Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans
Summary
Mitochondriale ademhaling is van cruciaal belang voor de overleving van het organisch; Daarom is zuurstof verbruik tarief is een uitstekende indicator voor mitochondriale gezondheid. In dit protocol, beschrijven we het gebruik van een commercieel beschikbare respirometer voor het meten van basale en maximale zuurstof verbruik in leven, intact, en vrij-sporenvormende Caenorhabditis elegans.
Abstract
Optimale mitochondriale functie is essentieel voor gezonde cellulaire activiteit, met name in de cellen met hoge energie eisen zoals die in het zenuwstelsel en de spieren. Overeenstemming met dit, mitochondriale dysfunctie is in verband gebracht met een groot aantal neurodegeneratieve ziektes en veroudering in het algemeen. Caenorhabditis elegans geweest een krachtige modelsysteem voor het ophelderen van de vele fijne kneepjes van mitochondriale functie. Mitochondriale ademhaling is een sterke indicator van mitochondriale functie en onlangs ontwikkelde respirometers bieden een state-of-the-art platform voor het meten van de ademhaling in cellen. In dit protocol bieden wij een techniek voor het analyseren van de live, intact C. elegans. Dit protocol omvat een periode van ~ 7 dagen en bevat stappen voor het (1) groeien en synchronisatie van C. elegans, (2) voorbereiding van verbindingen worden geïnjecteerd en hydratatie van de sondes, (3) drug laden en cartridge evenwichtsinstelling, (4) voorbereiding van worm assay plaat en test uitvoeren, en (5) na experiment data-analyse.
Introduction
Adenosinetrifosfaat (ATP), de belangrijkste bron van cellulaire energie, wordt geproduceerd in de mitochondriën door enzymen in het elektronentransport keten (ETC) gelegen in het binnenste van de mitochondriale membraan. Pyruvaat, een belangrijke metaboliet gebruikt voor mitochondriale ATP productie, wordt geïmporteerd in de mitochondriale matrix waar er gedecarboxyleerd tot acetyl coenzym A (CoA). Vervolgens treedt acetyl CoA de citroenzuurcyclus resulterend in de generatie van nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), een belangrijke elektron vervoerder molecuul. Zoals elektronen uit NADH worden doorgegeven aan zuurstof via de enz, opbouwen protonen in de mitochondriale intermembrane ruimte, wat in het genereren van een elektrochemische gradiënt over het membraan resulteert. Deze protonen zal dan vloeien voort uit de intermembrane ruimte over deze elektrochemische gradiënt terug naar de mitochondriale matrix door middel van de proton porie van de ATP-synthase, rijden de rotatie en de synthese van ATP1 (Figuur 1).
Mitochondriale functie is niet beperkt tot de productie van energie, maar is ook van cruciaal belang voor de calcium-homeostase, reactieve zuurstof soorten (ROS) opruiming en apoptosis, kritisch positionering van hun functie in organisch gezondheid2. Mitochondriale functie kan worden beoordeeld met behulp van een verscheidenheid van tests, met inbegrip van maar niet beperkt tot analyses die meten van Mitochondriale membraanpotentiaal, ATP en ROS niveaus en concentraties van de mitochondriale calcium. Echter misschien deze testen bieden een enkele momentopname van mitochondriale functie en daarom niet een uitgebreid overzicht van mitochondriale gezondheid. Omdat zuurstofverbruik tijdens ATP generatie afhankelijk van een groot aantal opeenvolgende reacties is, dient het als een superieure indicator van mitochondriale functie. Interessant is dat verschillen in zuurstof verbruik geconstateerd als gevolg van mitochondriale dysfunctie3,4,5.
Zuurstof verbruik (OCR) levende monsters kan worden gemeten met behulp van technieken die kunnen grofweg worden verdeeld in twee groepen: amperometrische zuurstofsensoren en porfyrine gebaseerde fosfordeeltjes die kunnen worden gehard door zuurstof6. Amperometrische zuurstofsensoren zijn uitvoerig gebruikt om maatregel OCR in gekweekte cellen, weefsels, en in modelsystemen, zoals C. elegans. Echter porfyrine gebaseerde fosforen met respirometers bezitten de volgende voordelen: (1) zij voorzien in een side-by-side vergelijking van twee monsters in drievoud, (2) ze kleinere steekproefgrootte vereisen (bijvoorbeeld 20 wormen per putje versus ~ 2, 000−5, 000 wormen de kamer)7, en (3) de respirometer kan worden geprogrammeerd om te doen vier verschillende samengestelde injecties op gewenste tijden gedurende de experimentele, eliminerend de behoefte aan manuele toepassing.
In dit protocol zijn de stappen die betrokken zijn bij het gebruik van een porfyrine gebaseerde zuurstof detecterende respirometer maatregel OCR in live, intact C. elegans beschreven. Hoewel er een schriftelijke protocol voor het gebruik van het grote formaat, hoge doorvoer respirometer8, is dit protocol aangepast voor gebruik met een meer budget-vriendelijk, toegankelijk en kleinere schaal instrument geweest. Dit protocol is vooral handig voor het beoordelen van het verschil in OCR tussen twee stammen, waar high-throughput screening is niet nodig en het gebruik ervan overdreven hoog zouden uitvallen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitochondriale ademhaling is een inzichtelijke indicator van mitochondriale functie; Daarom is het zeer waardevol kunnend meten de zuurstof verbruik in een biologisch systeem, of in vitro of in vivo. Respirometers zin zuurstofniveaus met behulp van porfyrine gebaseerde fosfordeeltjes die uitgeblust krijgen door zuurstof of via amperometrische zuurstofsensoren die afhankelijk zijn van de generatie van een elektrische huidige evenredige zuurstof onder druk. Clark-elektrode in de laatstgenoemde categorie valt en is uitgebre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs wil erkennen van Dr. Kevin Bittman voor zijn leiding bij de vaststelling van de Seahorse XFp in het lab. National Institutes of Health verlenen dat gm088213 ondersteund dit werk.
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
- Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
- Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
- Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
- Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents–carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer’s disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).
