Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans
Summary
La respiración mitocondrial es crítica para la supervivencia; por lo tanto, la tasa de consumo de oxígeno es un excelente indicador de la salud mitocondrial. En este protocolo, describimos el uso de un respirómetro comercialmente disponible a medida basal y las tasas de consumo de oxígeno máximo en vivo, intacto y libremente móviles elegans de Caenorhabditis.
Abstract
Función mitocondrial óptima es fundamental para la actividad celular saludable, particularmente en las células que tienen demandas de alta energía como los del sistema nervioso y muscular. Consistente con esto, la disfunción mitocondrial se ha asociado con una miríada de enfermedades neurodegenerativas y envejecimiento en general. Elegans de Caenorhabditis han sido un sistema potente para elucidar las muchas complejidades de la función mitocondrial. La respiración mitocondrial es un fuerte indicador de la función mitocondrial y respirometers recientemente desarrollados ofrecen una plataforma de avanzada para medir la respiración en las células. En este protocolo, ofrecemos una técnica para analizar vivo, intacto C. elegans. Este protocolo abarca un período de ~ 7 días e incluye pasos para el crecimiento y la sincronización de C. elegans, (2) preparación de compuestos que se inyecta y la hidratación de las puntas de prueba, equilibrado de carga y el cartucho (3) drogas (4) preparación de análisis de gusano (1) placa y serie y análisis de datos post-experimento (5).
Introduction
Trifosfato de adenosina (ATP), la principal fuente de energía celular, se produce en las mitocondrias por enzimas de la cadena de transporte de electrones (ETC) situadas en la membrana mitocondrial interna. Piruvato, un metabolito clave utilizado para la producción de ATP mitocondrial, se importa a la matriz mitocondrial donde es descarboxilada para producir acetil coenzima A (CoA). Posteriormente, el acetil CoA entra en el ciclo del ácido cítrico resultando en la generación de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), una molécula de portador de la clave electrónica. Como pasan electrones del NADH al oxígeno vía lo etc., los protones se acumulan en el espacio de intermembrane mitocondrial, que se traduce en la generación de un gradiente electroquímico a través de la membrana. Estos protones entonces fluirá desde el espacio del intermembrane a través de este gradiente electroquímico hacia la matriz mitocondrial a través del poro de protones de la ATP Sintetasa, conduciendo la rotación y la síntesis de ATP1 (figura 1).
La función mitocondrial no se limita a la producción de energía pero también es fundamental para la homeostasis del calcio, especies reactivas del oxígeno (ROS) barrido y apoptosis, posicionamiento críticamente su función en la salud2. La función mitocondrial puede ser evaluada usando una variedad de ensayos, incluyendo pero no limitado a los análisis que miden el potencial de membrana mitocondrial, ATP y ROS y las concentraciones de calcio mitocondrial. Sin embargo, estos ensayos ofrecen una sola instantánea de la función mitocondrial y por lo tanto no pueden proporcionar una visión integral de la salud mitocondrial. Puesto que el consumo de oxígeno durante la generación del ATP depende de un sinnúmero de reacciones secuenciales, sirve como un indicador superior de la función mitocondrial. Curiosamente, se han observado variaciones en las tasas de consumo de oxígeno como consecuencia de la disfunción mitocondrial3,4,5.
Tasas de consumo de oxígeno (OCR) de muestras de la vida pueden ser medidas usando técnicas que se pueden dividir ampliamente en dos grupos: amperométrico Sensores de oxígeno y los fósforos basados en porfirina que pueden ser saciadas por oxígeno6. Los sensores de oxígeno amperométrico se han utilizado extensivamente para medida OCR en cultivos de células, tejidos y en sistemas modelo, como C. elegans. Sin embargo, los fósforos basados en porfirina que contiene respirometers poseen las siguientes ventajas: (1) permiten una comparación lado a lado de dos muestras por triplicado, (2) requieren de más pequeño tamaño de la muestra (por ejemplo, 20 gusanos por pozo versus ~ 2, 000−5, 000 lombrices en el cámara)7y (3) el respirómetro se puede programar para hacer cuatro inyecciones compuestas diferentes a deseado a veces a lo largo de la carrera experimental, eliminando la necesidad de aplicación manual.
En este protocolo, pasos en el uso de un sensor de oxígeno de base de porfirina respirómetro a medida OCR en vivo, intacto C. elegans son descritos. Aunque no existe un protocolo escrito para el uso de gran formato, alto rendimiento respirómetro8, este protocolo ha sido adaptado para su uso con el instrumento más presupuesto amigable, accesible y menor escala. Este protocolo es útil para evaluar la diferencia de OCR entre dos cepas, donde no es necesaria la proyección de alto rendimiento y su uso sería excesivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La respiración mitocondrial es un perspicaz indicador de la función mitocondrial; por lo tanto, ser capaz de medir las tasas de consumo de oxígeno en un sistema biológico, ya sea in vitro o en vivo es muy valiosa. Respirometers detectar niveles de oxígeno usando fósforos de porfirina que haz apagados por oxígeno o por medio de sensores de oxígeno amperométrico que dependen de la generación de una eléctrica actual proporcional a la presión de oxígeno. Electrodo de Clark cae en esta última categoría y se ha …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer el Dr. Kevin Bittman para su orientación en el establecimiento de la XFp de Caballito de mar en el laboratorio. Institutos nacionales de salud otorgar que gm088213 apoya esta labor.
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
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