Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Indledende 3D celle klynge kontrol i en Hybrid Gel Cube enhed for gentagelig mønster formationer

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/59214
Automatic Translation
1, 2, 3
1NanoSquare Research Institute, Osaka Prefecture University, 2Department of Bioscience and Informatics, Osaka Prefecture University, 3Department of Biological Functions Engineering, Kyushu Institute of Technology

Summary

Vi præsenterer en procedure til kontrol af den oprindelige celle klynge figur i en 3D ekstracellulære matrix til at opnå en gentagelig mønster dannelse. En kubisk enhed indeholder to forskellige hydrogels er ansat til at opnå multi-retningsbestemt tænkelig nemlig væv mønster dannelse.

Abstract

Betydningen af in vitro-3D kulturer fremhæves betydeligt i celle/vævskultur. Men manglen på eksperimentelle repeterbarhed er en af dens begrænsninger. Få repeterbare resultater af mønster dannelse forringes analyse af de underliggende selv-organisering mekanismer. At reducere variation i indledende kultur betingelser, såsom celle tæthed og distribution i den ekstracellulære matrix (ECM), er afgørende for at forbedre repeterbarhed af en 3D kultur. I denne artikel viser vi en simpel men robust procedure til kontrol af den oprindelige celle klynge figur i en 3D ekstracellulære matrix at opnå meget repeterbare mønster formationer. En micromold med en ønskede figur blev fabrikeret ved hjælp af fotolitografi eller en spåntagende proces, og det dannede en 3D lomme i ECM indeholdt i en hybrid gel cube (HGC). Højkoncentreret celler blev derefter injiceres i lommen så at figuren celle klynge matches med figuren fabrikerede skimmel. Den erhvervsdrivende HGC tilladt multi-retningsbestemt scanning af dens rotation, som aktiveret høj opløsning imaging og erobringen af hele væv struktur, selv om en lav forstørrelse linsen blev brugt. Normale menneskelige bronchiale epitel celler blev brugt til at vise metoden.

Introduction

Betydningen af en 3D kultur, der bedre efterligner biologiske miljøer end en 2D kultur, fremhæves betydeligt i celle/væv kultur1,2,3. Samspillet mellem celler og ekstracellulære matrix (ECM) giver vigtigt stikord om morfogenese4,5. Mange væv formationer kan dukke op kun under 3D-miljøer, såsom folde proces6,7, invagination8og rørformede dannelse9,10. Talrige vanskeligheder forhindrer dog forskere Vindretning 3D eksperimenter fra 2D eksperimenter på et fad. En af de store vanskeligheder i 3D eksperimenter er spørgsmålet om billedbehandling 3D prøver. Sammenlignet med planar eksperimenter, er erhvervelse af relevante 3D billeder stadig udfordrende i mange tilfælde. Især er at opnå et passende 3D billede en vanskelig opgave, når stikprøvestørrelsen når rækken millimeter på grund af den store fokale dybde af lav forstørrelse objektiver. For eksempel, bliver fokale dybden mere end 50 µm, når en 10 x forstørrelse linsen bruges mens størrelsen på det enkelt celle er normalt mindre end 10 µm. For at forbedre den billeddiagnostiske kvalitet, udvikles højteknologi mikroskopi systemer (f.eks. to-foton mikroskopi11 og lys-ark mikroskopi system12), men deres anvendelighed er begrænset på grund af deres dyre pris. Som et alternativ, har vi tidligere udviklet en hybrid gel cube (HGC) enhed13. Enheden består af to typer af hydrogels: Agarosen som en støtte gel og en ECM såsom kollagen eller Matrigel som en kultur gel. HGC tillader os at indsamle prøven under dyrkning og rotere kuben for at opnå multi-retningsbestemt billeddannelse, som omhandler fokale dybde problem14.

En anden vanskelighed i 3D eksperimenter er deres lave repeterbarhed på grund af dårlig kontrollerbarhed af 3D-miljøer. I modsætning til en planar kultur på en plastik skål forekomme variationer i de indledende dyrkningsbetingelser nemt i et 3D-rum omgivet af et blødt materiale. En betydelig variation i de eksperimentelle resultater forringes den følgende analyse og masker de underliggende mekanismer. Mange engineering teknologier har udviklet for rumligt justere indre celler, såsom bioprinting15,16, fiber vævning17og stilladser18, men de kræver komplekse forbehandling eller specifikt specialdesignet udstyr. I modsætning hertil har vi udviklet en metode til at opnå 3D cellejustering i en HGC19.

I denne protokol illustreret vi en enkel procedure med almindeligt anvendte udstyr til at kontrollere figuren 3D oprindelige celle klynge i en HGC. Først, HGC fabrikationsproces blev demonstreret. Derefter, micromolds fabrikeret af fotolitografi eller en spåntagende proces blev placeret i HGC til at producere en lomme med en vilkårlig figur i en ECM. Efterfølgende, blev meget tætte celler efter centrifugering sprøjtet ind i lommen til at styre den oprindelige celle klynge figur i HGC. Netop kontrollerede celle klyngen kunne være afbildet fra mange retninger på grund af HGC. Normale menneskelige bronchiale epitel (NHBE) celler blev brugt til at vise kontrol af den oprindelige celle klynge figur og billeddannelse af grene fra flere retninger for at øge den billeddiagnostiske kvalitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabrikation af hybrid gel cube enhed

  1. Forberede en polycarbonat (PC) cubic ramme enten ved hjælp af en spåntagende proces eller en 3D-printer. Størrelsen på rammen PC afhænger af stikprøvestørrelse. I denne undersøgelse brugte vi en ramme på 5 mm på hver side så at grenene havde tilstrækkelig plads til aflang under dyrkning.
  2. Placere rammen PC på en pre afkølet glas dias eller en anden glat overflade i en ice box (< 0 ° C) (figur 1A).
  3. Tilføj 12 µL forvarmet 1,5% Agarosen (w/v) fra den øverste ansigt af cubic rammen til bunden overfladen med en pipette. Optegne pipetten, således at Agarosen spreder sig for at skabe en flad overflade (figur 1B).
  4. Inden for få minutter, vil Agarosen blive helbredt. Afhente PC rammen ved at skubbe det til kanten af glas dias ved hjælp af pincet. Bemærk at lodret picking up ramme fra glas dias kan resultere i afmontering af Agarosen fra cubic rammen på grund af den klæbende styrke mellem Agarosen og glas dias (figur 1 c).
  5. Rotere cubic rammen for at gøre den åbne ansigt ned, og derefter placere på glas dias igen (figur 1 d).
  6. Gentag trin 1,3-1,5 indtil tre overflader er fyldt med Agarosen (figur 1E).
  7. For at danne en Agarosen væg på fjerde og femte ansigter, drop Agarosen fra en åben ansigt (figur 1F). Når en Agarosen væg er dannet på den femte ansigt, er forberedelse af HGC afsluttet.

2. fremstilling af micromolds af fotolitografi eller en spåntagende proces

  1. Fabrikation af fotolitografi
    1. Ren destilleret en silicium (Si) wafer via ultralydsrengøring med acetone, isopropylalkohol (IPA), derefter (DI) vand i 5 min. Efter kvælstof blæser Si-wafer med kvælstof, dehydrere i en ovn ved 140 ° C i 20 min. (figur 2A(i)).
    2. Spin-coat en blote lag som LOR og Az modstår Si-wafer (2.000 omdr. / min., 30 s) ved hjælp af en spin-coater under gult lys. Umiddelbart efter spin-coating, varme wafer på en varmeplade ved 90 ° C i 3 min (figur 2A(ii)). Den ønskede tykkelse af det blote lag er mere end 1 µm, lift off proces kan udføres nemt, men en nøjagtig tykkelse er ikke nødvendigt.
    3. Placer wafer på en varmeplade ved 70 ° C, og derefter laminat en tyk negative photoresist ark med den ønskede tykkelse på det blote lag ved hjælp af en hånd valse (figur 2A(iii))
    4. Fem minutter efter laminering, placere wafer på en maske aligner for UV-eksponering. Angive en photomask med det ønskede mønster på ark modstå og udsætte med UV-lys for en passende tid varighed. Eksponeringstiden bestemmes af tykkelsen af photoresist og intensiteten af UV-lys. Efterfølgende placere wafer på en varmeplade til en efterfølgende Bages ved 60 ° C i 5 min, efterfulgt af bagning ved 90 ° C i 10 min. (figur 2A(iv))
    5. Udvikle en negativ photoresist ved at nedsænke wafer i propylenglycol mellem ether acetat (PGMEA), indtil det eksponerede område er helt opløst (ca. 20 min.) (figur 2A(v)).
    6. Opløse det blote lag ved hjælp af IPA for ultralydsrengøring til løft mikrostruktur. Når mikrostrukturen er pillet ud fra wafer, skyl med Deioniseret vand ved ultralyd rengøring for 10 min (figur 2A(vi)).
    7. Fordyb mug i 30 µL af MPC polymer i 30 min. ved stuetemperatur (ca. 20 ° C) helt tørre det. Figur 2B viser opdigtede prisme skimmel.
  2. Fabrikation af en cylinder form
    1. Fremstil en stål cylinder mug med ønskede størrelse af en spåntagende proces. Alternativt kan du bruge kommercielt tilgængelige rustfrit stål. (I denne undersøgelse, en φ 600 µm cylinder der bruges.)
    2. Fordyb cylinder stål i 30 µL af MPC polymer i 30 min. ved stuetemperatur (ca. 20 ° C) helt tørre det.
    3. Forberede flydende Polydimethylsiloxan (PDMS) ved at blande base harpiks og dens katalysator (Se Tabel af materialer) i forholdet 10:1 efterfulgt af afgasning med vakuum afgasning system til 20 min. Derefter hælde PDMS i en 12-godt-plade.
    4. Sæt stål cylinder vinkelret datum overflade og fast til en lineær z-fase, således at det kan indsættes vinkelret i det uhærdede PDMS overflade i en 12-godt-plade placeret på den samme datum overflade ved at flytte z-scenen. Inkuber PDMS med cylinder stål i ovnen i 20 min. ved 90 ° C for at kurere. Skære PDMS for at danne en flanke overflade, således at pipette kan indsættes i følgende proces (figur 2 c).

3. kontrollere oprindelige celle klynge figur i en hydrogel

  1. Indsprøjte en passende ECM for den ønskede cellekultur, såsom kollagen og kunstige basalmembranen, i HGC at fylde kultur rummet (figur 3A).
  2. Sæt den fabrikerede micromold på HGC direkte eller indirekte med en passende holder, som vist på figur 3B. Efterfølgende placere HGC i en CO2 inkubator i 25 min ved 37 ° C for at kurere den.
  3. Løft forsigtigt ud af micromold, således at ECM ikke forværres (figur 3 c). Lommen, vil som figuren ønskede skimmel være fabrikeret i ECM.
  4. Høste celler fra den kulturperler parabol af trypsin – EDTA eller tilsvarende afhængig af celletyper. Derefter centrifugeres celler til at opnå stærkt koncentreret celler (for NHBE kultur, anvende 0,25% trypsin-EDTA og inkuberes celler i 3 min, så neutraliseres med FBS-holdige medium og centrifugering ved 300 x g i 4 min).
  5. Efter centrifugering, Fjern supernatanten medium for at kondensere cellerne og indsprøjtes højkoncentreret celler (3,0 × 104 celler/mikroliter for NHBE celler) i lommen i ECM (figur 3D).
  6. Inkuber HGC med celler i en CO2 inkubator i 20 min. ved 37 ° C, således at cellerne falder ind i ECM lommen at fylde rummet lavet af micromolds. Hvis overdreven medium eller celler findes på oversiden, forsigtigt fjerne ved hjælp af en pipette.
  7. Placere HGC på en 24-godt-tallerken og tilsæt 100 µL af passende medium (figur 3). Til NHBE celler, skal du bruge en 1:1 blanding af kommercielt tilgængelige specialiserede medium for NHBE og endotelceller (Se Tabel af materialer).
  8. Indsprøjtes yderligere ECM for at lukke lommen i ECM, og derefter inkuberes ved 37 ° C i 25 min.
  9. Køle ned forvarmet 1,5% Agarosen til stuetemperatur (ca. 20 ° C). Drop ca 10 µL af Agarosen på oversiden af HGC at lukke overfladen og forhindre ECM fra falder ud af HGC under dyrkning og imaging (figur 3F). Derefter inkuberes HGC for en anden 20 min ved 37 ° C for at helbrede agarosegelelektroforese.
  10. Tilføje medium for at dække det hele HGC osmotiske tryk kan hjælpe at give ernæring til celler inde HGC.

4. multi-directional imaging

  1. Non-invasiv 3D form anerkendelse af multi-retningsbestemt observation
    1. Placere kultur parabol eller godt plade der indeholder HGC på et mikroskop og orientere HGC til kameraet rammen. Derefter, få en prøve billede af lyse felt eller fase kontrast.
    2. Samle op og rotere HGC for at placere en anden overflade ned.
    3. Gentag trin 4.1.1 og 4.1.2, indtil der billeder fra alle seks sider.
  2. Immuno-fluorescerende billeddannelse af multi-retningsbestemt observation
    1. Til fiksation, skal du anvende 4% PARAFORMALDEHYD prøven over HGC ved stuetemperatur (ca. 20 ° C) i 20 min., efterfulgt af to skylninger af PBS i 10 min.
    2. Permeabilize HGC med PBS indeholdende 0,5% Triton X-100 i 10 min. ved 4 ° C, så vask 3 x til 10 min med PBS.
    3. Inkuber HGC med 10% ged serum i IF-buffer (0,2% Triton X-100, 0,1% bovint serumalbumin og 0,05% Tween-20 i PBS) for 60 min. ved stuetemperatur til en primær blokerende skridt.
    4. Farvning af et bestemt molekyle, at bruge den passende antistof. For at overholde kollektive celle geometri, kan Alexa Fluor 488 Phalloidin bruges til at plette aktin.
    5. Placer HGC på en glasskål på bunden under en laser eller fluorescerende mikroskop og udføre scanning fra seks sider for at få det hele prøve billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Normale menneskelige bronchiale epitel (NHBE) celler blev brugt til at vise den illustrerede metode og styre den oprindelige kollektive celle geometri for at opnå en cylinder form og en prisme form, henholdsvis i en ECM miljø. Multi-retningsbestemt imaging resultaterne af fasekontrast samt phalloidin farvning af en cylinder form (figur 4AB) og prisme form (figur 4 cD) er præsenteret. Cellerne er behørigt justeret for at give den ønskede 3D form i ECM-miljø. Efterfølgende cellerne var kulturperler i fire dage til at danne en bestemt figur og derefter blev analyseret af multi-retningsbestemt billeddannelse. Store stikprøvestørrelse gør det ganske svært at fange det hele væv billede fra én retning; men HGC tilladt imaging fra op til seks sider, afslørende figuren hele væv. Figur 5 viser immunfarvning resultaterne af bronkial træet udviklet fra NHBE cellerne. NHBE cellerne blev i første omgang kontrolleres med en cylindrisk figur i HGC. Derefter, de fleste af grene var rettet vinkelret cylindrisk akse.

Figure 1
Figur 1: fabrikationsproces af hybrid gel cube enhed. (A) polycarbonat cubic rammen ligger på en forkølede ice box. (B) Agarosen (1,5%) sprøjtes for at dække bunden overfladen. (C) kuben er gled for at blive indsamlet. (D) kuben er roteret for at gøre en anden overflade ned. (E) Agarosen (1,5%) sprøjtes for at danne en anden Agarosen væg. (F) efter en Agarosen væg er produceret for tre ansigter, Agarosen er injiceres gennem et åbent ansigt. Skalalinjen: 5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: fabrikationsproces af micromolds. (A) Fabrication processer af en micromold af fotolitografi. (B) fuldstændig form af en opdigtet prisme form micromold af fotolitografi. (C) fremstillet micromold med cylinder stål. Skalalinjen: (B) 2 mm, (C) 10 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: fabrikationsproces oprindelige celle klynge kontrol. (A) ECM (fx, kollagen og Matrigel) indsprøjtes i HGC. (B) micromold er indstillet på cubic rammen med eller uden en indehaver. (C) efter ECM er helbredt, micromold er fjernet. (D) efter centrifugering, meget tætte celler injiceres og inkuberes. (E) Medium er anvendt. (F) yderligere ECM efterfulgt af Agarosen er sprøjtet for at dække den øverste overflade af HGC. Skalalinjen: 5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: resultaterne af første celle kontrol med NHBE celler. (A) fasekontrast billeder af de cylindrically kontrolleret NHBE celler taget til bunden og laterale overflade. Hele figuren kunne blive anerkendt af multi-retningsbestemt observation uden at kræve fluorescerende billeddannelse. (B) Fluorescens billeder af de cylindrically kontrolleret NHBE celler farvning F-actin. (C) fasekontrast billeder af NHBE celler styres i en trekantede prisme form erobret fra bunden og laterale overflader. (D) Fluorescens billeder af de NHBE celler styres i en trekantede prisme form. Skalalinjen: 100 µm. 10 x forstørrelse linsen (0,3 numerisk blænde) blev brugt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: projiceret fluorescerende billeder taget af multi-retningsbestemt scanning. NHBE cellerne blev i første omgang kontrolleres for at producere en cylinderform og kulturperler i HGC i 4 dage. Efterfølgende blev actin plettet af phalloidin. Grenene blev forlænget fra den oprindelige cylinder langs x-aksen, og længde, størrelse og vinkel fra aksen var lige så udviklet. Nederste højre billede viser skematisk af x-y-z -aksen og figuren prøve. Skalalinjen: 100 µm. Et 10 x forstørrelse linsen (0,3 numerisk blænde) blev brugt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden fremlægges i dette papir er enkel og kan udføres uden højteknologisk udstyr. Samtidigt, kan en præcis celle klynge form kontrol resultat i 3D-rum af hydrogel opnås. Efter den indledende kontrol, kan cellerne vokse i HGC så meget som de er kulturperler på et fad. Den multi-retningsbestemt imaging udføres ved at dreje prøven med HGC ved hjælp af enhver mikroskopi system, og det betydeligt forbedrer den billeddiagnostiske kvalitet. Valget af materialer til HGC ramme og micromold er fleksibel, så længe de er biokompatible. En 3D printer kan bruges til at producere HGC ramme eller micromold hvis nøjagtigheden af 3D-printer er tilstrækkeligt for deres programmer. Den foreslåede metode er kompatibel med mange billede styrkelse teknologier såsom gennemsigtighed reagenser20,21 og lys-ark mikroskopi systemer. Ved at ansætte disse teknologier, kan billedkvaliteten forbedres.

Volumen af agarosegelelektroforese, ECM og meget tætte celler til at blive injiceret afhænger størrelsen HGC og skimmel. En omhyggelig manuel betjening, der ikke injicerer luftbobler er påkrævet, ellers bobler dannet vil forværres nøjagtighed kontrol, cellevækst og billeddiagnostiske kvalitet.

Fabrikationsproces af micromolds bestemmes af den ønskede form for kontrol. Fotolitografi muliggør fremstilling af præcise 2D figurer med en vis dybde, såsom en prisme form på rækkefølgen mikrometer; Det er imidlertid ikke effektiv med 3D-figurer, såsom en cylinder. Den spåntagende proces gør det muligt at fabrikere den 3D figur, men den dimensionale nøjagtighed er generelt lavere end fotolitografi. Efter fabrikation af micromolds er belægning af 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer på formene forpligtet til at forhindre adhæsion på ECM.

Ved at udnytte en HGC, kan mikroskopisk billeddannelse med eller uden laser eksponering udføres i flere retninger. En 3D prøve figur kan genkendes ca af multi-retningsbestemt observation uden fluorescerende mærkning; denne metode forårsager ikke nogen celle invasionsevne under observation. Derimod er fluorescerende imaging nødvendig for at opnå en mere nøjagtig 3D stikprøve form og molekylær udtryk.

Begrænsning af metoden præsenteres for første celle kontrol er, at det ikke kan anvendes til en støbeform med en kompleks 3D figur. Formen har fjernes med picking uden forværrede ECM. Formen er således begrænset til en enkel lige eller koniske form. Du kan få mere komplekse form kontrol, er yderligere udvikling af protokollen nødvendig.

Den foreslåede metode har bred nytte og let kan udføres i de fleste af laboratoriet miljøer. Denne enkle procedure kan overvinde begrænsningerne af 3D kultur, billedbehandling og repeterbarhed og bidrage til den videre udvikling kræves for 3D kultur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne og Osaka Prefecture Universitet og Kyushu Institute of Technology har indgivet en patentansøgning om en hybrid gel cube enhed, og Nippon medicinske og kemiske instrumenter Co. Ltd, Japan har for nylig kommercialiserede kuben. Selskabet ikke påvirke nogen af design, proces og beskrevne metoder.

Acknowledgments

Dette arbejde blev økonomisk støttet af JSPS KAKENHI (18H 04765) og programmet for at udbrede Tenure Track System, MEXT, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plate Corning  Inc. 3513
2-Methoxy-1-methylethyl Acetate FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. 130-10505 PGMEA, CAS: 108-65-6 
4% paraformaldehyde FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. 161-20141 CAS: 30525-89-4
Agarose, low gelling temperature  BioReagent Sigma-Aldrich A9414
Alexa fluor 488 phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
AZ1512 Merck
BEGM bullet kit Lonza CC-3170 Specialized medium for NHBE cells
Bovine Serum Albumin solution (10 %) Sigma-Aldrich A1595
EGM-2 bullet kit Lonza CC-3162 Specialized medium for endothelial cells
Lipidure NOF co. MPC polymer
Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix Corning  Inc. 354230
Normal Goat Serum (10%) Thermo Fisher Scientific 50197Z
Normal human bronchial epithelial cells Lonza CC-2541
SILPOT 184 W/C Dow Corning Co. 3255981 Base resin and catalyst for PDMS
SUEX D300 DJ MicroLaminates, Inc Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)
Triton X-100 (1%) Thermo Fisher Scientific HFH10
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
  3. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  4. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  5. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  6. Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
  7. Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
  8. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
  9. Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
  10. Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  11. Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  12. Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
  13. Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
  14. Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
  15. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
  16. Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  17. Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
  18. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
  19. Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
  20. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  21. Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).

Tags

Bioteknologi sag 145 3D kontrol 3D kultur in vitro-eksperiment mønster dannelse luftvejene grene multi-directional imaging
Indledende 3D celle klynge kontrol i en Hybrid Gel Cube enhed for gentagelig mønster formationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara,… More

Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations. J. Vis. Exp. (145), e59214, doi:10.3791/59214 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter