A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Mitochondriale ademhaling is van cruciaal belang voor de overleving van het organisch; Daarom is zuurstof verbruik tarief is een uitstekende indicator voor mitochondriale gezondheid. In dit protocol, beschrijven we het gebruik van een commercieel beschikbare respirometer voor het meten van basale en maximale zuurstof verbruik in leven, intact, en vrij-sporenvormende Caenorhabditis elegans.

Abstract

Optimale mitochondriale functie is essentieel voor gezonde cellulaire activiteit, met name in de cellen met hoge energie eisen zoals die in het zenuwstelsel en de spieren. Overeenstemming met dit, mitochondriale dysfunctie is in verband gebracht met een groot aantal neurodegeneratieve ziektes en veroudering in het algemeen. Caenorhabditis elegans geweest een krachtige modelsysteem voor het ophelderen van de vele fijne kneepjes van mitochondriale functie. Mitochondriale ademhaling is een sterke indicator van mitochondriale functie en onlangs ontwikkelde respirometers bieden een state-of-the-art platform voor het meten van de ademhaling in cellen. In dit protocol bieden wij een techniek voor het analyseren van de live, intact C. elegans. Dit protocol omvat een periode van ~ 7 dagen en bevat stappen voor het (1) groeien en synchronisatie van C. elegans, (2) voorbereiding van verbindingen worden geïnjecteerd en hydratatie van de sondes, (3) drug laden en cartridge evenwichtsinstelling, (4) voorbereiding van worm assay plaat en test uitvoeren, en (5) na experiment data-analyse.

Introduction

Adenosinetrifosfaat (ATP), de belangrijkste bron van cellulaire energie, wordt geproduceerd in de mitochondriën door enzymen in het elektronentransport keten (ETC) gelegen in het binnenste van de mitochondriale membraan. Pyruvaat, een belangrijke metaboliet gebruikt voor mitochondriale ATP productie, wordt geïmporteerd in de mitochondriale matrix waar er gedecarboxyleerd tot acetyl coenzym A (CoA). Vervolgens treedt acetyl CoA de citroenzuurcyclus resulterend in de generatie van nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), een belangrijke elektron vervoerder molecuul. Zoals elektronen uit NADH worden doorgegeven aan zuurstof via de enz, opbouwen protonen in de mitochondriale intermembrane ruimte, wat in het genereren van een elektrochemische gradiënt over het membraan resulteert. Deze protonen zal dan vloeien voort uit de intermembrane ruimte over deze elektrochemische gradiënt terug naar de mitochondriale matrix door middel van de proton porie van de ATP-synthase, rijden de rotatie en de synthese van ATP¹ (Figuur 1).

Mitochondriale functie is niet beperkt tot de productie van energie, maar is ook van cruciaal belang voor de calcium-homeostase, reactieve zuurstof soorten (ROS) opruiming en apoptosis, kritisch positionering van hun functie in organisch gezondheid². Mitochondriale functie kan worden beoordeeld met behulp van een verscheidenheid van tests, met inbegrip van maar niet beperkt tot analyses die meten van Mitochondriale membraanpotentiaal, ATP en ROS niveaus en concentraties van de mitochondriale calcium. Echter misschien deze testen bieden een enkele momentopname van mitochondriale functie en daarom niet een uitgebreid overzicht van mitochondriale gezondheid. Omdat zuurstofverbruik tijdens ATP generatie afhankelijk van een groot aantal opeenvolgende reacties is, dient het als een superieure indicator van mitochondriale functie. Interessant is dat verschillen in zuurstof verbruik geconstateerd als gevolg van mitochondriale dysfunctie^3,4,5.

Zuurstof verbruik (OCR) levende monsters kan worden gemeten met behulp van technieken die kunnen grofweg worden verdeeld in twee groepen: amperometrische zuurstofsensoren en porfyrine gebaseerde fosfordeeltjes die kunnen worden gehard door zuurstof⁶. Amperometrische zuurstofsensoren zijn uitvoerig gebruikt om maatregel OCR in gekweekte cellen, weefsels, en in modelsystemen, zoals C. elegans. Echter porfyrine gebaseerde fosforen met respirometers bezitten de volgende voordelen: (1) zij voorzien in een side-by-side vergelijking van twee monsters in drievoud, (2) ze kleinere steekproefgrootte vereisen (bijvoorbeeld 20 wormen per putje versus ~ 2, 000−5, 000 wormen de kamer)⁷, en (3) de respirometer kan worden geprogrammeerd om te doen vier verschillende samengestelde injecties op gewenste tijden gedurende de experimentele, eliminerend de behoefte aan manuele toepassing.

In dit protocol zijn de stappen die betrokken zijn bij het gebruik van een porfyrine gebaseerde zuurstof detecterende respirometer maatregel OCR in live, intact C. elegans beschreven. Hoewel er een schriftelijke protocol voor het gebruik van het grote formaat, hoge doorvoer respirometer⁸, is dit protocol aangepast voor gebruik met een meer budget-vriendelijk, toegankelijk en kleinere schaal instrument geweest. Dit protocol is vooral handig voor het beoordelen van het verschil in OCR tussen twee stammen, waar high-throughput screening is niet nodig en het gebruik ervan overdreven hoog zouden uitvallen.

Protocol

Opmerking: Figuur 2 geeft een schematisch overzicht van het volledige protocol. 1. groei en synchronisatie van nematode bevolking9,10 Overdracht van L4 larven van gewenste genetische achtergronden (bijvoorbeeld N2 [wild type] en sel-12 dieren) op nematode groei media (NGM) platen (Zie tabel 1 voor recept) vers bezaaid met een gazon van Escherichia coli (OP50)11. Ten minste twee 100 mm of drie 60 mm platen te gebruiken voor elke stam. Incubeer de wormen bij de temperatuur van de juiste groei (tussen 15-25 ° C) voor 3-4 dagen of totdat de platen zijn geconcentreerd met groot aantal eieren en gravid wormen. Wassen van de eieren en de wormen uit de platen met behulp van ongeveer 6 mL M9 buffer (Zie tabel 1 voor recept) per 100 mm plaat van nematoden en overdracht glas mee Pasteur pipetten in individuele 15 mL centrifuge buizen voor elke stam. Draai deze buizen omlaag gedurende 3 minuten op 6.180 x g en aspirate uit de buffer van de M9, behoud van enkel de pellet dieren en eieren. Voeg 3-4 mL bleekwater oplossing (Zie tabel 1 voor recept) aan elke buis en met tussenpozen vortex voor 6 min. toevoegen M9 buffer te vullen van elke buis en draaien op 6,180 x g voor 1 min en supernatant gecombineerd. Herhaal dit wassen met M9 driemaal en verplaatsen van de ei-pellet tot een vers 15 mL koker met ongeveer 9 mL M9 buffer. Synchroniseren van de vers gearceerde wormen door nutating bij 20 ° C gedurende 16 – 48 h. Spin deze buizen omlaag bij 6,180 x g gedurende 1,5 min en de gesynchroniseerde L1 dieren neergezet op afzonderlijke NGM platen vers bezaaid met een gazon van OP50 (ongeveer 6000-10.000 dieren per 100 mm plaat) en houden bij 20 ° C. Deze dieren zullen het larvale stadium van L4 bereiken na ~ 42 h. Op dit moment gaan de larven van de L4 met behulp van een platina pick te OP50 zaadjes NGM platen met 0,5 mg / mL 5-fluoro-2′-deoxyuridine (FUdR) om te voorkomen dat ze produceren nakomelingen.Opmerking: Zorg ervoor dat alle spanningen binnen een experiment zijn gesynchroniseerd voor een vergelijkbare hoeveelheid tijd. FUdR behandeling Steriliseert de dieren en voorkomt leggen en nakomelingen eiproductie, die OCR kan beïnvloeden. Deze gesteriliseerde dieren zullen de volgende dag (dag 1 volwassen dieren bij ~ 66 h) voor de bepaling worden geanalyseerd. FUdR is gemeld aan de Fysiologie en levensduur van bepaalde mutant worms beïnvloeden. Dus, dit moet rekening worden gehouden wanneer het geneesmiddel wordt gebruikt voor sterilisatie12,13,14. Wormen kunnen ook worden gesteriliseerd door middel van vrouwelijker mutaties zoals fem-1(hc17) of fem-3(e2006). Deze mutaties kunnen echter van invloed zijn mitochondriale functie. 2. voorbereiding van de verbindingen worden geïnjecteerd en hydratatie van sondes Opmerking: Tijdens de test uitvoeren, zowel basaal en maximale ademhaling de nematoden zijn gemeten. Maximale ademhaling wordt geactiveerd in de dieren op de toevoeging van carbonyl cyanide-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), een ontkoppelingseiwit ionophore dat de Mitochondriale membraanpotentiaal verstoort en dus de ATP-synthese door het vervoer van protonen door middel van de mitochondriale membraan, terwijl het proton pompen, elektronentransport en zuurstofverbruik te gaan4,15 rekken van de ATP-synthese (Figuur 1). De laatste stap in de bepaling omvat de toevoeging van natriumazide (NaN3), een geneesmiddel dat complexen IV en V in het ETC remt, zodat naar niet-mitochondriale ademhaling16 (Figuur 1) te bepalen. De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd op de dag vóór de eigenlijke test run. Bereiden 1 mL stamoplossingen van de FCCP (10 mM dimethylsulfoxide [DMSO]: 1000 x de laatste assay concentratie) en NaN3 (400 mM dH2O: 10 x laatste assay concentratie) en winkel bij-20 ° C.Opmerking: Voer een concentratie curve voor het optimaliseren van de concentratie van FCCP moet uitlokken maximale OCR reactie voor elk instrument en laboratorium instelling. Hydrateer de sensor cartridge door toevoeging van 200 µL dH2O aan elk putje (en de omliggende reservoir) in het slagperk, ervoor te zorgen dat de sensor sondes zijn ondergedompeld in de dH2O en winkel ‘s nachts bij kamertemperatuur.Opmerking: De cartridge sondes kunnen worden overgelaten ondergedompeld voor maximaal 72 uur maar in het geval van een langdurige hydratatie, de platen moeten worden verpakt in paraffine film en opgeslagen bij 4 ° C. Als overnachting hydratatie niet mogelijk is, moet de sensor cartridge voor ten minste 4 uur vóór de test worden gehydrateerd. Uitschakelen van het verwarmingselement binnen de interface van de respirometer en sla het instrument binnen een incubator van de 15 ° C’s nachts tot lagere kerntemperatuur binnen het instrument om te voorkomen dat de dieren oververhitting tijdens de test worden uitgevoerd.Opmerking: De respirometer is uitgerust met een verwarmingselement maar niet kan worden gekoeld. Binnen een 15 ° C incubator, zal de respirometer hebben een stabiele temperatuur tussen 18-22 ° C, die een gezonde temperatuur voor C. elegans onderhoud. 3. geneesmiddel laden en cartridge evenwichtsinstelling Pipetteer uit en gooi de dH2O gebruikt om te hydrateren de sensor sondes en 200 µL van de kalibrant oplossing (pH 7.4) in elk putje te vervangen. Verdun de stockoplossing van de FCCP tot 100 µM FCCP in dH2O en Voeg 20 µL van de verdunde oplossing tot de injectie poort A in de sensor-patroon. 22 µL van 400 mM natriumazide toevoegen aan poort B van de senor patroon. Zet de respirometer op en op het beginscherm Selecteer Start; de sjablonen pagina verschijnt. Selecteer op de pagina sjablonen leeg of een eerder ontworpen sjabloon; de groepen pagina verschijnt. Op de pagina groepen selecteren de putjes A en H als de achtergrond putten en de resterende 6 putjes in de juiste groepen volgens de proefopzet toewijzen. Druk op de pijl op de lagere juiste hoek om te gaan naar de pagina van het Protocol. Zorg ervoor dat de knoppen uitgebalanceerd, basale en injecties 1 en 2 zijn geselecteerd op de pagina Protocol. Op deze pagina, het aanpassen van het aantal lezingen van basale OCR, alsmede maximale OCR (na injectie 1 met FCCP) en niet-mitochondriale OCR (na injectie 2 met natriumazide).Opmerking: Elke meting wordt voorafgegaan door een mix en wacht stap en de termijnen voor deze parameters worden weergegeven in tabel 2. Selecteer de pijl op de lagere juiste hoek en een prompt voor het laden van de sensor cartridge plaat verschijnt. Zorg ervoor dat de sensor cartridge plaat in de juiste richting, volg de instructies op het snelle scherm van herinnering is geladen. De respirometer zal nu de cartridge equilibreer.Opmerking: Deze evenwichtsinstelling biedt ruimschoots de tijd om de dieren in passende putjes van de plaat van de cel worden bepaald. 4. voorbereiding van de worm plaat en kwantitatieve analyse uitvoeren Voeg 200 µL van M9 buffer in elk van de 8 putjes van de plaat van de cel en in de reservoirs rondom de putten. Kies ~ 100 wormen uit elke stam op unseeded NGM platen en laat rusten gedurende 2-3 minuten nat het einde van de platina pick met M9 buffer en pak 20 leeftijd-gesynchroniseerde dieren in putten B-G, als u de achtergrond putten A en H leeg laat.Opmerking: Na het laden elk goed, wacht ongeveer 2 min om de dieren te vestigen in de bodem van de putten. Het is ook raadzaam dat een worm nummer curve voor het optimaliseren van het nummer van de worm per putje voor elk instrument en laboratorium instelling worden uitgevoerd. Nu, de respirometer moet worden gekalibreerd en u op OK klikt op het scherm, de plaat met kalibratie buffer wordt uitgeworpen en kan worden verwijderd uit de respirometer, terwijl de sensor cartridge binnen het instrument blijft. De plaat kalibrant wordt vervangen door de plaat met dieren. Laden van de plaat en sluit de deur door te raken Doorgaan en toestaan van de bepaling uit te voeren. 5. na experiment gegevensanalyse Zodra de test run voltooid is, volg de aanwijzingen op het scherm en verwijder de cel plaat en sensor cartridge en sluit een flashstation in de USB-poort van de run gegevens opslaan in de indeling .war. Verwijder de cassette sensor en toestaan dat de dieren het aantal dieren per putje te regelen naar de onderkant van de putten voor ongeveer 2 min. plaats de platen van de cel onder een stereo microscoop ontleden. Open de analysesoftware op de computer en opent u het tabblad normalisatie te normaliseren OCR op dierlijke getal. Toepassing van passende etiketten voor de verschillende groepen onder het tabblad wijzigen en het bestand als een prisma-bestand voor verdere analyse exporteren.Opmerking: Het gemiddelde van de eerste vijf metingen, voordat de toevoeging van FCCP de basale OCR, terwijl het gemiddelde van de vijf metingen is na toevoeging van de FCCP de maximale OCR is en het gemiddelde van de laatste vijf metingen (minimum van twee metingen moet gebeuren) na natrium azide toevoeging de niet-mitochondriale ademhalingsfrequentie is. De bepaling moet driemaal worden herhaald om de reproduceerbaarheid.

Representative Results

Met behulp van het protocol die hierin worden beschreven, OCR van wild type dieren en drie verschillende sel-12 mutant stammen werden bepaald. Sel-12 codeert de C. elegans ortholog presenilin17. Mutaties in menselijke presenilin zijn de meest voorkomende genetische aberratie in verband met de ontwikkeling van familiale van Alzheimer18. Onze studies hebben aangetoond verhoogde mitochondrial calciumgehalte in sel…

Discussion

Mitochondriale ademhaling is een inzichtelijke indicator van mitochondriale functie; Daarom is het zeer waardevol kunnend meten de zuurstof verbruik in een biologisch systeem, of in vitro of in vivo. Respirometers zin zuurstofniveaus met behulp van porfyrine gebaseerde fosfordeeltjes die uitgeblust krijgen door zuurstof of via amperometrische zuurstofsensoren die afhankelijk zijn van de generatie van een elektrische huidige evenredige zuurstof onder druk. Clark-elektrode in de laatstgenoemde categorie valt en is uitgebre…

Materials

100 mm, 60 mm Petri dishes	Kord-Valmark Labware Products	2900, 2901
1.5 mL centrifuge tubes	Globe Scientific	6285
15 mL conical tubes	Corning	430791
22 × 22 mm coverslip	Globe Scientific	1404-10
50 mL conical tubes	Corning	430829
Agar	Fisher Scientific	BP1423-2
Bacto peptone	BD, Bacto	211677
Bacto tryptone	BD, Bacto	211705
Bacto yeast extract	BD, Bacto	212705
Bleach	Generic
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Abcam	ab120081
Cholesterol	Fisher Scientific	C314-500
Deionized water (dH2O)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Thomas Scientific	C987Y85
Glass Pasteur pipettes	Krackeler Scientific	6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)	Fisher Scientific	BP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-500
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	BP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	Fisher Scientific	BP332-1
Seahorse XFp Analyzer	Agilent
Seahorse XFp FluxPak	Agilent	103022-100
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002