Summary
Nous présentons une procédure pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir une formation de modèles reproductibles. Un dispositif cube contenant deux hydrogels différentes est utilisé pour atteindre multidirectionnel d’imagerie pour la formation de tissu motif.
Abstract
L’importance des cultures in vitro de 3D est nettement soulignée dans la culture de cellules/tissus. Toutefois, l’absence de répétabilité expérimentale est l’un des ses restrictions. Quelques résultats reproductibles de la formation détériore l’analyse les mécanismes sous-jacents à l’auto-organisation. Réduire la variation dans des conditions de culture initiale, comme la densité cellulaire et la distribution de la matrice extracellulaire (ECM), est cruciale pour améliorer la répétabilité d’une culture 3D. Dans cet article, nous démontrons une procédure simple mais robuste pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir des formations modèle hautement reproductible. Un micromold avec une forme désirée a été fabriqué à l’aide de la photolithographie ou un processus d’usinage, et il forma une poche 3D dans l’ECM contenue dans un cube de gel hybride (HGC). Très concentrée de cellules ont été ensuite injectés dans la poche pour que la forme des cellules cluster mis en correspondance avec la forme du moule fabriqué. Le HGC indépendant autorisés multidirectionnel le balayage par sa rotation, qui a permis d’imagerie à haute résolution et la capture de la structure du tissu entier même si une lentille de grossissement faible a été utilisée. Les cellules épithéliales bronchiques humaines normales ont été utilisés pour démontrer la méthodologie.
Introduction
L’importance d’une culture 3D, qui mieux imite des milieux biologiques que ne le fait une culture 2D, est nettement soulignée dans la culture de cellules/tissus1,2,3. L’interaction entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM) fournit des indices importants au sujet de la morphogenèse4,5. Nombreuses formations tissulaires peuvent apparaître uniquement dans des environnements 3D, comme le pliage processus6,7, invagination8et formation tubulaire9,10. Toutefois, nombreuses difficultés empêchent les chercheurs de se déplacer à des expériences 3D d’expériences 2D sur un plat. Une des difficultés majeures dans les expériences 3D est celui de l’imagerie 3D échantillons. Par rapport aux expériences planaires, acquisition d’images 3D appropriés est toujours difficile dans de nombreux cas. En particulier, l’obtention d’une image 3D appropriée est une tâche difficile lorsque la taille de l’échantillon atteint la plage de millimètre en raison de la grande profondeur focale des lentilles de grossissement faible. Par exemple, la profondeur focale atteint plus de 50 µm lorsqu’un 10 x grossissement objectif est utilisé alors que la taille de la cellule unique est normalement inférieur à 10 µm. Afin d’améliorer la qualité d’imagerie, systèmes de microscopie de haute technologie sont développées (p. ex., microscopie biphotonique11 et système de microscopie de lumière-fiche12), mais leur disponibilité est limitée en raison de leur prix élevé. Comme alternative, nous avons déjà développé un hybride gel cube (HGC) dispositif13. Le dispositif se compose de deux types d’hydrogels : gel d’agarose comme un gel de l’aide et un ECM comme le collagène ou Matrigel comme un gel de la culture. Le HGC permet de recueillir les échantillons au cours de la mise en culture et faire pivoter le cube pour atteindre l’imagerie multidirectionnel, qui aborde le problème de profondeur focale14.
Une autre difficulté dans des expériences 3D est leur faible répétabilité en raison de la piètre contrôlabilité des environnements 3D. Contrairement à une culture plane sur un plat en plastique, des variations dans les conditions de culture initiale se produisent facilement dans un espace 3D, entouré d’un matériau doux. Une variation significative dans les résultats expérimentaux détériore l’analyse qui suit et qui masque les mécanismes sous-jacents. Ingénierie de nombreuses technologies ont été développées pour aligner dans l’espace des cellules individuelles, par exemple bioprinting15,16,17et18d’échafaudage, de tissage de fibres, mais elles nécessitent un prétraitement complexes ou spécifiquement matériel conçu. En revanche, nous avons développé une méthodologie pour réaliser l’alignement de cellule 3D dans un HGC19.
Dans ce protocole, nous montre une procédure simple avec équipement couramment utilisé pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale 3D dans un HGC. Tout d’abord, le processus de fabrication de la HGC a été démontré. Puis, micromolds fabriquées par photolithographie ou un processus d’usinage ont été placés dans la HGC pour produire une poche avec une forme arbitraire dans un ECM. Par la suite, des cellules très denses après centrifugation ont été injectées dans la poche pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans la HGC. L’amas de cellule contrôlée avec précision pourrait être photographié de nombreuses directions en raison de la HGC. Normal humain (NHBE) les cellules épithéliales bronchiques ont été utilisées pour démontrer le contrôle de la forme de grappe de cellule initiale et l’imagerie des branches dans des directions multiples, pour améliorer la qualité d’imagerie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrication de dispositif de cube pour le gel hybride
- Préparer un cadre de cubes en polycarbonate (PC) à l’aide d’un procédé d’usinage ou une imprimante 3D. La taille de la trame de la PC dépend de la taille de l’échantillon. Dans cette étude, nous avons utilisé un cadre de 5 mm de chaque côté afin que les branches avaient suffisamment d’espace pour s’allonger au cours de la mise en culture.
- Poser le cadre de la PC sur une lame de verre préalablement refroidi ou une autre surface lisse dans une glacière (< 0 ° C) (Figure 1 a).
- Ajouter 12 µL d’agarose préchauffé de 1,5 % (p/v) de la face supérieure de l’armature cubique à l’intrados avec une pipette. Caresser la pipette afin que l’agarose se propage pour créer une surface plane (Figure 1 b).
- En quelques minutes, l’agarose sera guéri. Ramasser le châssis du PC en le faisant glisser jusqu’au bord de la lame de verre à l’aide de la pince à épiler. Veuillez noter que verticalement reprenant la trame de la lame de verre peut en détacher de l’agarose de la structure cubique en raison de la force d’adhérence entre l’agarose et la lame de verre (Figure 1).
- Faire pivoter le cadre cube pour faire la face ouverte vers le bas, puis placez sur la lame de verre (Figure 1).
- Répétez les étapes 1,3 – 1,5 jusqu'à trois surfaces sont remplis de gel d’agarose (Figure 1E).
- Pour former un mur d’agarose sur les visages des quatrième et cinquième, déposez l’agarose dans un visage ouvert (Figure 1F). Une fois qu’un mur d’agarose est formé sur le visage de cinquième, la préparation de la HGC est terminée.
2. fabrication de micromolds par photolithographie ou un processus d’usinage
- Fabrication par photolithographie
- Nettoyer une plaquette de silicium (Si) via un nettoyage par ultrasons avec de l’acétone, l’alcool isopropylique (IPA), puis (DI) de l’eau distillée pendant 5 min chaque. Après l’azote soufflant la plaquette Si avec de l’azote, déshydrater dans un four à 140 ° C pendant 20 min (Figure 2 a(i)).
- Spin-manteau, une couche sacrificielle comme LOR et Az résiste sur la plaquette de tr (2 000 tr/min, 30 s) en utilisant un essorage-coater sous une lumière jaune. Immédiatement après l’essorage-enduit, chauffer les tranches sur une plaque chauffante à 90 ° C pendant 3 min (Figure 2 a(ii)). L’épaisseur souhaitée de la couche sacrificielle est supérieure à 1 µm afin que le décollage de processus peut être effectué facilement, mais une épaisseur précise n’est pas nécessaire.
- Placer les tranches sur une plaque de cuisson à 70 ° C et ensuite laminé une feuille épaisse de résine photosensible négative avec l’épaisseur désirée sur la couche sacrificielle à l’aide d’un rouleau à main (Figure 2 a(iii))
- Cinq minutes après stratification, placer la plaquette sur un aligneur de masque pour l’exposition aux UV. Mettre un photomasque avec le motif désiré sur la feuille de résister et exposer avec lumière UV pendant une durée appropriée. Le temps d’exposition est déterminé par l’épaisseur de la résine photosensible et l’intensité de la lumière ultraviolette. Par la suite, placer les tranches sur une plaque de cuisson pour une cuisson au four après l’exposition à 60 ° C pendant 5 min, suivie d’une cuisson à 90 ° C pendant 10 min. (Figure 2 a(iv))
- Développer une résine photosensible négative en immergeant la plaquette en acétate de l’éther monométhylique propylèneglycol (PGMEA) jusqu'à dissolution complète de la zone non exposée (environ 20 min) (Figure 2 a(v)).
- Dissoudre la couche sacrificielle à l’aide d’IPA pour le nettoyage par ultrasons de décoller de la microstructure. Une fois que la microstructure est décollée de la gaufrette, rincer à l’eau DI de nettoyage par ultrasons pendant 10 min (Figure 2 a(vi)).
- Plonger le moule dans 30 µL du polymère MPC pendant 30 min à température ambiante (environ 20 ° C) pour sécher complètement. Figure 2 b montre le moule fabriqué prisme.
- Fabrication d’un moule de cylindre
- Fabriquer un moule de cylindre en acier avec la taille désirée par un procédé d’usinage. Vous pouvez également utiliser commercialement disponible en acier inoxydable. (Dans cette étude, un cylindre de 600 µm φ est utilisé.)
- Immerger l’acier cylindre dans 30 µL du polymère MPC pendant 30 min à température ambiante (environ 20 ° C) pour sécher complètement.
- Préparation liquide polydiméthylsiloxane (PDMS) en mélangeant la résine de base et de son rôle de catalyseur (voir Table des matières) dans un rapport de 10:1 suivi de dégazage avec un aspirateur dégazage système pendant 20 min. Puis versez le PDMS dans une plaque-puits-12.
- La valeur le cylindre en acier perpendiculairement à la surface de référence et fixe une z-platine afin qu’il peut être inséré perpendiculairement à la surface PDMS non polymérisée dans une plaque 12-puits-placée sur la même surface de référence en déplaçant la z-scène. Incuber le PDMS avec l’acier cylindre dans le four pendant 20 min à 90 ° C pour le durcissement. Couper le PDMS pour former une surface de flanc afin que la pipette peut être insérée dans le processus suivant (Figure 2).
3. contrôler la forme des cluster initial de cellules dans un hydrogel
- Injecter un ECM approprié pour la culture de la cellule souhaitée, comme le collagène et artificielle des membranes basales, l’HGC pour remplir l’espace de culture (Figure 3 a).
- Mis le micromold fabriqué sur la HGC directement ou indirectement avec un support approprié, tel qu’illustré à la Figure 3 b. Par la suite, placer la HGC dans un incubateur à CO2 pendant 25 min à 37 ° C, pour guérir.
- Soulevez soigneusement le micromold afin que l’ECM ne détériore pas (Figure 3). La poche, comme la forme du moule désiré, sera fabriquée dans l’ECM.
- Récolter les cellules du plat cultivé par la trypsine – EDTA ou son équivalent selon les types de cellules. Par la suite, centrifuger les cellules afin d’obtenir des cellules très concentrées (pour la culture NHBE, appliquer 0,25 % de trypsine-EDTA et incuber les cellules pendant 3 min, puis neutralisez avec milieu contenant du FBS et centrifugation à 300 x g pendant 4 min).
- Après centrifugation, enlever le milieu surnageant pour condenser les cellules et injecter les cellules hautement concentrés (3,0 × 104 cellules/µL de cellules NHBE) dans la poche dans l’ECM (Figure 3D).
- Incuber le HGC avec des cellules dans un incubateur à CO2 pendant 20 min à 37 ° C pour que les cellules entrent dans la poche de l’ECM pour combler l’espace créé par la micromolds. Si moyen excessif ou les cellules sont présentes sur la surface supérieure, retirez soigneusement à l’aide d’une pipette.
- Placez la HGC sur un 24-puits-plaque et ajouter 100 µL de milieu approprié (Figure 3E). Pour les cellules NHBE, utilisez un mélange de 1:1 de support spécialisé disponible dans le commerce pour les NHBE et les cellules endothéliales (voir Table des matières).
- Injecter des ECM supplémentaire pour fermer la poche de la mec et puis incuber à 37 ° C pendant 25 min.
- Refroidir préchauffé 1,5 % d’agarose à température ambiante (environ 20 ° C). Déposer environ 10 µL de l’agarose sur l’extrados de la HGC pour fermer la surface et empêcher l’ECM de tomber hors de la HGC au cours de la culture et de l’imagerie (Figure 3F). Puis, incuber la HGC pendant 20 min à 37 ° C pour guérir l’agarose.
- Ajouter le support pour couvrir la HGC ensemble afin que la pression osmotique peut aider à assurer une nutrition aux cellules à l’intérieur de la HGC.
4. multidirectionnel imagerie
- Reconnaissance de forme 3D non invasive par observation multidirectionnelle
- Placez la boîte de Petri ou bien plat contenant le HGC sur un microscope et d’orienter la HGC à l’image de la caméra. Ensuite, obtenir une image de l’échantillon par contraste de phase ou de champ lumineux.
- Ramasser et faire pivoter le HGC pour poser une autre surface.
- Répétez les étapes 4.1.1 et 4.1.2 jusqu'à obtient des images de tous les six côtés.
- Imagerie d’immuno-fluorescence par observation multidirectionnelle
- Pour la fixation, appliquer paraformaldéhyde à 4 % de l’échantillon sur la HGC à température ambiante (environ 20 ° C) pendant 20 min, suivie de deux rinçages de PBS pendant 10 min chaque.
- Permeabilize la HGC avec du PBS contenant 0,5 % de Triton X-100 pendant 10 min à 4 ° C, puis laver le x 3 pendant 10 min avec du PBS.
- Incuber le HGC avec 10 % de sérum de chèvre en tampon IF (0,2 % X-100 Triton, 0,1 % d’albumine sérique bovine et 0,05 % Tween-20 dans du PBS) pendant 60 min à température ambiante pendant une étape primaire de blocage.
- Pour la coloration d’une molécule spécifique, utilisez l’anticorps appropriés. Pour observer la géométrie de la cellule collective, Alexa Fluor 488 Phalloïdine peut être utilisée pour colorer l’actine.
- Placez la HGC sur un plat en verre bas sous un microscope laser ou fluorescentes et effectuer l’analyse de six faces pour obtenir l’image de l’ensemble de l’échantillon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normal humain (NHBE) les cellules épithéliales bronchiques ont été utilisés pour démontrer la méthode illustrée et contrôler la géométrie de la cellule collective initiale pour obtenir la forme d’un cylindre et une forme de prisme, respectivement dans un environnement ECM. Les résultats d’imagerie multidirectionnels obtenus par contraste de phase comme phalloïdine coloration d’une forme de cylindre (Figure 4 aB) et la forme de prisme (Figure 4D) sont présentés. Les cellules sont convenablement alignés pour obtenir la forme désirée 3D dans l’environnement de l’ECM. Par la suite, les cellules ont été cultivées pendant quatre jours constituer une forme spécifique et puis ont été analysés par imagerie multidirectionnel. Le grand échantillon rend très difficile à capturer l’image du tissu entier d’une direction ; Toutefois, la HGC permis la formation image de jusqu'à six côtés, révélant la forme du tissu entier. Figure 5 montre les résultats de l’immunomarquage de l’arbre bronchique, développé à partir des cellules NHBE. Les cellules NHBE ont été contrôlés au départ de forme cylindrique dans le HGC. Ensuite, la plupart des branches ont été dirigée perpendiculairement à l’axe cylindrique.
Figure 1 : processus de Fabrication de dispositif de cube pour le gel hybride. (A) la structure cubique en polycarbonate est définie sur une zone de glace rafraîchies. (B) Agarose (1,5 %) est injecté pour couvrir la surface inférieure. (C), le cube est glissé à collecter. (D), le cube est tourné pour faire une autre surface vers le bas. (E) Agarose (1,5 %) est injecté pour former un autre mur de gel d’agarose. (F) après une paroi d’agarose est produite à trois faces, agarose est injectée par une face ouverte. Barre d’échelle : 5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : procédé de Fabrication de micromolds. (A) Fabrication processus d’un micromold par photolithographie. (B) la forme complète d’un micromold de forme de prisme fabriqué par photolithographie. (C) fabriqué micromold avec de l’acier de cylindre. Barre d’échelle : (B), 2 mm, (C) 10 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : processus de Fabrication de contrôle de cluster de cellule initiale. (A) ECM (par exemple, le collagène et le Matrigel) est injecté dans la HGC. (B) le micromold est défini sur l’armature cubique avec ou sans un titulaire. (C) après l’ECM est guéri, le micromold est supprimé. (D) après que centrifugation, très denses de cellules sont injectés et incubés. (E) médium est appliqué. (F) autres ECM suivie d’agarose sont injectées pour couvrir la surface supérieure de la HGC. Barre d’échelle : 5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : résultats de la cellule initiale de contrôle avec des cellules NHBE. (A) des images à contraste de Phase des cellules NHBE cylindrique contrôlées pour la surface inférieure et latérale. La forme entière pourrait être reconnue par l’observation multidirectionnelle sans nécessiter d’imagerie de fluorescence. (B) des images de Fluorescence des cellules cylindrique contrôlées NHBE coloration actine-F. (C) des images à contraste de Phase de la NHBE cellules contrôlées en forme de prisme triangulaire et capturée des surfaces inférieure et latérale. (D) des images de Fluorescence des cellules NHBE contrôlées en forme de prisme triangulaire. Echelle : 100 µm. 10 x lentille de grossissement (0,3 ouverture numérique) a été utilisé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : fluorescent d’images capturées par balayage multidirectionnel. Les cellules NHBE ont été initialement contrôlées pour produire une forme cylindrique et cultivés dans la HGC pendant 4 jours. Par la suite, actine a été souillé par la phalloïdine. Les branches sont allongées de la bouteille initiale sur l’axe x, et la longueur, la taille et l’angle de l’axe ont été également développés. Image droite montre le schéma de l’axe x-y-z et la forme de l’échantillon. Echelle : 100 µm. Un 10 x grossissement objectif (0,3 ouverture numérique) a été utilisé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La méthode présentée dans cet article est simple et peut s’effectuer sans le matériel de haute technologie. Parallèlement, un résultat de contrôle précis cell cluster forme dans l’espace 3D d’hydrogel peut être obtenu. Après le contrôle initial, les cellules peuvent croître dans la HGC autant qu’ils sont cultivés sur un plat. L’imagerie multidirectionnelle s’effectue en faisant tourner l’échantillon avec la HGC en utilisant n’importe quel système de microscopie, et il améliore considérablement la qualité d’image. Le choix des matériaux du HGC et micromold est flexible, aussi longtemps qu’ils sont biocompatibles. Une imprimante 3D peut servir à produire de la trame de HGC ou micromold si la précision de l’imprimante 3D est suffisante pour leurs applications. La méthode proposée est compatible avec l’image de nombreuses technologies telles que transparence réactifs20,21 et la lumière-feuille microscopie d’amélioration. En utilisant ces technologies, la qualité d’image peut être améliorée.
Le volume de l’agarose, ECM et cellules très denses à injecter dépend de la taille HGC et aux moisissures. Une opération manuelle minutieuse qui injecte-t-il pas de bulles d’air est nécessaire, sinon les bulles formées seront détériorera la précision du contrôle, la croissance des cellules et qualité d’image.
Le procédé de fabrication de la micromolds sera déterminé par la forme désirée au contrôle. Photolithographie permet la fabrication de formes 2D précis avec une certaine profondeur, comme une forme de prisme sur l’ordre de micromètres ; Toutefois, il n’est pas efficace avec des formes 3D, comme un cylindre. Le processus d’usinage permet de fabriquer la forme 3D, mais en général, la précision dimensionnelle est plus faible que la photolithographie. Après la fabrication de la micromolds, enduit de polymère phosphorylcholine (MPC) 2-methacryloyloxyethyl sur les moules est nécessaire pour empêcher l’adhérence sur l’ECM.
En tirant parti de l’HGC, imagerie microscopique, avec ou sans exposition laser peut être effectuée dans de multiples directions. Une forme 3D échantillon environ reconnaissables par observation multidirectionnelle sans marquage fluorescent ; cette méthode ne provoque pas de n’importe quel caractère invasif cellule durant l’observation. En revanche, l’imagerie fluorescente est nécessaire pour l’obtention d’une forme 3D échantillon plus précis et expression moléculaire.
La contrainte de la méthode présentée pour le contrôle de la cellule initiale est qu’il ne peut pas être appliqué à un moule avec une forme 3D complexe. Le moule doit être enlevée en ramassant sans altérer l’ECM. Ainsi, le moule est limité à une simple forme droite ou conique. Pour obtenir le contrôle de forme plus complexe, une élaboration du protocole est nécessaire.
La méthodologie proposée a une grande utilité et peut être facilement effectuée dans la plupart des environnements de laboratoire. Cette procédure simple peut surmonter les limites de la culture 3D, imagerie et répétabilité et contribuent au développement nécessaire à la culture 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs et l’Université préfectorale d’Osaka et Kyushu Institute of Technology ont déposé une demande de brevet pour le dispositif hybride gel cube et Nippon médicaux et Instruments Chemical Co. Ltd, Japon a récemment commercialisé le cube. La société n’a pas affecté de la conception, processus et méthodes décrites.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu financièrement par JSPS KAKENHI (18H 04765) et le programme à diffuser Tenure Track System, MEXT, Japon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
- Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
- Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
- Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
- Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
