Summary
Mitokondriell respiration är kritisk för organismers överlevnad; syre materialåtgången är därför en bra indikator på mitokondriell hälsa. I detta protokoll, beskriver vi användning av en kommersiellt tillgängliga respirometer att mäta basal och maximal syre förbrukning i live, intakt, och fritt rörliga Caenorhabditis elegans.
Abstract
Optimal mitokondriefunktion är avgörande för friska cellulär aktivitet, särskilt i celler som har hög energi krav liknande dem i nervsystem och muskler. Konsekvent med detta, mitokondriell dysfunktion har associerats med en myriad av neurodegenerativa sjukdomar och åldrande i allmänhet. Caenorhabditis elegans har varit en kraftfull modellsystem för att belysa många krångligheter av mitokondriell funktion. Mitokondriell andning är en stark indikator på mitokondriefunktion och nyligen utvecklade respirometers erbjuda en state-of-the-art plattform för att mäta andning i celler. I detta protokoll ger vi en teknik för att analysera live, intakt C. elegans. Detta protokoll spänner över en period av ~ 7 dagar och omfattar steg för (1) växer och synkronisering för C. elegans, (2) beredning av föreningar som injiceras och hydrering av sonder, (3) drog lastning och patron Jämviktstiden, (4) förberedelse av masken assay plattan och assay kör, och (5) efter experimentet dataanalys.
Introduction
Omvandlingen av adenosintrifosfat (ATP), den viktigaste källan till cellulär energi, produceras i mitokondrierna av enzymer i elektron transportkedjan (ETC) ligger i det inre mitokondriella membranet. Pyruvat, en viktig metabolit utnyttjas för mitokondriell ATP-produktion, importeras till mitokondriell matrisen där det är dekarboxylering att producera acetyl-coenzym A (CoA). Därefter träder acetyl CoA Citronsyracykeln som resulterar i framtagningen av nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH), en nyckel elektron bärarmolekyl. Eftersom elektroner från NADH skickas till syre via ETC, bygga protoner upp i mitokondriell intermembrane utrymmet, som resulterar i framtagningen av en elektrokemisk gradient över membranet. Dessa protoner kommer sedan flöda från det intermembrane utrymmet över denna elektrokemiska gradient tillbaka in i mitokondriell matrisen genom proton pore av ATP synthase, kör dess rotation och syntesen av ATP1 (figur 1).
Mitokondriefunktion är inte begränsat till energiproduktionen men är också avgörande för kalciumhomeostas, reaktiva syreradikaler (ROS) rensning och apoptos, kritiskt positionering deras funktion i organismers hälsa2. Mitokondriell funktion kan bedömas med hjälp av olika analyser, inklusive men inte begränsat till analyser som mäter mitokondriella membranpotential, ATP och ROS nivåer och mitokondrie kalcium koncentrationer. Men dessa analyser ger en enda ögonblicksbild av mitokondriell funktion och därför kanske inte ger en heltäckande bild av mitokondriell hälsa. Eftersom syreförbrukning vid ATP generation är beroende av en myriad av sekventiell reaktioner, fungerar den som en överlägsen indikator på mitokondriell funktion. Intressant, har variationer i syre förbrukning observerats som en följd av mitokondriell dysfunktion3,4,5.
Syre förbrukning (OCR) av levande prover kan mätas med hjälp av tekniker som kan delas in i två grupper: amperometrisk syresensorer och Porfyrin-baserade fosfor som kan kvävas av syre6. Amperometrisk syresensorer har använts i stor utsträckning att mäta OCR i odlade celler, vävnader, och i modellsystem, såsom C. elegans. Dock porphyrin-baserade fosfor innehållande respirometers ha följande fördelar: (1) de möjliggör en sida vid sida jämförelse av två prover i tre exemplar, (2) de kräver mindre urvalsstorlek (t.ex. 20 maskar per brunn kontra ~ 2, 000−5, 000 maskar i de avdelningen)7och (3) respirometer kan programmeras att göra fyra olika sammansatta injektioner vid önskade tidpunkter under experimentella flykt, vilket eliminerar behovet av manuell applicering.
I detta protokoll är stegen i använda en porphyrin-baserade syre-sensing respirometer åtgärd OCR i live, intakt C. elegans beskrivs. Medan det finns ett skriftligt protokoll för användning av stora format, hög genomströmning respirometer8, har detta protokoll anpassats för användning med ett mer budget vänlig, lättillgänglig och mindre skala instrument. Protokollet är särskilt användbart för att bedöma skillnaden i OCR mellan två stammar, där high-throughput screening krävs inte och dess användning skulle bli orimlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Figur 2 ger en schematisk överblick över hela protokollet.
1. tillväxt och synkronisering av nematoder befolkningen9,10
- Överföra L4 larver av önskad genetiska bakgrunder (t.ex. N2 [wild type] och sel-12 djur) på nematoder media (NGM) tillväxtplattor (se tabell 1 för recept) nyligen seedade med en gräsmatta av Escherichia coli (OP50)11. Använd minst två 100 mm eller tre 60 mm plattor för varje stam. Inkubera maskar på lämpliga tillväxt temperatur (mellan 15 – 25 ° C) i 3 – 4 dagar eller tills plattorna är koncentrerad med stort antal ägg och dräktig maskar.
- Tvätta ägg och maskar av plattorna med ca 6 mL M9 buffert (se tabell 1 för recept) per 100 mm platta av nematoder och överföra dem med glas Pasteur-pipetter till enskilda 15 mL centrifugrör för varje stam. Snurra dessa rör ner för 3 min på 6 180 x g och aspirera ut M9 bufferten, behålla bara djur och ägg pelleten.
- Tillsätt 3-4 mL blekmedel lösning (se tabell 1 för recept) i varje rör och periodvis virvel för 6 min. Lägg M9 buffert att fylla varje rör och snurra på 6.180 x g för 1 min och sug ut supernatant. Upprepa denna tvätt med M9 tre gånger och flytta ägg pelleten till en färsk 15 mL tub innehållande cirka 9 mL M9 buffert.
- Synkronisera nyligen kläckta maskar av nutating vid 20 ° C för 16 – 48 h. Spin dessa rör ner vid 6.180 x g för 1,5 min och sätta de synkronisera L1 djur på enskilda NGM plattor nymalen seedade med en gräsmatta av OP50 (cirka 6 000 – 10 000 djur per 100 mm platta) och hålla vid 20 ° C.
- Dessa djur kommer att nå den L4 larvstadium efter ~ 42 h. Vid denna tid, flytta L4 larver med ett platina plocka till OP50 seedade NGM plattor som innehåller 0,5 mg / mL 5-fluoro-2'-deoxiuridin (FUdR) för att hindra dem från att producera avkomma.
Obs: Kontrollera att alla stammar inom ett experiment synkroniseras för en liknande tid. FUdR behandling steriliserar djur och förhindrar äggproduktion om fastställande och avkomma, vilket skulle kunna påverka OCR. Dessa steriliserad djur kommer att analyseras nästa dag (dag 1 vuxna djur på ~ 66 h) för analysen. FUdR har rapporterats att påverka fysiologi och livslängd av vissa muterade maskar. Därför bör detta tas i beaktande när läkemedlet används för sterilisering12,13,14. Maskar kan också steriliseras vid hjälpmedlet av feminina mutationer som fem-1(hc17) eller fem-3(e2006). Dessa mutationer kan dock påverka mitokondriell funktion.
2. beredning av föreningar som injiceras och återfuktning av sonder
Obs: Under analysen kör, mäts både basal och maximal respiration klassar av nematoder. Maximal andning utlöses i djuren vid tillägg av karbonyl cyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), en uncoupling jonofor som stör den mitokondriella membranpotentialen och således ATP-syntes genom att transportera protoner genom mitokondriella membranet, medan proton pumpning, elektrontransport och syreförbrukning fortsätta4,15 bortkopplat ATP-syntes (figur 1). Det sista steget i analysen innebär tillägg av natriumazid (NaN3), ett läkemedel som hämmar komplex IV och V i ETC, att tillåta att fastställa icke-mitokondriell respiration16 (figur 1). Följande steg kan göras dagen före den faktiska assay kör.
- Förbereda 1 mL stamlösningar av FCCP (10 mM i dimetyl sulfoxid [DMSO]: 1000 x den slutliga analys koncentrationen) NaN3 (400 mM i dH2O: 10 x slutlig haltbestämning koncentration) och förvaras vid-20 ° C.
Obs: Köra en koncentration kurva för att optimera koncentrationen av FCCP krävs för att framkalla maximal OCR reaktion för varje instrument och laboratoriemiljö. - Hydrate sensor patronen genom att lägga 200 µL av dH2O till varje brunn (och omgivande reservoaren) i plattan, att se till att sensorn sonder är nersänkta i dH2O och förvara över natten i rumstemperatur.
Obs: Patronen sonder kan lämnas under vatten i upp till 72 h men när det gäller en långvarig återfuktning, plattorna bör vara insvept i paraffin filma och lagras vid 4 ° C. Om övernattning återfuktning inte är möjligt, ska sensor patronen vara hydrerade för minst 4 tim före analys. - Stäng av värme-element i gränssnittet respirometer och lagra instrumentet inuti en 15 ° C inkubator natten till lägre kärntemperatur inom instrumentet för att hindra djuren från överhettning under analysen kör.
Obs: Respirometer är utrustad med ett värmeelement men kylas inte. Inom en 15 ° C inkubator ha respirometer en stabil temperatur mellan 18 – 22 ° C, som är en hälsosam temperatur för C. elegans underhåll.
3. läkemedel lastning och patron Jämviktstiden
- Pipettera ut och kassera dH2O används för att återfukta sensorn sonder och ersätta det med 200 µL av standard lösning (pH 7,4) i varje brunn. Späd FCCP stamlösning till 100 µM FCCP i dH2O och tillsätt 20 µL av utspädd lösning till injektion port A i sensorn patronen. Tillsätt 22 µL 400 mM natriumazid i port B av senor patronen.
- Aktivera respirometer och på startskärmen Välj starta; sidan mallar visas. På sidan mallar Välj Tom eller en tidigare designat mall; Grupper sidan visas. På sidan grupper, Välj brunnarna A och H som bakgrund brunnarna och tilldela de återstående 6 brunnarna i lämpliga grupper den experimentella planenligt.
- Tryck på pilen i det nedersta högra hörnet att gå till sidan protokoll. Kontrollera att knapparna jämvikt, Basal och injektioner 1 och 2 är markerat på sidan protokoll. På den här sidan justera antal läsningar av basala OCR, samt maximal OCR (efter injektion 1 med FCCP) och icke-mitokondriell OCR (efter injektion 2 med natriumazid).
Obs: Varje mätning föregås av en blandning och vänta steg och tidsramarna för dessa parametrar visas i tabell 2. - Välj på pilen i det nedre högra hörnet och en uppmaning att läsa in sensorn patron plattan visas. Se till att sensorn patron plattan fyllts i rätt riktning, följa instruktionerna på skärmen för snabb påminnelse. Respirometer kommer nu att temperera patronen.
Obs: Denna Jämviktstiden ger gott om tid att placera djuren att analyseras i lämpliga brunnar i cell plattan.
4. beredning av masken plattan och haltbestämning kör
- Tillsätt 200 µL av M9 buffert i vart och ett av de 8 brunnarna i cell plattan och i reservoarerna kring brunnarna.
- Plocka ~ 100 maskar från varje stam på unseeded NGM plåtar och låt vila i 2-3 min. våt slutet av platina plocka med M9 buffert och plocka 20 ålder-synkroniserad djur i brunnar B-G, lämnar bakgrunden brunnarna A och H Tom.
Obs: Efter lastning varje Tja, vänta ca 2 min så att djuren att bosätta sig i botten av brunnarna. Det är också lämpligt att en mask nummer kurva köras för att optimera antalet mask per brunn för varje instrument och laboratoriemiljö. - Nu, respirometer bör kalibreras och genom att klicka på OK på skärmen, plattan som innehåller kalibrering buffert matas och kan tas bort från respirometer, medan sensorn patronen stannar inuti instrumentet. Ersätta standard plattan med plattan som innehåller djur. Ladda plattan och Stäng luckan genom att trycka Fortsätt och gör analysen att köra.
5. efter experimentet dataanalys
- När assay körningen är klar, Följ anvisningarna på skärmen och ta bort cell plattan och sensorn patron och infoga ett flashminne i USB-porten att spara kör data i formatet .war. Ta bort sensorn patronen och låta djuren att bosätta sig botten av brunnarna för cirka 2 min. Placera cell plattorna under en stereo dissekera mikroskopet och räkna antalet djur per brunn.
- Öppna programvaran analys på datorn och öppna fliken normalisering för att normalisera OCR till djurens nummer. Tillämpa lämpliga etiketter för de olika grupperna under fliken ändra och exporterar du filen som en Prism fil för vidare analys.
Obs: Medelvärdet av de fem första mätningarna innan tillägg av FCCP är de basala OCR, medan genomsnittet för de fem mätningarna efter FCCP tillägg är maximal OCR och medelvärdet av de fem senaste mätningar (minst två mätningar bör göras) efter natrium natriumazid tillägg är den icke-mitokondriell respirationshastighet. Analysen bör upprepas tre gånger för att säkerställa reproducerbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskrivs häri, OCR av vildtyp djur och tre olika sel-12 mutant stammar bestämdes. sel-12 kodar den C. elegans ortholog presenilin17. Mutationer i mänskliga presenilin är den vanligaste genetiska avvikelse är associerad med utveckling av familjär Alzheimers sjukdom18. Våra studier har visat förhöjda mitokondriell kalciumnivåer i sel-12 muterade djur jämfört med vildtyp djur3. Eftersom kalcium Dysreglering kan resultera i förändrad mitokondriefunktion3,19,20, OCR i sel-12 mutant och vildtyp djur mättes för att undersöka effekten av sel-12 mutationer på mitokondriell funktion och hälsa. Vildtyp djur visade konsekvent basala OCR priser nedan 5 pmol/min/worm, medan alla tre stammar av sel-12 mutanter visade förhöjt OCR av ~ 7 pmol/min/mask (figur 3 och figur 4). Vid tillägg av FCCP, som väntat, var ökningen i OCR av vildtyp samt sel-12 mutanter (figur 3 och figur 5). Vildtyp djur visade maximal OCR av ~ 7 pmol/min/worm, medan sel-12 mutanter hade OCR av ~ 10 pmol/min/mask (figur 5).
Figur 1: Schematisk av de viktigaste aktörerna i cellandningen och effekten av FCCP och natrium natriumazid. Överföring av elektroner från NADH till komplexa jag resulterar i framtagningen av en elektrokemisk gradient över det inre mitokondriella membranet som protoner få pumpas över det ETC. Protoner flöda tillbaka in i mitokondriell matrisen från intermembrane rymden via komplexa V resultat i ATP-syntes. Tillägg av FCCP resulterar i losskopplingen av denna process genom att störa mitokondriella membranet potential och därmed ATP-syntes, medan syreförbrukning fortsätter, vilket möjliggör mätning av maximal OCR. Natriumazid (NaN3) är en hämmare av komplex IV och V, vilket gör det möjligt för mätning av icke-mitokondriell respiration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk bild av stegen för mätning av OCR i C. elegans. De fem stegen i analysen installationen och kör (vänster) och en tidsram för varje steg (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: karakteristiska OCR profil i C. elegans respiration. Fem utgångsvärdena Visa basala respirationen, följt av fem avläsningar av maximal och fem avläsningar av icke-mitokondriell respiration efter FCCP och natrium natriumazid injektioner, respektive. Felstaplar representera standardfel för mätning (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Basal andning i vildtyp och olika sel-12 mutanter. Genomsnittliga basala andning i dag 1 vuxen åldersmatchade vildtyp och sel-12 muterade djur. Data som sammanställts från tre analysen upprepas. Felstaplar representera SEM och *** indikerar p < 0,0001. p -värdena beräknades med hjälp av en tvåsidiga t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Maximal andning i vildtyp och olika sel-12 mutanter. Genomsnittlig maximal andning i dag 1 vuxen åldersmatchade vildtyp och sel-12 muterade djur efter FCCP injektion. Data som sammanställts från tre analysen upprepas. Felstaplar representera SEM och *** indikerar p < 0,0001. p -värdena beräknades med hjälp av en tvåsidiga t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| M9 buffert (1 L) | |||
| dH2O | 1000 mL | ||
| NaCl | 5 g | ||
| KH2PO4 | 3 g | ||
| Na2HPO4 | 6 g | ||
| 1 M MgSO4 | 1 mL * Lägg till efter autoklavering | ||
| Delas mellan 2 flaskor: 500 mL vardera. Autoklav på flytande cykel (15 min exponering) | |||
| Blekmedel lösning (50 mL) | |||
| dH2O | 36 mL | ||
| Blekmedel | 14 mL | ||
| 10 N NaOH | 800 ΜL | ||
| Standard Nematoden Growth Media (NGM) plattor | |||
| 1 L | 0,5 L | 0,25 L | |
| NaCl | 3 g | 1,5 g | 0,75 g |
| Bacto-agar | 17 g | 8.5 g | 4.25 g |
| Bacto-pepton | 2,5 g | 1,25 g | 0,625 g |
| a. autoklav på flytande cykel (45 min exponering), låt svalna till ~ 60 ° C och sedan använda sterilteknik och Lägg till följande: | |||
| 1 L | 0,5 L | 0,25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M MgSO4 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M KPO4 | 25 mL | 12,5 mL | 6,25 mL |
| 5 mg/mL kolesterol | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| b. virvel att blanda noggrant efter varje tillsats. Efter alla tillägg görs, häll plattor | |||
Tabell 1: Recept för NGM tallrikar, M9 buffert och blekmedel lösning.
| Kalibrering | Basala | FCCP | Natriumazid |
| Port(ar): A | Port(ar): B | ||
| Jämviktstiden: Ja | Mix: 00:02:00 | Mix: 00:02:00 | Mix: 00:02:00 |
| Vänta: 00:00:30 | Vänta: 00:00:30 | Vänta: 00:00:30 | |
| Åtgärd: 00:02:00 | Åtgärd: 00:02:00 | Åtgärd: 00:02:00 | |
| Cykler: 5 | Cykler: minst 5 | Cykler: 2−5 | |
| Varaktighet: 00:22:30 | Varaktighet: 00:22:30 | Varaktighet: 00:09:00 |
Tabell 2: karakteristiska assay parametrar i C. elegans respiration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondriell andning är en insiktsfull indikator på mitokondriell funktion; Därför är att kunna mäta de syre förbrukning i ett biologiskt system, om in vitro- eller in vivo mycket värdefulla. Respirometers känner av syrehalten använder porphyrin-baserade fosfor som får härdas av syre eller via amperometrisk syresensorer som förlitar sig på generationen av en elektrisk nuvarande proportionella till syre pressar. Clark elektrod faller i den senare kategorin och har använts flitigt i litteratur, särskilt samtidigt analysera andning i C. elegans. Behovet av en stor urvalsstorlek och oförmåga att bedöma mer än ett prov i taget gör dock amperometrisk syresensorer ineffektiva.
Detta protokoll ger en enkel guide till åtgärd OCR i live, intakt C. elegans utan att isolera mitokondrierna, en process som kan komma att påverka den mitokondriella membranpotentialen och, därför, OCR. Med tanke på att djur uppvisar olika OCR genom olika stadier, bör djur som används i detta protokoll ålder synkroniseras. Yngre djur har lägre OCR jämfört med vuxna djur och OCR nivåerna kan sjunka igen som djur ålder ytterligare3. C. elegans är också steriliserade genom användning av FUdR att säkerställa att OCR inte är tvetydiga på grund av närvaron av avkomman. Dock om djur i olika storlekar för att undersökas, behöver strategier för normalisering åtgärdas.
Detta protokoll använder tredjeparts en platina plocka överföra djur till assay plattan. I motsats till flytande överföring av djur kan denna manipulation forskaren att noggrant undersöka och fastställa hälsan hos djuren före och under överföringen. Också, den möjliggör bättre kontroll av mask och förhindrar införandet av ägg och kadaver. Eftersom djuren är levande och verksamt under test körning, är variabilitet kan uppstå vid sondens positionering. Analyser bör därför göras i tre exemplar och bör upprepas minst tre gånger. Dubbel kontroll djur räknas post analys är också viktigt för att normalisera till djurens nummer. En stor nackdel med detta protokoll är oförmågan att jämföra fler än två prover på en gång, utan att kompromissa med antalet replikat inom en enda analys. Trots denna begränsning, kan detta protokoll vara ett mycket kraftfullt forskningsredskap analysera OCR när man jämför två genotyper eller villkor. Dessutom kan detta protokoll lätt anpassas till undersöka OCR av djur som odlas på olika matkällor, kosttillskott eller läkemedelsbehandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Dr Kevin Bittman för hans vägledning i upprättandet av den Seahorse XFp i labbet. National Institutes of Health bevilja GM088213 stött detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
- Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
- Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
- Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
- Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).
