Summary
Vi presenterar ett förfarande för att styra formen första cellen kluster i en 3D extracellulära matrix att erhålla en repeterbar mönster bildas. En kubikmeter enhet som innehåller två olika hydrogeler är anställd att uppnå mångfasetterat imaging för vävnad mönster bildas.
Abstract
Vikten av in vitro-3D kulturer betonas betydligt i cell-och/eller vävnadskultur. Avsaknaden av experimentella repeterbarhet är dock en av dess begränsningar. Producera några repeterbara resultat av mönster bildas försämras analys av mekanismerna bakom självorganisering. Att minska variationen i inledande odlingsbetingelser, såsom cell densiteten och distribution i extracellulär matrix (ECM), är avgörande att förbättra repeterbarheten hos en 3D kultur. I den här artikeln visar vi en enkel men robust förfarande för kontroll av formen första cellen kluster i en 3D extracellulära matrix att erhålla mycket repeterbara mönster formationer. En micromold med en önskad form var fabricerade med hjälp av photolithographyen eller en bearbetningsprocess, och det bildas en 3D pocket i ECM som ingår i en hybrid gel kub (HGC). Högkoncentrerad celler injicerades då i fickan så att cellen kluster formen matchas med formen fabricerade mögel. De sysselsatta HGC tillåtna mångfasetterat skanning av dess rotation, som aktiverat högupplösta imaging och tillfångatagandet av den hela vävnadsstrukturen även om en låg förstoring lins användes. Normal människa bronkial epitelceller användes för att demonstrera metoden.
Introduction
Vikten av en 3D kultur, som bättre härmar biologiska miljöer än gör en 2D kultur, framhävs avsevärt i cell/vävnad kultur1,2,3. Samspelet mellan celler och extracellulär matrix (ECM) ger viktiga ledtrådar om morfogenes4,5. Många vävnad formationer kan uppstå endast under 3D-miljöer, såsom den fällbara processen6,7, invagination8och tubulär bildande9,10. Men hindra många svårigheter forskare från skifta till 3D experiment från 2D experiment på en maträtt. En av de stora svårigheterna i 3D experiment är frågan om imaging 3D prover. Jämfört med plana experiment, är förvärv av lämpligt 3D-bilder fortfarande utmanande i många fall. I synnerhet är att erhålla en lämplig 3D bild en svår uppgift när stickprovsstorleken når intervallet millimeter på grund av stora fokal djupet i låg förstoring linser. Exempelvis når fokal djupet mer än 50 µm när en 10 x förstoring linsen används medan storleken på den enda cellen är normalt mindre än 10 µm. För att förbättra imaging, högteknologiska mikroskopi system utvecklas (t.ex. två-foton mikroskopi11 och ljus ark mikroskopi system12), men deras tillgänglighet är begränsad på grund av deras dyra pris. Som ett alternativ, har vi tidigare utvecklat en hybrid gel kub (HGC) enhet13. Enheten består av två typer av hydrogeler: agaros som en stöd-gel och en ECM som kollagen eller Matrigel som en kultur-gel. HGC tillåter oss att samla in provet under odling och rotera kuben för att uppnå mångfasetterat imaging, som behandlar de fokala djup problem14.
En annan svårighet i 3D experiment är deras låg repeterbarhet på grund av dålig Verifierbarheten av 3D miljöer. Till skillnad från en planar kultur på en plast maträtt uppstå variationer i de inledande odlingsbetingelserna lätt i en 3D-rymd omgiven av ett mjukt material. En betydande variation i experimentella resultat försämras följande analys och maskerar de bakomliggande mekanismerna. Många engineering tekniker har utvecklats för att rumsligt justera enstaka celler, såsom bioprinting15,16, fiber vävning17och byggnadsställningar18, men de kräver komplexa förbehandling eller specifikt utformad utrustning. Däremot har vi utvecklat en metod för att uppnå 3D celljustering i en HGC19.
I detta protokoll illustrerade vi ett enkelt förfarande med vanliga utrustning för att styra formen 3D första cellen kluster i en HGC. Först, tillverkningsprocessen av HGC visades. Sedan placerades micromolds tillverkade av photolithographyen eller en bearbetningsprocess i HGC att producera en ficka med en godtycklig form i en ECM. Därefter skulle mycket täta celler efter centrifugeringen injiceras i fickan att styra den initiala cell kluster formen i HGC. Exakt kontrollerade cell klustret kunde avbildas från många håll på grund av HGC. Normal människa bronkial (NHBE) epitelceller användes för att Visa kontroll av den initiala cell kluster formen och avbildning av grenarna från flera håll för att förbättra bild kvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillverkning av hybrid gel kub enhet
- Förbereda en polykarbonat (PC) kubisk ram antingen genom att använda en bearbetningsprocess eller en 3D-skrivare. Storleken på den PC frame beror på urvalets storlek. I denna studie använde vi en ram av 5 mm på varje sida så att grenarna hade tillräckligt med utrymme att förlänga under odling.
- Placera ramen PC på en nedkylda glasskiva eller annan slät yta i en ice box (< 0 ° C) (figur 1A).
- Lägga till 12 µL föruppvärmd 1,5% agaros (w/v) från den översta sidan av cubic ramen till bottenyta med en pipett. Slaglängd på pipetten så att Agarens sprider för att skapa en plan yta (figur 1B).
- Inom minuter, kommer att Agarens bli botade. Plocka upp den PC frame genom att skjuta den till kanten av en glasskiva med pincett. Observera att vertikalt plocka upp ramen från glasskiva kan leda du lossar Agarens från cubic ram på grund av den självhäftande kraften mellan Agarens och glasskiva (figur 1 c).
- Rotera cubic ramen för att göra öppna ansiktet nedåt och placera i glaset bilden igen (figur 1 d).
- Upprepa steg 1,3 – 1,5 tills tre ytor är fyllda med agaros (figur 1E).
- För att bilda en agaros vägg på fjärde och femte ansikten, släppa Agarens från ett öppet ansikte (figur 1F). När en agaros vägg bildas i femte ansiktet, är utarbetandet av HGC klar.
2. tillverkning av micromolds av photolithographyen eller en bearbetningsprocess
- Tillverkning av photolithographyen
- Ren destilleras en kisel (Si) wafer via ultraljud rengöring med aceton, isopropylalkohol (IPA), sedan (DI) vatten för 5 min varje. Efter kväve blåser Si rånet med kväve, torka i ugn vid 140 ° C i 20 min (figur 2A(i)).
- Spinn-rocken ett uppoffrande lager såsom LOR och Az motstår på Si rånet (2.000 rpm, 30 s) med hjälp av en spin-bestrykare under gult ljus. Omedelbart efter spin-beläggning, Värm rånet på en värmeplatta vid 90 ° C under 3 minuter (figur 2A(ii)). Önskad tjocklek av lagrets uppoffrande är mer än 1 µm så att hissen av processen kan utföras enkelt, men en korrekt tjocklek är inte nödvändigt.
- Placera rånet på en värmeplatta vid 70 ° C och sedan laminat en tjock negativa fotoresist ark med önskad tjocklek på uppoffrande lagret med hjälp av en hand roller (figur 2A(iii))
- Fem minuter efter laminering, placera rånet på en mask aligner för UV-exponering. Ange en photomasken med önskat mönster på den ark-resist och exponera med UV-ljus för en lämplig tid. Exponeringstiden bestäms av tjockleken på fotoresist och intensiteten av UV-ljus. Därefter placera rånet på en värmeplatta för en efter exponering baka vid 60 ° C i 5 min, följt av bakning vid 90 ° C i 10 min. (figur 2A(iv))
- Utveckla en negativ fotoresist genom nedsänkning rånet i propylenglykol monometylfumarat eter acetat (PGMEA) tills området oexponerad är helt upplöst (ca 20 min) (figur 2A(v)).
- Lös det uppoffrande lagret genom att använda IPA för ultraljudsrengöring för att lyfta av mikrostrukturen. När mikrostrukturen är skalade från rånet, skölj med DI vatten av ultraljudsrengöring i 10 min (figur 2A(vi)).
- Doppa formen i 30 µL av MPC polymeren i 30 min i rumstemperatur (cirka 20 ° C) att helt torka ut. Figur 2B visar fabricerade prisma mögel.
- Tillverkning av en cylinder mögel
- Tillverka en stålcylinder mögel med önskad storlek genom en bearbetningsprocess. Du kan också använda kommersiellt tillgängliga rostfritt stål. (I denna studie en φ 600 µm cylinder används.)
- Fördjupa cylinder stålet i 30 µL av MPC polymeren i 30 min i rumstemperatur (cirka 20 ° C) att helt torka ut.
- Förbereda flytande Polydimetylsiloxan (PDMS) genom att blanda bas harts och dess katalysator (se Tabell för material) i förhållandet 10:1 följt av avgasning med vakuum avgasning system i 20 min. Häll sedan PDMS i en 12-brunn-platta.
- Ställa stål cylindern vinkelrätt mot datum ytan och fast till en linjär z-scenen så att det vinkelrätt kan infogas i ohärdat PDMS ytan i en 12-brunn-plåt placeras på samma datum ytan genom att flytta z-scenen. Inkubera i PDMS med cylinder stålet i ugn i 20 min vid 90 ° C för att bota. Skär PDMS för att bilda en flank yta så att Pipettera kan infogas i följande process (figur 2 c).
3. Kontrollera initiala cellen kluster form i en hydrogel
- En lämplig ECM för önskad cellkulturen, såsom kollagen och konstgjorda basalmembranet, injicera HGC att fylla kultur utrymmet (figur 3A).
- Ange den fabricerade micromold HGC direkt eller indirekt med en lämplig hållare, som visas i figur 3B. Därefter placera HGC i en CO2 inkubator för 25 min vid 37 ° C för att bota den.
- Lyft försiktigt ut micromold så att ECM inte försämras (figur 3 c). Fickan, kommer som den önskade form formen vara fabricerade i ECM.
- Skörda celler från odlade skålen av trypsin-EDTA eller motsvarande beroende på celltyper. Därefter, Centrifugera cellerna för att få högkoncentrerad celler (för NHBE kultur, applicera 0,25% trypsin-EDTA och inkubera cellerna för 3 min, sedan neutralisera med FBS-innehållande medium och centrifugering vid 300 x g i 4 min).
- Ta bort supernatanten mediet för att kondensera cellerna efter centrifugering och injicera högkoncentrerad celler (3,0 × 104 celler/µL för NHBE celler) i fickan i ECM (figur 3D).
- Inkubera i HGC med celler i en CO2 inkubator för 20 min vid 37 ° C så att cellerna faller i ECM fickan att fylla det utrymme som skapas av micromolds. Om överdriven medium eller celler är närvarande på den övre ytan, ta försiktigt bort med hjälp av en pipett.
- Placera HGC på en 24-brunn-tallrik och tillsätt 100 µL av lämpligt medium (figur 3E). För NHBE celler, använda en 1:1 blandning av kommersiellt tillgängliga specialiserade medium för NHBE och endotelceller (se Tabell för material).
- Injicera ytterligare ECM för att stänga fickan i ECM, och sedan Inkubera vid 37 ° C i 25 min.
- Kyla ner förvärmd 1,5% agaros till rumstemperatur (cirka 20 ° C). Släppa ca 10 µL Agarens på ovansidan av HGC att stänga ytan och förhindra ECM från att falla ur HGC under odling och imaging (figur 3F). Sedan, Inkubera HGC under en annan 20 minuter vid 37 ° C för att bota Agarens.
- Lägg till medium för att täcka den hela HGC så att det osmotiska trycket kan hjälpa att ge näring till cellerna inuti HGC.
4. multi-directional imaging
- Icke-invasiv 3D form erkännande genom mångfasetterat observation
- Placera på kultur maträtt eller väl platta som innehåller HGC på ett Mikroskop och orientera HGC till kameran ram. Sedan få en exempelbild av ljusa fält eller fas kontrast.
- Plocka upp och rotera den HGC för att placera en annan surface ner.
- Upprepa steg 4.1.1 och 4.1.2 tills bilder från alla sex sidor erhålls.
- Immuno-fluorescerande imaging genom mångfasetterat observation
- För fixering, gäller 4% paraformaldehyd till provet över HGC vid rumstemperatur (cirka 20 ° C) för 20 min, följt av två sköljningar PBS för 10 min varje.
- Permeabilize HGC med PBS som innehåller 0,5% Triton x-100 under 10 minuter vid 4 ° C, tvätta sedan 3 x 10 min med PBS.
- Inkubera i HGC med 10% get serum i IF-buffert (0.2% Triton x-100, 0,1% bovint serumalbumin och 0,05% Tween-20 i PBS) för 60 min i rumstemperatur i en primär blockerande steg.
- För färgning av en specifik molekyl, Använd lämpliga antikroppen. För att observera den kollektiva cell geometrin, kan Alexa Fluor 488 Phalloidin användas för att färga aktin.
- Placera HGC på ett glas botten maträtt under en laser eller fluorescerande Mikroskop och utföra avsökningen från sex sidor att få hela exempelbilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normal människa bronkial (NHBE) epitelceller användes att demonstrera metoden illustrerade och styra inledande kollektiva cell geometri för att uppnå en cylinder form och en prisma form, respektive i ECM-miljö. Multi-directional imaging resultaten av faskontrast samt phalloidin färgning av en cylinder form (figur 4AB) och formen prisma (figur 4 cD) presenteras. Cellerna är lämpligt anpassade för att ge önskad 3D form i ECM-miljön. Därefter cellerna var odlade i fyra dagar till en specifik form och sedan analyserades av multi directional imaging. Stora urvalets storlek gör det ganska svårt att fånga hela vävnad bilden från en riktning; dock tillåtet HGC imaging från upp till sex sidor, avslöjar formen hela vävnad. Figur 5 visar immunfärgning resultaten av bronker framkallade från de NHBE cellerna. NHBE cellerna kontrollerades inledningsvis till en cylindrisk form i HGC. Sedan, de flesta grenarna var riktad vinkelrätt mot cylindrisk axel.
Figur 1: tillverkningsprocessen av hybrid gel kub enhet. (A) ramen polykarbonat kubik är inställd på en förhandskyld ice box. (B) agaros (1,5%) injiceras för att täcka bottenyta. (C), kuben skjuts som ska samlas in. (D), kuben roteras för att göra en annan yta ner. (E) agaros (1,5%) injiceras för att bilda en annan agaros vägg. (F) efter en agaros vägg produceras för tre ansikten, agaros injiceras genom ett öppet ansikte. Skalstapeln: 5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: tillverkningsprocessen av micromolds. (A) tillverkning av en micromold av photolithographyen. (B) komplett form av en fabricerade prisma form micromold av photolithographyen. (C) tillverkade micromold med cylinder stål. Skalstapeln: (B), 2 mm, (C) 10 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: tillverkningsprocessen av initiala cellen klusterkontroll. (A) ECM (t.ex. kollagen och Matrigel) injiceras i HGC. (B) micromold är inställd på cubic ram med eller utan en hållare. (C) efter the ECM är botad, micromold tas bort. (D) efter centrifugering, mycket tät celler injiceras och inkuberas. (E) Medium tillämpas. (F) ytterligare ECM följt av agaros injiceras för att täcka den övre ytan på HGC. Skalstapeln: 5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: resultat av initiala cellen styra med NHBE celler. (A) faskontrast bilder av cylindriskt kontrollerade NHBE cellerna tas för botten och laterala ytan. Hela formen kunde erkännas genom mångfasetterat observation utan fluorescerande imaging. (B) fluorescens bilder av cylindriskt kontrollerade NHBE cellerna färgning F-aktin. (C) faskontrast bilder av NHBE celler kontrolleras i en triangulär prisma form fångas från botten och laterala ytor. (D) fluorescens bilder av NHBE celler kontrolleras i en triangulär prisma form. Skalstapeln: 100 µm. 10 x förstoring linsen (0.3 numerisk bländare) användes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: projiceras fluorescerande bilder tagna av mångfasetterat skanning. NHBE cellerna var initialt kontrolleras för att producera en cylindrisk form och odlade i HGC 4 dagar. Därefter var aktin färgas av phalloidin. Grenarna var långsträckt från första cylindern längs x-axeln och längd, storlek och vinkel från axeln var lika utvecklat. Nedre högra bilden visar schematiskt av x-y-z -axeln och prov formen. Skalstapeln: 100 µm. En 10 x förstoring linsen (0.3 numerisk bländare) användes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden presenteras i denna uppsats är enkel och kan utföras utan högteknologiska utrustning. Samtidigt, kan ett exakt cell kluster form kontrollresultat i 3D rymden av hydrogel erhållas. Efter den inledande kontrollen, kan cellerna växa i HGC lika mycket som de är odlade på en maträtt. Multi-directional bildtagning utförs av roterande provet med den HGC använder någon mikroskopi system, och det avsevärt förbättrar imaging kvaliteten. Valet av material för HGC ramen och micromold är flexibel så länge de är biokompatibel. En 3D-skrivare kan användas för att producera HGC ram eller micromold om riktigheten av den 3D-skrivaren är tillräcklig för sina program. Den föreslagna metoden är kompatibel med många bild teknik såsom öppenhet reagenser20,21 och ljus ark mikroskopi system för att förbättra. Genom att använda dessa tekniker, kan bildkvaliteten förbättras.
Volymen av agaros, ECM, och mycket tät celler injiceras beror på storleken på HGC och mögel. En försiktig manuell drift som inte injicera luftbubblor krävs, annars bubblor bildas kommer att försämras noggrannheten i den kontroll, celltillväxt och imaging kvalitet.
Tillverkningsprocessen av micromolds kommer att bestämmas av önskad form till kontroll. Photolithography möjliggör tillverkning av exakt 2D former med ett visst djup, till exempel en prisma formen på order av mikrometrar; Det är dock inte effektivt med 3D-former, såsom en cylinder. Bearbetningsprocessen tillåter oss att fabricera 3D formen, men dimensionell noggrannhet är i allmänhet lägre än photolithography. Efter tillverkning av micromolds krävs beläggning av 2-methacryloyloxyethyl fosforylkolin (MPC) polymeren på formarna för att förhindra vidhäftning på ECM.
Genom att utnyttja en HGC, kan mikroskopbilder med eller utan laser exponering utföras i flera riktningar. En 3D prov form kan kännas ungefär genom mångfasetterat observation utan fluorescerande märkning; Denna metod orsakar inte någon cell invasivitet under observation. Fluorescerande imaging krävs däremot för att få en exaktare 3D prov form och molekylär uttryck.
Begränsningen av den presenterade metoden för inledande cell kontroll är att det inte kan tillämpas på en mögel med en komplex 3D-formen. Mögel har tas bort genom att plocka upp utan försämras ECM. Mögel är således begränsad till en enkel raka eller koniska form. För att få mer komplex form kontroll, krävs ytterligare utveckling av protokollet.
Den föreslagna metoden har bred verktyg och enkelt kan bedrivas i de flesta av laboratoriemiljöer. Denna enkla procedur kan övervinna begränsningarna av 3D kultur, imaging och repeterbarhet och bidra till den fortsatta utvecklingen krävs för 3D kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna och Osaka prefektur University och Kyushu Institute of Technology har lämnat in en patentansökan för en hybrid gel kub enhet, och Nippon medicinska och kemiska instrument Co. Ltd, Japan har nyligen kommersialiserad kuben. Företaget inte påverka någon av design, processen och metoderna.
Acknowledgments
Detta arbete fick ekonomiskt stöd av JSPS KAKENHI (18H 04765) och programmet för att sprida Tenure Track System, MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
- Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
- Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
- Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
- Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
