Summary
Respiração mitocondrial é fundamental para a sobrevivência; Portanto, a taxa de consumo de oxigênio é um excelente indicador de saúde mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um respirometer comercialmente disponível para medir basal e taxas de consumo máximo de oxigênio em viver, intacto e livremente motile Caenorhabditis elegans.
Abstract
Função mitocondrial ideal é fundamental para a atividade celular saudável, particularmente nas células que têm demandas de alta energia como os do sistema nervoso e muscular. Consistente com isso, a disfunção mitocondrial tem sido associada com uma miríade de doenças neurodegenerativas e envelhecimento em geral. Caenorhabditis elegans tem sido um modelo poderoso sistema para elucidar os muitos meandros da função mitocondrial. Respiração mitocondrial é um forte indicador de função mitocondrial e respirometers recentemente desenvolvidos para oferecer uma plataforma de estado-da-arte para medir a respiração nas células. Neste protocolo, nós fornecemos uma técnica para analisar ao vivo, intacto c. elegans. Este protocolo abrange um período de ~ 7 dias e inclui etapas para o cultivo e a sincronização de c. elegans, (2) preparação de compostos para ser injetado e hidratação das sondas, carregamento e cartucho equilíbrio de drogas (3), (4) preparação do ensaio de minhoca (1) placa e ensaio executado e análise de dados de pós-experiência (5).
Introduction
Trifosfato de adenosina (ATP), a principal fonte de energia celular, é produzido na mitocôndria por enzimas da cadeia de transporte de elétrons (ETC), localizadas na membrana mitocondrial interna. Piruvato, um metabólito chave utilizado para a produção de ATP mitocondrial, é importado para a matriz mitocondrial, onde é sintetizado para produzir Acetil Coenzima A (CoA). Posteriormente, o acetil-CoA entra no ciclo do ácido cítrico, resultando na geração de dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH), uma molécula transportadora de elétrons chave. Como os elétrons do NADH são passados ao oxigênio via o ETC, prótons se acumular no espaço intermembranar mitocondrial, que resulta na geração de um gradiente electroquímico através da membrana. Estes prótons então fluirá do espaço intermembranar este gradiente electroquímico volta para a matriz mitocondrial através do poro de prótons da ATP sintase, dirigindo a sua rotação e a síntese de ATP1 (Figura 1).
Função mitocondrial não está limitada a produção de energia, mas também é crucial para a homeostase do cálcio, espécies reativas de oxigênio (ROS) eliminação e apoptose, criticamente, posicionando sua função na saúde dos2. Função mitocondrial pode ser avaliada usando uma variedade de ensaios, incluindo mas não se limitando a análises que medem o potencial de membrana mitocondrial, os níveis de ATP e ROS e as concentrações de cálcio mitocondrial. No entanto, estes ensaios fornecem um único instantâneo da função mitocondrial e, portanto, não podem fornecer uma visão abrangente da saúde mitocondrial. Desde que o consumo de oxigênio durante a geração de ATP é dependente de uma miríade de reações sequenciais, serve como um indicador superior da função mitocondrial. Curiosamente, foram observadas variações nas taxas de consumo de oxigênio em consequência de disfunção mitocondrial3,4,5.
Taxas de consumo de oxigênio (OCR) de amostras de vida podem ser medidas usando técnicas que podem ser divididas em dois grupos: amperométrico sensores de oxigênio e fósforos porfirina base que podem ser saciados por oxigênio6. Sensores de oxigênio amperométrico têm sido amplamente utilizados para medida de OCR em culturas de células, tecidos e em sistemas modelo, tais como c. elegans. No entanto, fósforos baseados em porfirina contendo respirometers possuem as seguintes vantagens: (1) que permitem uma comparação lado a lado de duas amostras em triplicata, (2) eles exigem menor tamanho de amostra (por exemplo, 20 vermes por alvéolo contra ~ 2, 000−5, 000 vermes na Câmara)7e (3) o respirometer pode ser programado para fazer quatro injeções de diferentes compostas no desejado vezes por todo o experimental, eliminando a necessidade de aplicação manual.
Neste protocolo, passos envolvidos na utilização de uma porfirina base respirometer sensor de oxigênio à medida OCR em ao vivo, intacto c. elegans são descritos. Enquanto houver um protocolo escrito para a utilização do formato grande, alto throughput respirometer8, este protocolo foi adaptado para uso com um instrumento de escala amigável, acessível e menor orçamento mais. Este protocolo é particularmente útil para avaliar a diferença entre duas tensões, onde a seleção da elevado-produção não é necessária e seu uso seria excessivo OCR.
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Protocol
Nota: A Figura 2 fornece uma visão esquemática do protocolo completo.
1. crescimento e sincronização da população de nematoides9,10
- Transferir as larvas L4 de origens genéticas desejadas (por exemplo, N2 [tipo selvagem] e animais sel-12) para nematoides mídia (NGM) placas de crescimento (ver tabela 1 para receita) recém semeadas com um gramado de Escherichia coli (OP50)11. Use 100mm pelo menos duas ou três placas de 60 mm para todas as estirpes. Incube os vermes à temperatura de crescimento adequado (entre 15 e 25 ° C) por 3-4 dias ou até placas estão concentradas com grande número de ovos e vermes gravid.
- Lave os ovos e os vermes os pratos, usando aproximadamente 6 mL de tampão de M9 (ver tabela 1 para receita) por placa de 100mm de nematoides e transferência-los com pipetas Pasteur de vidro em tubos de centrífuga 15ml individuais para cada estirpe. Spin estes tubos para baixo por 3 min em 6.180 x g e aspirado para fora o buffer M9, mantendo apenas a pelota de animais e de ovos.
- 3 – 4 ml de solução de lixívia (ver tabela 1 para receita) para cada tubo e intermitentemente vórtice para 6 min. Adicionar M9 reserva preencher cada tubo e girar a 6.180 x g por 1 min e aspire o sobrenadante. Repetir esta lavagem com M9 três vezes e mover a pelota de ovo para um tubo de 15 mL contendo aproximadamente 9 mL de tampão de M9.
- Sincronizar os vermes recém eclodidos por oscilador a 20 ° C para 16 – 48 h Spin estes tubos para baixo a 6.180 x g, durante 1,5 min e abaixe os animais L1 sincronizados em pratos individuais de NGM recém semeados com um gramado de OP50 (aproximadamente 6.000-10.000 animais por placa de 100mm) e manter a 20 ° C.
- Estes animais atingirá a fase larval de L4 depois ~ 42 h. Neste momento, mover as larvas L4 usando uma picareta platina para OP50 semearam NGM placas contendo 0,5 mg / mL de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR) para impedi-los de produzir descendência.
Nota: Certifique-se que, dentro de um experimento todas as estirpes são sincronizadas para uma quantidade similar de tempo. Tratamento de FUdR esteriliza os animais e impede a produção de ovos que fixa e progênie, que poderia influenciar o OCR. Estes animais esterilizados serão analisados no dia seguinte (animais adultos dia 1 a 66 ~ h) para o ensaio. FUdR tem sido relatado para impactar a fisiologia e a expectativa de vida de certos vermes mutantes. Portanto, esta deve ser tida em conta quando a droga é usada para esterilização12,13,14. Worms também podem ser esterilizados por meio de feminizing mutações tais como fem-1(hc17) ou fem-3(e2006). No entanto, estas mutações podem impactar a função mitocondrial.
2. preparação de compostos para ser injetado e hidratação das sondas
Nota: Durante o ensaio executado, ambas as taxas de respiração basal e máxima dos nematódeos são medidas. Respiração máxima é desencadeada nos animais sobre a adição de carbonila cianeto-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), um desacoplamento ionóforo que perturba o potencial de membrana mitocondrial e, portanto, a síntese de ATP pelo transporte de prótons através da membrana mitocondrial, permitindo o bombeamento de prótons, transporte de elétrons e consumo de oxigênio proceder4,15 desacoplada da síntese de ATP (Figura 1). A etapa final no ensaio envolve a adição de azida de sódio (NaN3), um fármaco que inibe a complexos de IV e V no ETC, permitindo que se determine a respiração mitocondrial não16 (Figura 1). As seguintes etapas podem ser executadas no dia antes de executar o ensaio real.
- Prepare-se 1 mL soluções estoque do FCCP (10mm em Dimetilsulfóxido [DMSO]: 1000 x concentração do ensaio final) e NaN3 (400 milímetros em dH2O: 10 x concentração final) e em-20 ° C.
Nota: Execute uma curva de concentração, para otimizar a concentração da FCCP necessária para eliciar a resposta máxima de OCR para cada instrumento e a configuração de laboratório. - Hidrate o cartucho sensor adicionando 200 µ l de dH2O cada poço (e o reservatório circundante) na placa, garantindo que o sensor de sondas estão submersos na dH2O e loja durante a noite em temperatura ambiente.
Nota: O cartucho podem ser deixadas em sondas submerso por até 72 h, mas no caso de uma hidratação prolongada, as placas devem ser envolvidas na película de parafina e armazenadas a 4 ° C. Se a hidratação durante a noite não é possível, o cartucho do sensor deve ser hidratado pelo menos 4 horas antes do ensaio. - Desligar o aquecimento elemento dentro da interface do respirometer e armazenar o instrumento dentro de uma incubadora de 15 ° C durante a noite a temperatura baixa dentro do instrumento para impedir os animais de superaquecimento durante o ensaio executado.
Nota: O respirometer está equipado com um elemento de aquecimento, mas não pode ser refrigerado. Dentro de uma incubadora de 15 ° C, o respirometer terá uma temperatura estável entre 18-22 ° C, que é uma temperatura saudável para a manutenção de c. elegans .
3. drogas carregamento e cartucho de equilíbrio
- Pipetar para fora e descartar o dH2O usado para hidratar o sensor sondas e substituí-lo com 200 µ l da solução de calibrant (pH 7,4) em cada poço. Diluir a solução-mãe Compararia a 100 µM Compararia em dH2O e adicionar 20 µ l da solução diluída para o porto de injeção A no cartucho de sensor. Adicione 22 µ l de azida de sódio de 400 mM a porta B do cartucho señor.
- Ativar o respirometer e na tela home, selecione Iniciar; aparecerá a página de modelos. Na página de modelos, selecione em branco ou um modelo previamente concebido; será exibida a página de grupos. Na página de grupos, selecione os poços A e H como os poços de fundo e atribuir os restantes 6 poços em grupos apropriados de acordo com o plano experimental.
- Pressione a seta no canto inferior direito para ir para a página de protocolo. Na página de protocolo, certifique-se de que os botões de equilíbrio, Basal e injeções de 1 e 2 são selecionados. Nesta página, ajustar o número de leituras de OCR basal, bem como a máxima OCR (após injeção 1 com FCCP) e não-mitocondrial OCR (após a injeção 2 com azida de sódio).
Nota: Cada medição é precedida por uma mistura e passo de espera e os prazos para esses parâmetros são mostrados na tabela 2. - Selecione a seta no canto inferior direito e será exibido um prompt para carregar a placa do cartucho de sensor. Certifique-se de que a placa de sensor cartucho é carregada na orientação certa, seguindo as instruções na tela do prompt lembrete. O respirometer agora irá equilibrar o cartucho.
Nota: Este equilibrio fornece tempo suficiente para colocar os animais para ser analisada em poços apropriados da placa celular.
4. preparação da placa de verme e ensaio executado
- Adicione 200 µ l de tampão de M9 em cada um dos 8 poços da placa de célula e em reservatórios em torno dos poços.
- Pegar vermes ~ 100 de cada estirpe em placas NGM não-semeadas e deixe descansar por 2-3 min molhado a extremidade da palheta platina com buffer M9 e escolher 20 animais de idade-sincronizado em poços B-G, deixando os poços de fundo A e H vazio.
Nota: Após o carregamento cada bem, esperar cerca de 2 min para permitir que os animais se acomode-se no fundo dos poços. Também é aconselhável que uma curva número worm seja executado para otimizar o número de verme por alvéolo para cada instrumento e a configuração de laboratório. - Até agora, o respirometer deve ser calibrado e clicando Okey na tela, a placa com solução tampão de calibração é ejectada e pode ser retirada o respirometer, enquanto o cartucho do sensor fica dentro do instrumento. Substitua a placa de calibrant com a placa contendo animais. Carregar a placa e feche a porta batendo Continue e permitir que o ensaio executar.
5. análise de dados pós-experiência de
- Uma vez concluída a execução do ensaio, siga as instruções na tela e retire a placa de células e cartucho de sensor e inserir um pendrive na porta USB para salvar os dados de execução no formato. War. Remova o cartucho do sensor e permitir que os animais para se estabelecer no fundo dos poços, para aproximadamente 2 min. Coloque as placas de células sob um microscópio de dissecção de estéreo e contar o número de animais por bem.
- Abra o software de análise no computador e abra a guia de normalização para normalizar o OCR para o número de animais. Aplicar etiquetas apropriadas para os vários grupos sob o guia de modificar e exportar o arquivo como um arquivo de prisma para posterior análise.
Nota: A média das cinco primeiras medições, antes da adição de Compararia é o OCR basal, enquanto a média das cinco medições após adição Compararia é o OCR máximo e a média das últimas cinco medições (mínimo de duas medições deve ser feito) após adição de azida de sódio é a taxa de respiração mitocondrial-não. O ensaio deve ser repetido três vezes para garantir a reprodutibilidade.
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Representative Results
Usando o protocolo descrito neste documento, OCR de tipo selvagem animais e três diferentes sel-12 mutante estirpes foram determinadas. SEL-12 codifica a ortholog de c. elegans de presenilina17. As mutações em presenilina humana são a aberração genética mais comum associada com o desenvolvimento da doença de Alzheimer familiar18. Nossos estudos mostraram níveis elevados de cálcio mitocondrial em sel-12 animais mutantes, em relação ao tipo selvagem animais3. Desde que a alteração no cálcio pode resultar na alteração da função mitocondrial de19,3,20, OCR sel-12 mutantes e tipo selvagem animais foram medidos para examinar o efeito das mutações sel-12 função mitocondrial e da saúde. Animais selvagens tipo mostraram consistentemente taxas de OCR basais abaixo 5 pmol/min/worm, enquanto três de todas as estirpes mutantes de sel-12 mostraram significativamente elevado OCR de ~ 7 pmol/min/worm (Figura 3 e Figura 4). Sobre a adição de FCCP, como esperado, houve um aumento no OCR de tipo selvagem, bem como mutantes sel-12 (Figura 3 e Figura 5). Animais selvagens tipo mostraram OCR máximo de ~ 7 pmol/min/worm, enquanto os mutantes sel-12 tinham OCR de ~ 10 pmol/min/worm (Figura 5).
Figura 1: esquemático dos principais intervenientes envolvidos na respiração celular e o efeito de azida de sódio, Compararia. Transferência de elétrons do NADH para o complexo que resulta na geração de um gradiente electroquímico através da membrana mitocondrial interna como prótons ficar bombeados através dele, ETC. Prótons fluindo de volta para a matriz mitocondrial do espaço intermembranar através do complexo V resultados na síntese de ATP. Adição de Compararia resulta no desacoplamento deste processo por perturbar o potencial de membrana mitocondrial e, assim, a síntese de ATP, enquanto o consumo de oxigênio continua, permitindo a medição de OCR máxima. Azida de sódio (NaN3) é um inibidor de complexos IV e V, permitindo assim que para a medição da respiração mitocondrial-não. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diagrama esquemático das etapas envolvidas na medição de OCR em c. elegans. As cinco etapas envolvidas na configuração do ensaio e correr (esquerda) e um prazo para cada etapa (àdireita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: perfil característico de OCR em c. elegans respirometria. Os cinco valores iniciais mostram a respiração basal, seguida por cinco leituras de máximo e cinco leituras de respiração não-mitocondrial após injeções de azida Compararia e sódio, respectivamente. Barras de erro representam o erro padrão de medida (SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Respiração Basal no tipo selvagem e vários mutantes sel-12 . Média respiração basal em 1 dia adulto idade-combinada tipo selvagem e sel-12 animais mutantes. Dados compilados a partir do ensaio de três repetições. Barras de erro representam SEM e * * * indica p < 0,0001. p valores foram calculados usando um bicaudal t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Respiração máxima no tipo selvagem e vários mutantes sel-12 . Média máxima respiração em 1 dia adulto idade-combinada tipo selvagem e sel-12 animais mutantes após injeção FCCP. Dados compilados a partir do ensaio de três repetições. Barras de erro representam SEM e * * * indica p < 0,0001. p valores foram calculados usando um bicaudal t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Buffer de M9 (1 L) | |||
| O dH2 | 1.000 mL | ||
| NaCl | 5 g | ||
| KH2PO4 | 3 g | ||
| Na2HPO4 | 6 g | ||
| 1 M MgSO4 | 1 mL * adicionar após a esterilização em autoclave | ||
| Dividido entre 2 garrafas: 500 mL cada. Autoclave em ciclo líquido (exposição de 15 min) | |||
| Solução de água sanitária (50ml) | |||
| O dH2 | 36 mL | ||
| Água sanitária | 14 mL | ||
| 10 N NaOH | 800 ΜL | ||
| As placas de nematódeo crescimento Media (NGM) | |||
| 1 L | 0.5 L | 0,25 L | |
| NaCl | 3 g | 1,5 g | 0,75 g |
| Bacto ágar | 17 g | 8,5 g | 4,25 g |
| Bacto peptona | 2,5 g | 1,25 g | 0,625 g |
| r. autoclave no ciclo líquido (45 min de exposição), deixar arrefecer ~ 60 ° c e então usar técnica estéril e adicione o seguinte: | |||
| 1 L | 0.5 L | 0,25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M MgSO4 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M KPO4 | 25 mL | 12,5 mL | 6,25 mL |
| colesterol de 5 mg/mL | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| b. agitar o frasco para misturar bem após cada adição. Após todas as adições são feitas, Despeje as placas | |||
Tabela 1: Receitas para placas NGM, M9 reserva e solução de lixívia.
| Calibração | Basal | FCCP | Azida de sódio |
| Porta (s): A | Porta (s): B | ||
| Equilibração: Sim | Mix: 00:02:00 | Mix: 00:02:00 | Mix: 00:02:00 |
| Espera: 00:00:30 | Espera: 00:00:30 | Espera: 00:00:30 | |
| Medida: 00:02:00 | Medida: 00:02:00 | Medida: 00:02:00 | |
| Ciclos: 5 | Ciclos: pelo menos 5 | Ciclos: 2−5 | |
| Duração: 00:22:30 | Duração: 00:22:30 | Duração: 00:09:00 |
Tabela 2: parâmetros característicos do ensaio em C. elegans respirometria.
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Discussion
Respiração mitocondrial é um indicador perspicaz da função mitocondrial; Portanto, ser capaz de medir as taxas de consumo de oxigênio em um sistema biológico, se in vitro ou in vivo é altamente valioso. Respirometers sentir os níveis de oxigénio usando fósforos baseados em porfirina que ficar saciados pelo oxigênio ou através de sensores de oxigênio amperométrico que contam com a geração de um elétrico atual proporcional à pressão de oxigênio. Eletrodo de Clark cai na última categoria e tem sido amplamente utilizado na literatura, especialmente ao analisar a respiração em c. elegans. No entanto, a necessidade de um tamanho de amostra grande e a incapacidade de avaliar mais de uma amostra de cada vez faz amperométrico sensores de oxigênio ineficiente.
Este protocolo fornece um guia simples para medida OCR em ao vivo, intacto c. elegans sem mitocôndrias, um processo que pode potencialmente afetar o potencial de membrana mitocondrial e, portanto, o OCR de isolamento. Dado que os animais apresentam diferente OCR através de vários estágios de vida, animais utilizados neste protocolo devem ser sincronizada de idade. Animais mais jovens têm OCR mais baixa em comparação com animais adultos e os níveis de OCR podem cair de novo como animais de idade mais3. C. elegans também são esterilizados pelo uso de FUdR para garantir que o OCR não são confundidos pela presença de descendentes. No entanto, se os animais de tamanhos variados devem ser examinados, estratégias de normalização devem ser abordadas.
Este protocolo utiliza uma picareta platina para transferir os animais para a placa de ensaio. Em contraste com transferência de líquidos de animais, esta manipulação permite o pesquisador cuidadosamente examinar e determinar a saúde dos animais antes e durante a transferência. Também, permite melhor controle do número de verme e evita a introdução de ovos e carcaças. Desde que os animais estão vivos e ativos durante a execução do ensaio, a variabilidade é provável que surjam do posicionamento da sonda. Ensaios, portanto, deve ser feitos em triplicado e deve ser repetido um mínimo de três vezes. Também, dupla verificação análise de post de contagem de animais é importante para a normalização de número de animais. Uma grande desvantagem deste protocolo é a incapacidade de comparar mais de duas amostras de uma só vez, sem comprometer o número de repetições dentro de um único ensaio. Apesar desta limitação, este protocolo pode ser uma ferramenta muito poderosa da pesquisa na análise de OCR ao comparar dois genótipos ou condições. Além disso, este protocolo pode ser facilmente adaptado para examinar o OCR de animais cultivadas em diferentes alimentos fontes, suplementos ou tratamentos com drogas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Kevin Bittman para sua orientação no estabelecimento XFp o cavalo-marinho em laboratório. Institutos nacionais de saúde conceder que este trabalho apoiado por GM088213.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
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