Mesure des taux de consommation d’oxygène intactes de Caenorhabditis elegans
Summary
La respiration mitochondriale est critique pour la survie de l’organisme ; par conséquent, le taux de consommation d’oxygène est un excellent indicateur de la santé mitochondriale. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’un respiromètre commercialement disponible pour mesurer basale et taux de consommation maximale d’oxygène en vivent, intact et librement mobiles Caenorhabditis elegans.
Abstract
La fonction mitochondriale optimale est critique pour l’activité cellulaire en bonne santé, en particulier dans les cellules qui ont des exigences de haute énergie comme ceux du système nerveux et musculaire. Compatible avec cela, dysfonctionnement mitochondrial a été associé à une multitude de maladies neurodégénératives et vieillissement en général. Caenorhabditis elegans ont été un système puissant modèle pour élucider les nombreuses subtilités de la fonction mitochondriale. La respiration mitochondriale est un bon indicateur de la fonction mitochondriale et respiromètres récemment développés offrent une plate-forme d’état-of-the-art pour mesurer la respiration dans les cellules. Dans ce protocole, nous fournissons une technique pour analyser live, intact c. elegans. Ce protocole s’étend sur une période d’environ 7 jours et inclut des étapes de croissance (1) et la synchronisation c. elegans, (2) préparation de composés à doser et l’hydratation des sondes, chargement et cartouche l’équilibration du médicament (3), (4) préparation du test de ver plaque et épreuve et analyse des données de test post (5).
Introduction
L’adénosine triphosphate (ATP), la principale source d’énergie cellulaire, est produit dans les mitochondries par les enzymes de la chaîne de transport d’électrons (etc.) situés dans la membrane mitochondriale interne. Un métabolite clé utilisé pour la production d’ATP mitochondriale, le pyruvate est importé dans la matrice mitochondriale où elle est décarboxylée pour produire du coenzyme A (CoA). Par la suite, acétyl-CoA pénètre dans le cycle de Krebs ayant pour résultat la génération de nicotinamide adénine dinucléotide (NADH), une molécule porteuse de clé électronique. Comme les électrons de NADH sont passés à l’oxygène par le CTE, protons s’accumuler dans l’espace intermembranaire mitochondrial, qui se traduit par la génération d’un gradient électrochimique à travers la membrane. Ces protons ensuite découleront de l’espace intermembranaire à travers ce gradient électrochimique dans la matrice mitochondriale par le pore de proton de l’ATP synthase, conduire sa rotation et la synthèse de l’ATP1 (Figure 1).
La fonction mitochondriale n’est pas limitée à la production d’énergie, mais est également cruciale pour l’homéostasie du calcium, espèces réactives de l’oxygène (ROS) nettoyage et apoptose, positionnement critique leur fonction organismique santé2. La fonction mitochondriale peut être évaluée en utilisant une variété de tests, y compris mais sans s’y limiter à des analyses qui mesurent le potentiel de membrane mitochondrial, les niveaux d’ATP et ROS et concentrations de calcium mitochondrique. Toutefois, ces analyses donnent un aperçu unique de la fonction mitochondriale et donc ne pourraient pas fournir une vision globale de la santé mitochondriale. Étant donné que la consommation d’oxygène pendant la génération d’ATP est tributaire d’une myriade de réactions séquentielles, il sert un indicateur supérieur de la fonction mitochondriale. Fait intéressant, les variations dans les taux de consommation d’oxygène ont été observées à la suite de dysfonctionnement mitochondrial3,4,5.
Taux de consommation d’oxygène (OCR) des échantillons vivants peuvent être mesurées à l’aide de techniques qui peuvent être largement divisés en deux groupes : ampérométrique sondes d’oxygène et phosphores axée sur la porphyrine qui peuvent être éteint par l’oxygène6. Sondes d’oxygène ampérométrique ont été largement utilisés à mesure OCR en cellules, tissus et dans les systèmes de modèle, comme c. elegans. Cependant, les phosphores axée sur les porphyrines contenant respiromètres possèdent les avantages suivants : (1) elles permettent une comparaison côte à côte de deux échantillons en trois exemplaires, (2) ils ont besoin de plus petite taille de l’échantillon (par exemple, 20 vers / puits contre ~ 2, 000−5, 000 vers chez le 7de la chambre) et (3) le respiromètre peut être programmé pour faire quatre injections de composés différentes à désiré fois tout au long de la course expérimentale, éliminant le besoin d’application manuelle.
Dans ce protocole, les étapes à suivre pour utiliser un respiromètre de détection oxygène porphyrine-basé à mesure OCR en live, intact c. elegans sont décrit. Bien qu’il y a un protocole écrit pour l’utilisation du format grand, haut débit respiromètre8, ce protocole a été adapté pour une utilisation avec un instrument plus d’échelle sympathique, accessible et plus petit budget. Ce protocole est particulièrement utile pour évaluer la différence de l’OCR entre deux souches, où criblage à haut débit n’est pas nécessaire et son utilisation serait excessive.
Protocol
Representative Results
Discussion
La respiration mitochondriale est un indicateur perspicace de la fonction mitochondriale ; par conséquent, être capable de mesurer les taux de consommation d’oxygène dans un système biologique, si in vitro ou in vivo est extrêmement précieux. Respiromètres détecte les niveaux d’oxygène à l’aide de phosphores axée sur la porphyrine qui s’éteint par l’oxygène ou par l’intermédiaire de capteurs d’oxygène ampérométrique qui reposent sur la génération d’une proportionnelle de courant élect…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tenons à remercier le Dr Kevin Bittman pour ses conseils dans l’établissement de l’hippocampe XFp dans le laboratoire. National Institutes of Health accorder que gm088213 prise en charge de ce travail.
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
- Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
- Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
- Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
- Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents–carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer’s disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).
