Summary
La respiración mitocondrial es crítica para la supervivencia; por lo tanto, la tasa de consumo de oxígeno es un excelente indicador de la salud mitocondrial. En este protocolo, describimos el uso de un respirómetro comercialmente disponible a medida basal y las tasas de consumo de oxígeno máximo en vivo, intacto y libremente móviles elegans de Caenorhabditis.
Abstract
Función mitocondrial óptima es fundamental para la actividad celular saludable, particularmente en las células que tienen demandas de alta energía como los del sistema nervioso y muscular. Consistente con esto, la disfunción mitocondrial se ha asociado con una miríada de enfermedades neurodegenerativas y envejecimiento en general. Elegans de Caenorhabditis han sido un sistema potente para elucidar las muchas complejidades de la función mitocondrial. La respiración mitocondrial es un fuerte indicador de la función mitocondrial y respirometers recientemente desarrollados ofrecen una plataforma de avanzada para medir la respiración en las células. En este protocolo, ofrecemos una técnica para analizar vivo, intacto C. elegans. Este protocolo abarca un período de ~ 7 días e incluye pasos para el crecimiento y la sincronización de C. elegans, (2) preparación de compuestos que se inyecta y la hidratación de las puntas de prueba, equilibrado de carga y el cartucho (3) drogas (4) preparación de análisis de gusano (1) placa y serie y análisis de datos post-experimento (5).
Introduction
Trifosfato de adenosina (ATP), la principal fuente de energía celular, se produce en las mitocondrias por enzimas de la cadena de transporte de electrones (ETC) situadas en la membrana mitocondrial interna. Piruvato, un metabolito clave utilizado para la producción de ATP mitocondrial, se importa a la matriz mitocondrial donde es descarboxilada para producir acetil coenzima A (CoA). Posteriormente, el acetil CoA entra en el ciclo del ácido cítrico resultando en la generación de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), una molécula de portador de la clave electrónica. Como pasan electrones del NADH al oxígeno vía lo etc., los protones se acumulan en el espacio de intermembrane mitocondrial, que se traduce en la generación de un gradiente electroquímico a través de la membrana. Estos protones entonces fluirá desde el espacio del intermembrane a través de este gradiente electroquímico hacia la matriz mitocondrial a través del poro de protones de la ATP Sintetasa, conduciendo la rotación y la síntesis de ATP1 (figura 1).
La función mitocondrial no se limita a la producción de energía pero también es fundamental para la homeostasis del calcio, especies reactivas del oxígeno (ROS) barrido y apoptosis, posicionamiento críticamente su función en la salud2. La función mitocondrial puede ser evaluada usando una variedad de ensayos, incluyendo pero no limitado a los análisis que miden el potencial de membrana mitocondrial, ATP y ROS y las concentraciones de calcio mitocondrial. Sin embargo, estos ensayos ofrecen una sola instantánea de la función mitocondrial y por lo tanto no pueden proporcionar una visión integral de la salud mitocondrial. Puesto que el consumo de oxígeno durante la generación del ATP depende de un sinnúmero de reacciones secuenciales, sirve como un indicador superior de la función mitocondrial. Curiosamente, se han observado variaciones en las tasas de consumo de oxígeno como consecuencia de la disfunción mitocondrial3,4,5.
Tasas de consumo de oxígeno (OCR) de muestras de la vida pueden ser medidas usando técnicas que se pueden dividir ampliamente en dos grupos: amperométrico Sensores de oxígeno y los fósforos basados en porfirina que pueden ser saciadas por oxígeno6. Los sensores de oxígeno amperométrico se han utilizado extensivamente para medida OCR en cultivos de células, tejidos y en sistemas modelo, como C. elegans. Sin embargo, los fósforos basados en porfirina que contiene respirometers poseen las siguientes ventajas: (1) permiten una comparación lado a lado de dos muestras por triplicado, (2) requieren de más pequeño tamaño de la muestra (por ejemplo, 20 gusanos por pozo versus ~ 2, 000−5, 000 lombrices en el cámara)7y (3) el respirómetro se puede programar para hacer cuatro inyecciones compuestas diferentes a deseado a veces a lo largo de la carrera experimental, eliminando la necesidad de aplicación manual.
En este protocolo, pasos en el uso de un sensor de oxígeno de base de porfirina respirómetro a medida OCR en vivo, intacto C. elegans son descritos. Aunque no existe un protocolo escrito para el uso de gran formato, alto rendimiento respirómetro8, este protocolo ha sido adaptado para su uso con el instrumento más presupuesto amigable, accesible y menor escala. Este protocolo es útil para evaluar la diferencia de OCR entre dos cepas, donde no es necesaria la proyección de alto rendimiento y su uso sería excesivo.
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Protocol
Nota: La figura 2 proporciona un Resumen esquemático del protocolo completo.
1. crecimiento y sincronización de población del nematodo9,10
- Transferencia de larvas L4 de fondos genéticos deseados (por ejemplo, N2 [tipo] y sel-12 animales) sobre nematodos media (NGM) placas de crecimiento (ver tabla 1 para receta) recién sembradas con césped de Escherichia coli (OP50)11. Uso de m m 100 por lo menos dos o tres placas de 60 mm para cada cepa. Incubar los gusanos a la temperatura de crecimiento adecuada (entre 15 y 25 ° C) durante 3 – 4 días o hasta que las placas se concentran con gran número de huevos y gusanos grávidos.
- Lavar los huevos y gusanos de las planchas con aproximadamente 6 mL de buffer M9 (ver tabla 1 para receta) por placa de 100 mm de nematodos y transferencia con vidrio Pipetas Pasteur en tubos de centrífuga de 15 mL individuales para cada cepa. Girar los tubos por 3 min a 6.180 x g y aspire hacia fuera el buffer M9, conservando sólo la pelotilla de animales y huevos.
- Agregar 3 – 4 mL de solución de lejía (ver tabla 1 para la receta) a cada tubo e intermitentemente vortex de 6 minutos añadir M9 buffer llenar cada tubo y girar a 6.180 x g durante 1 min y aspirar el sobrenadante. Repetir este lavado con M9 tres veces y pasar el sedimento de huevo a un nuevo tubo 15 mL aproximadamente de 9 ml de tampón de M9.
- Sincronizar los gusanos recién eclosionados por oscilante a 20 ° C para 16 – 48 h. vuelta estos tubos abajo a 6.180 x g durante 1,5 min y dejar que los animales sincronizados de L1 en platos individuales de NGM recién sembrados con césped de OP50 (aproximadamente 6.000 – 10.000 animales por placa de 100 mm) y mantener a 20 ° C.
- Estos animales llegará a la etapa larval L4 después de ~ 42 h. En este momento, mover las larvas L4 usando una selección platino a OP50 sembrado NGM placas que contienen 0,5 mg / mL 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR) para evitar de producir progenie.
Nota: Asegúrese de que dentro de un experimento todas las cepas son sincronizadas por una cantidad similar de tiempo. Tratamiento de FUdR esteriliza a los animales y evita la producción de huevos colocación y progenie, lo que podría influir en OCR. Al día siguiente (día 1 animales en h ~ 66) para el ensayo se analizarán estos animales esterilizados. FUdR se ha divulgado para afectar la fisiología y la vida útil de ciertos gusanos mutantes. Por lo tanto, esto debe tomarse en consideración cuando el fármaco se utiliza para esterilización12,13,14. Lombrices también pueden esterilizarse por medio de feminizante mutaciones como fem-1(hc17) o fem-3(e2006). Sin embargo, estas mutaciones pueden afectar la función mitocondrial.
2. preparación de compuestos que se inyecta y la hidratación de las puntas de prueba
Nota: Durante la serie, se miden dos tipos de respiración basal y máxima de los nematodos. Máxima respiración se dispara en los animales con la adición de carbonilo cianuro-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), un ionóforo desacoplar que perturba el potencial de membrana mitocondrial y síntesis de ATP al transporte de protones a través de la membrana mitocondrial, permitiendo el bombeo de protones, transporte de electrones y el consumo de oxígeno a4,15 desacoplado de la síntesis de ATP (figura 1). El paso final en el ensayo consiste en la adición de azida sódica (NaN3), un fármaco que inhibe los complejos IV y V en el etc., que le permitirán determinar la respiración no mitocondrial16 (figura 1). Los siguientes pasos se pueden realizar el día antes de la carrera de análisis real.
- Preparar 1 mL de las soluciones madre de la FCCP (10 mM en dimetilsulfóxido [DMSO]: 1000 x la concentración de ensayo final) y NaN3 (400 mM en dH2O: 10 x concentración final del ensayo) y almacenar a-20 ° C.
Nota: Una curva de concentración para optimizar la concentración de FCCP necesaria para obtener la respuesta máxima de OCR para cada instrumento y el entorno de laboratorio. - Hidratar el cartucho de sensor mediante la adición de 200 μL de dH2O para cada bien (y el pantano circundante) en la placa, procurando que el sensor de las sondas se introducen en el dH2O y almacenar durante la noche a temperatura ambiente.
Nota: El cartucho pueden dejarse sondas sumergidas hasta 72 h pero en el caso de una hidratación prolongada, las placas envuelto en película de parafina y almacenadas a 4 ° C. Si la hidratación no es posible, el cartucho de sensor debe estar hidratado durante al menos 4 h antes del ensayo. - Apague el calefactor dentro de la interfaz del respirómetro y almacenar el instrumento dentro de una incubadora de 15 ° C durante la noche a baja temperatura en el instrumento para evitar que los animales se sobrecaliente durante la serie.
Nota: El respirómetro está equipado con un elemento de calefacción pero no puede refrigerarse. Dentro de una incubadora de 15 ° C, el respirómetro tendrá una temperatura estable entre 18 y 22 ° C, que es una temperatura saludable para el mantenimiento de C. elegans .
3. droga carga y cartucho de conseguir el equilibrio
- Pipetee hacia fuera y deseche el dH2O utilizado para hidratar el sensor sondas y reemplazarlo con 200 μL de la solución calibrant (pH 7.4) en cada pocillo. Diluir la solución madre de FCCP y 100 μm FCCP dH2O y añadir 20 μl de la solución diluida a la inyección Puerto A en el cartucho de sensor. Añadir 22 μL de azida de sodio 400 mM al puerto B del cartucho del senor.
- Activar el respirómetro en la Seleccione pantalla de inicio de Inicio; aparecerá la página de plantillas. En la página de plantillas, seleccione en blanco o una plantilla previamente diseñada; aparecerá la página de grupos. En la página de los grupos, seleccionar los pozos A y H como los pozos de fondo y asignar los restantes 6 pozos en grupos apropiados de acuerdo con el plan experimental.
- Presione la flecha en la esquina inferior derecha para ir a la página del protocolo. En la página del Protocolo, garantizar que se seleccionan los botones equilibrar, basales y las inyecciones de 1 y 2 . En esta página, ajustar el número de lecturas de OCR basal, así como OCR máxima (después de la inyección 1 con FCCP) y no mitocondrial OCR (después de la inyección 2 con azida de sodio).
Nota: Cada medición está precedida de una mezcla y paso de espera y los plazos para estos parámetros se muestran en la tabla 2. - Seleccione la flecha en la esquina inferior derecha y aparecerá un indicador de carga de la placa de la cápsula de sensor. Asegúrese de que la placa de la cápsula de sensor es cargada en la orientación correcta, siguiendo las instrucciones en la pantalla de recordatorio pronto. El respirómetro equilibre ahora el cartucho.
Nota: Este equilibrado proporciona tiempo suficiente para poner los animales a ensayarse en los pocillos adecuados de la placa celular.
4. preparación de la placa de gusano y serie
- Añadir 200 μL de buffer M9 en cada uno de los 8 pocillos de la placa de la célula y en los depósitos alrededor de los pozos.
- Recoger ~ 100 gusanos de cada cepa sobre placas NGM no sembradas y dejar reposar 2-3 min mojado al final de la selección platino con buffer M9 y recoger 20 animales de edad-que sincronizados en pozos B-G, vaciar los pozos de fondo A y H.
Nota: Después de cargar cada uno bien, espere aproximadamente 2 minutos para que los animales en el fondo de los pocillos. También es recomendable ejecutar una curva número de gusano para optimizar el número de gusano por pozo para cada instrumento y el entorno de laboratorio. - Por ahora, debe calibrarse el respirómetro y haciendo clic en OK en la pantalla, la placa que contiene tampón de calibración es expulsada y puede extraerse el respirómetro, mientras que el cartucho de sensor permanece dentro del instrumento. Vuelva a colocar la placa calibrant con la placa que contiene animales. Placa de carga y cierre la puerta pulsando continuar y permitir el ensayo de funcionamiento.
5. Análisis de los datos del experimento después de
- Una vez finalizado el plazo de prueba, siga las instrucciones en la pantalla y retire la placa de la célula y el cartucho de sensor e insertar una unidad flash en el puerto USB para guardar los datos de funcionamiento en formato .war. Retire el cartucho de sensor y permite colocar hasta el fondo de los pozos de aproximadamente 2 minutos Coloque las placas de células debajo de un estéreo microscopio de disección y cuente el número de animales por el bien de los animales.
- Abra el software de análisis en el equipo y abra la ficha de normalización para normalizar OCR al número de animales. Aplicar etiquetas adecuadas para los distintos grupos en la ficha modificar y exportar el archivo como un archivo de prisma para su posterior análisis.
Nota: El promedio de las mediciones de cinco primeros, antes de la adición de FCCP es el OCR basal, mientras que la media de las cinco mediciones después de FCCP es el OCR máxima y la media de las últimas cinco mediciones (mínimo de dos mediciones debe hacerse) después de adición de azida de sodio es la velocidad de la respiración no mitocondrial. El ensayo debe repetirse tres veces para asegurar la reproducibilidad.
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Representative Results
Utilizando el protocolo aquí descrito, OCR de animales de tipo salvaje y mutante de diferentes sel-12 tres cepas fueron determinadas. SEL-12 codifica el ortólogo de C. elegans de presenilina17. Las mutaciones en humano presenilin son la aberración genética más común asociada con el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer familiar18. Nuestros estudios han demostrado niveles elevados de calcio mitocondrial en sel-12 animales mutantes en comparación con el tipo salvaje animales3. Puesto que el dysregulation de calcio puede resultar en alteración de la función mitocondrial3,19,20, OCR en animales de tipo salvaje y mutante de sel-12 fueron medidos para examinar el efecto de las mutaciones de la sel-12 sobre la función mitocondrial y la salud. Tipo salvaje animales constantemente demostraron tasas de OCR basals por debajo de 5 pmol/min/gusano, mientras que las tres cepas mutantes de sel-12 demostraron significativamente elevado OCR de ~ 7 pmol/min/gusano (figura 3 y figura 4). Con la adición de FCCP, como era de esperar, hubo un aumento en el OCR de tipo salvaje y mutantes de sel-12 (figura 3 y figura 5). Tipo salvaje los animales mostraron OCR máxima de ~ 7 pmol/min/gusano, mientras que sel-12 mutantes OCR de ~ 10 pmol/min/gusano (figura 5).
Figura 1: esquema de los principales actores involucrados en la respiración celular y el efecto de la FCCP y sodio azida. Transferencia de electrones del NADH a la compleja que resulta en la generación de un gradiente electroquímico a través de la membrana mitocondrial interna como conseguirán bombea protones a través de él, etc.. Protones que fluyen hacia la matriz mitocondrial desde el espacio del intermembrane vía complejos resultados de V en la síntesis de ATP. Además de FCCP resulta en el desacoplar de este proceso alteran el potencial de membrana mitocondrial y síntesis de ATP, mientras que el consumo de oxígeno continúa, lo que permite la medición de OCR máxima. La azida sódica (NaN3) es un inhibidor de los complejos IV y V, lo que permite la medición de la respiración no mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de pasos involucrados en la medición de OCR en C. elegans. Los cinco pasos implicados en la configuración del ensayo y ejecución (izquierda) y un tiempo para cada paso (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Perfil de la característica OCR en C. elegans respirometría. Los cinco valores iniciales muestran la respiración basal, seguida por cinco lecturas de máximo y cinco lecturas de la respiración no mitocondrial después de inyecciones de FCCP y sodio azida, respectivamente. Barras de error representan el error estándar de medición (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Respiración Basal de tipo salvaje y varios mutantes de sel-12 . Promedio de la respiración basal en 1 día edad comparable tipo salvaje y sel-12 mutantes animales adultos. Datos de ensayo de tres repeticiones. Barras de error representan SEM y *** indica p < 0.0001. valores de p fueron calculados usando una cola de dos t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Máxima respiración de tipo salvaje y varios mutantes de sel-12 . Promedio de respiración máxima en 1 día edad comparable tipo salvaje y sel-12 mutantes animales adultos después de la inyección del FCCP. Datos de ensayo de tres repeticiones. Barras de error representan SEM y *** indica p < 0.0001. valores de p fueron calculados usando una cola de dos t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| M9 buffer (1 L) | |||
| dH2O | 1.000 mL | ||
| NaCl | 5 g | ||
| KH2PO4 | 3 g | ||
| Na2HPO4 | 6 g | ||
| 1 M MgSO4 | 1 mL * añadir después de la esterilización en autoclave | ||
| Divididos en 2 frascos de: 500 mL. Autoclave en el ciclo líquido (15 min. exposición) | |||
| Solución de lejía (50 mL) | |||
| dH2O | 36 mL | ||
| Bleach | 14 mL | ||
| 10 N NaOH | 800 ΜL | ||
| Placas estándar de la Media de crecimiento de nematodos (NGM) | |||
| 1 L | 0,5 L | 0.25 L | |
| NaCl | 3 g | 1.5 g | 0.75 g |
| Bacto-agar | 17 g | 8,5 g | 4,25 g |
| Bacto-peptona | 2,5 g | 1.25 g | 0,625 g |
| a. autoclave ciclo líquido (exposición de 45 min), permiten enfriar ~ 60 ° c utilizar técnica estéril y agregar lo siguiente: | |||
| 1 L | 0,5 L | 0.25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 mL | 0, 5 mL | 0.25 mL |
| 1 M MgSO4 | 1 mL | 0, 5 mL | 0.25 mL |
| KPO de 1 M4 | 25 mL | 12,5 mL | 6,25 mL |
| colesterol 5 mg/mL | 1 mL | 0, 5 mL | 0.25 mL |
| b. Agite para mezclar bien después de cada adición. Después de todas las adiciones, vierta las placas | |||
Tabla 1: Recetas para platos NGM, buffer M9 y solución de lejía.
| Calibración | Basal | FCCP | Azida de sodio |
| Puertos: A | Puertos: B | ||
| Equilibrado: sí | Mezcla: 00:02:00 | Mezcla: 00:02:00 | Mezcla: 00:02:00 |
| Espera: 00:00:30 | Espera: 00:00:30 | Espera: 00:00:30 | |
| Medida: 00:02:00 | Medida: 00:02:00 | Medida: 00:02:00 | |
| Ciclos: 5 | Ciclos: al menos 5 | Ciclos: 2−5 | |
| Duración: 00:22:30 | Duración: 00:22:30 | Duración: 00:09:00 |
Tabla 2: parámetros característicos del ensayo en C. elegans respirometría.
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Discussion
La respiración mitocondrial es un perspicaz indicador de la función mitocondrial; por lo tanto, ser capaz de medir las tasas de consumo de oxígeno en un sistema biológico, ya sea in vitro o en vivo es muy valiosa. Respirometers detectar niveles de oxígeno usando fósforos de porfirina que haz apagados por oxígeno o por medio de sensores de oxígeno amperométrico que dependen de la generación de una eléctrica actual proporcional a la presión de oxígeno. Electrodo de Clark cae en esta última categoría y se ha utilizado ampliamente en la literatura, especialmente al analizar la respiración en C. elegans. Sin embargo, la necesidad de un tamaño de muestra grande y la imposibilidad de evaluar más de una muestra a la vez hace amperométrico Sensores de oxígeno ineficiente.
Este protocolo proporciona a una guía simple para la medida de OCR en vivo, intacto C. elegans sin aislar mitocondrias, un proceso que potencialmente podría afectar el potencial de membrana mitocondrial y, por tanto, el OCR. Dado que los animales exhiben diferentes OCR a través de varias etapas de la vida, los animales utilizados en el presente Protocolo deben ser edad sincronizado. Animales más jóvenes tienen menor OCR en comparación con animales adultos y los niveles de OCR pueden caer otra vez como animales edad mayor3. C. elegans también son esterilizados por el uso de FUdR para asegurar que el OCR no se confunden por la presencia de la progenie. Sin embargo, si los animales de diferentes tamaños deben ser examinados, estrategias para la normalización deben abordarse.
Este protocolo utiliza una selección platino para transferir animales a la placa de ensayo. A diferencia de la transferencia de líquidos de los animales, esta manipulación permite al investigador examinar cuidadosamente y determinar la salud de los animales antes y durante la transferencia. Además, permite mejor control del número de gusanos y previene la introducción de huevos y caparazones. Puesto que los animales están vivos y activos durante la ejecución del ensayo, variabilidad es que puedan derivarse de la colocación de la sonda. Ensayos, por tanto, debe hacerse por triplicado y se debe repetir un mínimo de tres veces. También, doble comprobación cuenta animal post análisis es importante para normalizar al número de animales. Un inconveniente importante de este protocolo es la incapacidad para comparar más de dos muestras a la vez, sin comprometer el número de repeticiones dentro de una misma serie. A pesar de esta limitación, este protocolo puede ser una herramienta muy potente en el análisis de OCR al comparar dos genotipos o condiciones. Por otra parte, este protocolo podría ser fácilmente adaptado a examinar el OCR de animales en fuentes de diferentes alimentos, suplementos o tratamientos farmacológicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer el Dr. Kevin Bittman para su orientación en el establecimiento de la XFp de Caballito de mar en el laboratorio. Institutos nacionales de salud otorgar que gm088213 apoya esta labor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
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