslizado para ser coletado. (D), o cubo é girado para fazer outra superfície para baixo. (E) Agarose (1,5%) é injetado para formar outra parede de agarose. (F) depois de uma parede de agarose é produzida por três faces, agarose é injetado através de um rosto aberto. Barra de escala: 5 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: processo de fabricação de micromolds. Fabricação de (A) processo de um micromold por fotolitografia. (B) a forma completa de um micromold de forma prisma fabricados por fotolitografia. (C) fabricado micromold com aço do cilindro. Barra de escala: (B), 2 mm, (C) 10 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: processo de fabricação de célula inicial cluster controle. (A) ECM (por exemplo, o colágeno e o Matrigel) é injetado no HGC. (B) o micromold é definido no quadro cúbico com ou sem um titular. (C) após o ECM é curado, o micromold é removido. (D) após centrifugação, altamente densas de células são injetadas e incubadas. (E) médio é aplicado. (F) adicionais ECM seguido de agarose são injetados para cobrir a superfície superior da HGC. Barra de escala: 5 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: resultados da célula inicial controlam com células NHBE. (A) imagens de contraste de fase das células NHBE cilindricamente controladas levadas para a superfície inferior e lateral. Toda a forma pode ser reconhecida pela observação multi-direcional, sem a necessidade de imagens fluorescentes. (B) imagens de fluorescência das células cilindricamente controladas NHBE F-Actina de coloração. (C) imagens de contraste de fase do NHBE células controladas em forma de prisma triangular capturada das superfícies inferior e lateral. (D) imagens de fluorescência das células NHBE controladas em forma de prisma triangular. Barra de escala: 100 µm. 10 x lente de ampliação (0,3 abertura numérica) foi usado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: projetou imagens fluorescentes capturadas pela digitalização multi-direcional. As células NHBE foram inicialmente controladas para produzir uma forma cilíndrica e cultivadas no HGC por 4 dias. Posteriormente, actina foi manchada por faloidina. Os ramos foram alongados do cilindro inicial ao longo do eixo x, e o comprimento, o tamanho e o ângulo do eixo foram igualmente desenvolvidas. Imagem inferior direita mostra o diagrama esquemático do eixo x-y-z e a forma de amostra. Barra de escala: 100 µm. Utilizou-se um 10 x lente de ampliação (0,3 abertura numérica). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método apresentado neste trabalho é simples e pode ser realizado sem equipamentos de alta tecnologia. Simultaneamente, pode ser obtido um resultado do controle precisos célula aglomerado forma no espaço 3D de hidrogel. Após o controle inicial, as células podem crescer na HGC tanto quanto eles são cultivados em um prato. A imagem multi direcional é executada girando-se a amostra com o HGC usando qualquer sistema de microscopia e melhora significativamente a qualidade de imagem. A escolha dos materiais para o frame HGC e micromold é flexível, enquanto eles são biocompatíveis. Uma impressora 3D pode ser usada para produzir o quadro HGC ou micromold se a precisão da impressora 3D é suficiente para suas aplicações. O método proposto é compatível com a imagem de muitas tecnologias como transparência reagentes20,21 e luz-folha microscopia sistemas de reforço. Utilizando essas tecnologias, a qualidade da imagem pode ser melhorada.
O volume de agarose, ECM e altamente densas células a ser injetada depende do tamanho HGC e molde. Uma cuidadosa operação manual que não injectar bolhas de ar é necessária, caso contrário as bolhas formadas irão deteriorar-se a precisão do controle, crescimento celular e qualidade de imagem.
O processo de fabricação do micromolds será determinado pela forma desejada para o controle. Fotolitografia permite a fabricação de formas 2D precisas com uma certa profundidade, como uma forma de prisma da ordem de micrômetros; no entanto, não é eficaz com formas 3D, como um cilindro. O processo de usinagem que nos permite fabricar a forma 3D, mas em geral, a precisão dimensional é inferior a fotolitografia. Após a fabricação do micromolds, revestimento de polímero phosphorylcholine (MPC) 2-methacryloyloxyethyl sobre os moldes é necessária para evitar aderência sobre o ECM.
Aproveitando uma HGC, imagens microscópicas, com ou sem exposição do laser podem ser realizada em múltiplas direções. Uma forma 3D amostra pode ser aproximadamente reconhecida pela observação multi-direcional sem rotulagem fluorescente; Este método não causa qualquer invasão celular durante a observação. Em contraste, a imagem fluorescente é necessária para a obtenção de uma forma mais precisa de 3D amostra e expressão molecular.
A restrição do método apresentado para controle de célula inicial é que não pode ser aplicado a um molde com uma forma 3D complexa. O molde deve ser retirado por pegar sem se deteriorar o ECM. Assim, o molde é limitado a uma simples forma de reta ou cônica. Para obter o controle de forma mais complexa, mais desenvolvimento do protocolo é necessária.
A metodologia proposta tem ampla utilidade e pode ser facilmente realizada na maioria dos ambientes de laboratório. Este procedimento simples pode superar as limitações da cultura 3D, imagem e repetibilidade e contribuir para o desenvolvimento necessário para cultura 3D.
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Disclosures
Os autores e a Universidade da prefeitura de Osaka e Kyushu Institute of Technology entraram com um pedido de patente para um dispositivo de cubo de gel de híbrido e Nippon médicos e instrumentos Chemical Co. Ltd, Japão recentemente tem comercializado o cubo. A empresa não afetou nenhuma de projeto, processo e métodos descritos.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado financeiramente pela KAKENHI JSPS (18H 04765) e o programa para divulgar sistema de trilha de posse, MEXT, Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
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