Mätning av syre förbrukning i intakt Caenorhabditis elegans
Summary
Mitokondriell respiration är kritisk för organismers överlevnad; syre materialåtgången är därför en bra indikator på mitokondriell hälsa. I detta protokoll, beskriver vi användning av en kommersiellt tillgängliga respirometer att mäta basal och maximal syre förbrukning i live, intakt, och fritt rörliga Caenorhabditis elegans.
Abstract
Optimal mitokondriefunktion är avgörande för friska cellulär aktivitet, särskilt i celler som har hög energi krav liknande dem i nervsystem och muskler. Konsekvent med detta, mitokondriell dysfunktion har associerats med en myriad av neurodegenerativa sjukdomar och åldrande i allmänhet. Caenorhabditis elegans har varit en kraftfull modellsystem för att belysa många krångligheter av mitokondriell funktion. Mitokondriell andning är en stark indikator på mitokondriefunktion och nyligen utvecklade respirometers erbjuda en state-of-the-art plattform för att mäta andning i celler. I detta protokoll ger vi en teknik för att analysera live, intakt C. elegans. Detta protokoll spänner över en period av ~ 7 dagar och omfattar steg för (1) växer och synkronisering för C. elegans, (2) beredning av föreningar som injiceras och hydrering av sonder, (3) drog lastning och patron Jämviktstiden, (4) förberedelse av masken assay plattan och assay kör, och (5) efter experimentet dataanalys.
Introduction
Omvandlingen av adenosintrifosfat (ATP), den viktigaste källan till cellulär energi, produceras i mitokondrierna av enzymer i elektron transportkedjan (ETC) ligger i det inre mitokondriella membranet. Pyruvat, en viktig metabolit utnyttjas för mitokondriell ATP-produktion, importeras till mitokondriell matrisen där det är dekarboxylering att producera acetyl-coenzym A (CoA). Därefter träder acetyl CoA Citronsyracykeln som resulterar i framtagningen av nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH), en nyckel elektron bärarmolekyl. Eftersom elektroner från NADH skickas till syre via ETC, bygga protoner upp i mitokondriell intermembrane utrymmet, som resulterar i framtagningen av en elektrokemisk gradient över membranet. Dessa protoner kommer sedan flöda från det intermembrane utrymmet över denna elektrokemiska gradient tillbaka in i mitokondriell matrisen genom proton pore av ATP synthase, kör dess rotation och syntesen av ATP1 (figur 1).
Mitokondriefunktion är inte begränsat till energiproduktionen men är också avgörande för kalciumhomeostas, reaktiva syreradikaler (ROS) rensning och apoptos, kritiskt positionering deras funktion i organismers hälsa2. Mitokondriell funktion kan bedömas med hjälp av olika analyser, inklusive men inte begränsat till analyser som mäter mitokondriella membranpotential, ATP och ROS nivåer och mitokondrie kalcium koncentrationer. Men dessa analyser ger en enda ögonblicksbild av mitokondriell funktion och därför kanske inte ger en heltäckande bild av mitokondriell hälsa. Eftersom syreförbrukning vid ATP generation är beroende av en myriad av sekventiell reaktioner, fungerar den som en överlägsen indikator på mitokondriell funktion. Intressant, har variationer i syre förbrukning observerats som en följd av mitokondriell dysfunktion3,4,5.
Syre förbrukning (OCR) av levande prover kan mätas med hjälp av tekniker som kan delas in i två grupper: amperometrisk syresensorer och Porfyrin-baserade fosfor som kan kvävas av syre6. Amperometrisk syresensorer har använts i stor utsträckning att mäta OCR i odlade celler, vävnader, och i modellsystem, såsom C. elegans. Dock porphyrin-baserade fosfor innehållande respirometers ha följande fördelar: (1) de möjliggör en sida vid sida jämförelse av två prover i tre exemplar, (2) de kräver mindre urvalsstorlek (t.ex. 20 maskar per brunn kontra ~ 2, 000−5, 000 maskar i de avdelningen)7och (3) respirometer kan programmeras att göra fyra olika sammansatta injektioner vid önskade tidpunkter under experimentella flykt, vilket eliminerar behovet av manuell applicering.
I detta protokoll är stegen i använda en porphyrin-baserade syre-sensing respirometer åtgärd OCR i live, intakt C. elegans beskrivs. Medan det finns ett skriftligt protokoll för användning av stora format, hög genomströmning respirometer8, har detta protokoll anpassats för användning med ett mer budget vänlig, lättillgänglig och mindre skala instrument. Protokollet är särskilt användbart för att bedöma skillnaden i OCR mellan två stammar, där high-throughput screening krävs inte och dess användning skulle bli orimlig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondriell andning är en insiktsfull indikator på mitokondriell funktion; Därför är att kunna mäta de syre förbrukning i ett biologiskt system, om in vitro- eller in vivo mycket värdefulla. Respirometers känner av syrehalten använder porphyrin-baserade fosfor som får härdas av syre eller via amperometrisk syresensorer som förlitar sig på generationen av en elektrisk nuvarande proportionella till syre pressar. Clark elektrod faller i den senare kategorin och har använts flitigt i litteratur, särskilt sa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna Dr Kevin Bittman för hans vägledning i upprättandet av den Seahorse XFp i labbet. National Institutes of Health bevilja GM088213 stött detta arbete.
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
- Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
- Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
- Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
- Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents–carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer’s disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).
