Summary
माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन, अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है; इसलिए, ऑक्सीजन की खपत की दर माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य का एक उत्कृष्ट संकेतक है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आत्मशोधन का उपयोग करने के लिए बेसल और अधिकतम ऑक्सीजन की खपत दरों में रहते हैं, बरकरार है, और स्वतंत्र रूप से-gram caenorhabditis एलिगेंसउपाय का वर्णन ।
Abstract
इष्टतम माइटोकॉन्ड्रियल समारोह स्वस्थ सेलुलर गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से कोशिकाओं में जो तंत्रिका तंत्र और मांसपेशी में उन जैसे उच्च ऊर्जा की मांग करते हैं । इस के साथ संगत, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों और सामान्य रूप से उम्र बढ़ने के असंख्य के साथ जुड़ा हुआ है । केनोरहब्डिटिस एलिगेंस माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन के कई पेचीदगियों को elucidating के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है । माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन का एक मजबूत संकेतक है और हाल ही में विकसित respirometers कोशिकाओं में श्वसन को मापने के लिए एक राज्य के अत्याधुनिक मंच प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम लाइव, अक्षुण्ण C. एलिगेंसका विश्लेषण करने के लिए एक तकनीक प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल ~ 7 दिनों की अवधि तक फैला है और (1) बढ़ रही है और सी elegans के तुल्यकालन के लिए कदम भी शामिल है, (2) यौगिकों की तैयारी इंजेक्शन और जांच का हाइड्रेशन, (3) दवा लदान और कारतूस equilibration, (4) कीड़ा परख की तैयारी थाली और परख चलाने के लिए, और (5) के बाद प्रयोग डेटा विश्लेषण ।
Introduction
एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी), सेलुलर ऊर्जा का मुख्य स्रोत, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में एंजाइमों द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया में उत्पादित किया जाता है (आदि) भीतरी mitochondria झिल्ली में स्थित. पायरुवेट, माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन के लिए उपयोग किया जाने वाला एक महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट, माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में आयात किया जाता है, जहां एसिटिल कोएंजाइम ए (सीओए) का उत्पादन करने के लिए डिकार्बोक्सिलेटेड है । इसके बाद, एसिटाइल सीओए साइट्रिक एसिड चक्र में प्रवेश करता है जिसके परिणामस्वरूप निकोटिनमाइड एडेनिन डिन्यूक्लियोटाइड (नध) की उत्पत्ति होती है, जो एक मुख्य इलेक्ट्रॉन वाहक अणु है । नध से इलेक्ट्रॉनों के रूप में आदि के माध्यम से ऑक्सीजन को पारित किया जाता है, प्रोटॉन माइटोकॉन्ड्रियल इंटरमेम्ब्रेन अंतरिक्ष में निर्माण करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली के पार एक इलेक्ट्रोकेमिकल ग्रेडिएंट उत्पन्न होता है । ये प्रोटॉन तो एटीपी synthase के प्रोटॉन छिद्र के माध्यम से mitochondrial मैट्रिक्स में वापस इस इलेक्ट्रोकेमिकल ढाल भर में interमेम्ब्रेन अंतरिक्ष से प्रवाह होगा, इसके रोटेशन और एटीपी1 के संश्लेषण ड्राइविंग (चित्रा 1).
माइटोकॉन्ड्रियल समारोह ऊर्जा उत्पादन तक ही सीमित नहीं है, लेकिन कैल्शियम होमियोस्टेसिस, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) सफाई, और एपोप्टोसिस के लिए भी महत्वपूर्ण है, गंभीर रूप से अपने समारोह के आयोजन स्वास्थ्य2में स्थिति । माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन का मूल्यांकन विभिन्न प्रकार के assays के उपयोग से किया जा सकता है, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता, एटीपी और ROS स्तर, और माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम सांद्रता को मापने वाले विश्लेषण तक सीमित नहीं हैं । हालांकि, ये assays माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन का एक एकल स्नैपशॉट प्रदान करते हैं और इसलिए शायद माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य का एक व्यापक दृश्य प्रदान नहीं करते हैं । एटीपी पीढ़ी के दौरान ऑक्सीजन की खपत के बाद से अनुक्रमिक प्रतिक्रियाओं के असंख्य पर निर्भर है, यह माइटोकॉन्ड्रियल समारोह के एक बेहतर संकेतक के रूप में कार्य करता है. दिलचस्प बात यह है कि ऑक्सीजन की खपत की दरों में बदलाव को माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन3,4,5के परिणामस्वरूप देखा गया है ।
जीवित नमूनों की ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) तकनीक है कि मोटे तौर पर दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है का उपयोग कर मापा जा सकता है: amperometric ऑक्सीजन सेंसर और पॉर्फिरिन आधारित फोस्फोरस कि ऑक्सीजन से बुझती जा सकता है6. amperometric ऑक्सीजन सेंसर व्यापक रूप से संवर्धित कोशिकाओं, ऊतकों में ओसीआर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और जैसे मॉडल प्रणालियों में, सी एलिगेंसके रूप में. हालांकि, पोर्फिरिन आधारित respirometers युक्त फोस्फोरस निम्नलिखित लाभ के अधिकारी: (1) वे triplicate में दो नमूनों की ओर तुलना द्वारा एक पक्ष के लिए अनुमति देते हैं, (2) वे छोटे नमूना आकार की आवश्यकता होती है (जैसे, 20 कीड़े प्रति अच्छी तरह से बनाम ~ 2000 − 5000 कीड़े में चैंबर)7, और (3) आत्मशोधन प्रयोगात्मक चलाने भर में वांछित समय पर चार अलग यौगिक इंजेक्शन करने के लिए क्रमादेशित किया जा सकता है, मैनुअल आवेदन के लिए की जरूरत को नष्ट करने.
इस प्रोटोकॉल में, लाइव में ओसीआर को मापने के लिए पॉर्फिरिन आधारित ऑक्सीजन-सेंसिंग श्वसन मापी का उपयोग करने में शामिल कदम, अक्षुण्ण सी एलीगेंस का वर्णन किया गया है। जबकि वहाँ बड़े प्रारूप के उपयोग के लिए एक लिखित प्रोटोकॉल है, उच्च थ्रुपुट आत्मशोधन8, इस प्रोटोकॉल एक अधिक बजट के अनुकूल के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, सुलभ, और छोटे पैमाने पर साधन. यह प्रोटोकॉल दो उपभेदों के बीच ओसीआर में अंतर का आकलन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जहां उच्च थ्रोपुट स्क्रीनिंग की आवश्यकता नहीं है और इसका उपयोग अत्यधिक होगा ।
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Protocol
नोट: चित्रा 2 पूर्ण प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन प्रदान करता है.
1. सूत्रकृमि जनसंख्या का विकास और तुल्यकालन9,10
- (उदाहरण के लिए, N2 [जंगली प्रकार] और sel-12 जानवरों) सूत्रकृमि विकास मीडिया (ngm) प्लेटों पर वांछित आनुवंशिक पृष्ठभूमि ( तालिका 1 रेसिपी के लिए देखें) के स्थानांतरण L4 लार्वा escherichia कोली (OP50)11के एक लॉन के साथ हौसले से वरीयता प्राप्त । प्रत्येक तनाव के लिए कम से २ १०० मिमी या ३ ६० मिमी प्लेटों का उपयोग करें । उचित विकास तापमान (15 से 25 डिग्री सेल्सियस) के लिए 3-4 दिनों के लिए या जब तक प्लेटें अंडे और अंडपूर्ण कीड़े की बड़ी संख्या के साथ केंद्रित कर रहे हैं पर कीड़े सेते हैं ।
- एम9 बफर के लगभग 6 मिलीलीटर का उपयोग करके अंडों और कीड़ों को धो लें (विधि के लिए तालिका 1 देखें) प्रति १०० मिमी प्लेट सूत्रकृमि और प्रत्येक तनाव के लिए व्यक्तिगत 15 मिलीलीटर अपकेंद्री ट्यूबों में कांच के पाश्चर पिप्ट्स के साथ उन्हें स्थानांतरित करें । 3 मिनट के लिए नीचे इन ट्यूबों स्पिन ६,१८० एक्स जी और एम9 बफर बाहर महाप्राण, सिर्फ जानवरों और अंडे गोली को बनाए रखने ।
- जोड़ें 3 – 4 ब्लीच समाधान की मिलीलीटर (नुस्खा के लिए तालिका 1 देखें) प्रत्येक ट्यूब और आवर्तक भंवर के लिए 6 मिनट. जोड़ें M9 बफर प्रत्येक ट्यूब को भरने के लिए और 1 मिनट के लिए ६,१८० एक्स जी पर स्पिन और महाप्राण supernatant. इस वॉश को m9 तीन बार दोहराएं और अंडे की पेलेट को एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब में ले जाएं जिसमें लगभग 9 एमएल का m9 बफर है ।
- 16 के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर nutating द्वारा हौसले से रचा कीड़े सिंक्रनाइज़-48 एच १.५ मिनट के लिए ६,१८० एक्स जी पर इन ट्यूबों नीचे स्पिन और व्यक्तिगत एनजीएम प्लेटों पर नीचे सिंक्रनाइज़ L1 जानवरों डाल OP50 के एक लॉन के साथ हौसले से वरीयता प्राप्त (लगभग 6000-१०० मिमी प्लेट प्रति 10000 पशु) और 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
- ~ ४२ h के बाद ये जानवर L4 लार्वा स्टेज तक पहुंच जाएंगे । इस समय, एक प्लैटिनम का उपयोग कर L4 लार्वा को ले जाने के लिए OP50 से युक्त एनजीएम प्लेटों को ०.५ मिलीग्राम/एमएल 5-फ्लूओरो-2'-डिऑक्सीयूरिडीन (fudr) को progeny उत्पादन से रोकने के लिए ।
नोट: सुनिश्चित करें कि एक प्रयोग के भीतर सभी उपभेदों समय की एक समान राशि के लिए सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं । fudr उपचार जानवरों जीवाणुयुक्त और अंडा बिछाने और संतान उत्पादन है, जो ओसीआर को प्रभावित कर सकता रोकता है । इन निष्फल पशुओं परख के लिए अगले दिन (दिन 1 ~ ६६ एच में वयस्क जानवरों) का विश्लेषण किया जाएगा । fudr प्रभाव शरीर क्रिया विज्ञान और कुछ उत्परिवर्ती कीड़े की उम्र के लिए सूचित किया गया है. इसलिए नसबंदी के लिए दवा का उपयोग12,13,14को करते समय यह ध्यान में रखा जाना चाहिए । कीड़े भी इस तरह के fem-1 (hc17) या fem-3 (e2006) के रूप में feminizing म्यूटेशन के माध्यम से निष्फल किया जा सकता है । हालांकि, इन म्यूटेशन mitochondrial समारोह प्रभाव हो सकता है.
2. यौगिकों के इंजेक्शन और जांच के हाइड्रेशन की तैयारी
नोट: परख चलाने के दौरान, दोनों बेसल और अधिकतम श्वसन सूत्रकृमि की दर मापा जाता है । अधिकतम श्वसन कार्बोनिल साइनाइड-4 (ट्राइफ्लोमेथॉक्सी) फ़ेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) के अलावा जानवरों में ट्रिगर होता है, जो कि माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की क्षमता को परेशान करता है और इस प्रकार प्रोटॉन परिवहन द्वारा एटीपी संश्लेषण माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के माध्यम से, प्रोटॉन पंप, इलेक्ट्रॉन परिवहन, और ऑक्सीजन की खपत की अनुमति देते हुए एटीपी संश्लेषण (चित्रा 1) से4,15 uncoupled आगे बढ़ने के लिए । परख में अंतिम चरण सोडियम ऐज़ाइड के अलावा शामिल है (नेन3), एक दवा है कि परिसरों में चतुर्थ और वी को रोकता है आदि, एक गैर का निर्धारण करने के लिए अनुमति-mitochondrial श्वसन16 (चित्रा 1). निंनलिखित कदम वास्तविक परख चलाने से पहले दिन प्रदर्शन किया जा सकता है ।
- fccp के 1 मिलीलीटर स्टॉक समाधान तैयार करें (10 मिमी में डाइमेथिल sulfoxide [dmso]: 1000x अंतिम परख एकाग्रता) और नेन3 (४०० मिमी में dH2हे: 10x अंतिम परख एकाग्रता) और दुकान पर-20 ° c.
नोट: प्रत्येक साधन और प्रयोगशाला की स्थापना के लिए अधिकतम ओसीआर प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक fccp की एकाग्रता का अनुकूलन करने के लिए एक एकाग्रता वक्र भागो. - एक अच्छी तरह से (और आसपास के जलाशय) के लिए डीएच2ओ के २०० μl जोड़कर सेंसर कारतूस हाइड्रेट, सुनिश्चित करना है कि सेंसर जांच dh2हे में जलमग्न और कमरे के तापमान पर रातोंरात स्टोर कर रहे हैं ।
नोट: कारतूस जांच ७२ ज तक के लिए जलमग्न छोड़ दिया जा सकता है लेकिन एक लंबे समय तक जलयोजन के मामले में, प्लेटें पैराफिन फिल्म में लिपटे और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए । यदि रातोंरात जलयोजन संभव नहीं है, सेंसर कारतूस के लिए हाइड्रेटेड किया जाना चाहिए 4 परख से पहले एच । - आत्मशोधन इंटरफेस के भीतर हीटिंग तत्व बंद करें और परख चलाने के दौरान भडक से पशुओं को रोकने के लिए साधन के भीतर कोर तापमान कम करने के लिए रातोंरात एक 15 डिग्री सेल्सियस इनकुबेटर के अंदर साधन की दुकान ।
नोट: आत्मशोधन एक हीटिंग तत्व से सुसज्जित है लेकिन ठंडा नहीं किया जा सकता है । एक 15 ° c मशीन के भीतर, आत्मशोधन के बीच एक स्थिर तापमान होगा 18 – 22 ° c, जो सी एलिगेंस रखरखाव के लिए एक स्वस्थ तापमान है.
3. ड्रग लोडिंग और कारतूस साम्य
- बाहर पिपेट और सेंसर जांच हाइड्रेट करने के लिए प्रयोग किया जाता है dH2हे त्यागें और यह एक अच्छी तरह से कैलिब्रेट समाधान (पीएच ७.४) के २०० μl के साथ प्रतिस्थापित करें । डीएच2ओ में १०० μm एफसीसीपी के लिए एफसीसीपी स्टॉक समाधान को पतला करें और सेंसर कारतूस में इंजेक्शन पोर्ट ए को पतला समाधान के 20 μl जोड़ें । सेंर कारतूस के पोर्ट बी के लिए ४०० मिमी सोडियम ऐज़ाइड के 22 μl जोड़ें ।
- पर और होम स्क्रीन पर आत्मशोधन बारी का चयन करें शुरू; टेंपलेट्स पृष्ठ दिखाई देगा । टेंपलेट्स पृष्ठ पर, रिक्त या पहले से डिज़ाइन किए गए टेंपलेट का चयन करें; समूह पृष्ठ दिखाई देगा । समूह पृष्ठ पर, पृष्ठभूमि कुओं के रूप में कुओं ए और एच का चयन करें और प्रयोगात्मक योजना के अनुसार उचित समूहों में शेष 6 कुओं आवंटित.
- प्रोटोकॉल पृष्ठ पर जाने के लिए निचले दाएं कोने पर तीर पुश करें । प्रोटोकॉल पृष्ठ पर, सुनिश्चित करें कि equilibrate, बेसल और इंजेक्शन 1 और 2 बटन चयनित हैं । इस पृष्ठ पर, बेसल ओसीआर के रीडिंग की संख्या को समायोजित, साथ ही अधिकतम ओसीआर (fccp के साथ इंजेक्शन 1 के बाद) और गैर मिटोकॉन्ड्रियल ओसीआर (सोडियम azide के साथ इंजेक्शन 2 के बाद).
नोट: प्रत्येक माप एक मिश्रण से पहले है और प्रतीक्षा चरण और इन मापदंडों के लिए समय फ्रेम तालिका 2में दिखाए जाते हैं । - निचले सही कोने पर तीर का चयन करें और सेंसर कारतूस प्लेट लोड करने के लिए एक संकेत दिखाई देगा । सुनिश्चित करें कि सेंसर कारतूस थाली सही अभिविन्यास में भरी हुई है, अनुस्मारक प्रॉम्प्ट स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन. आत्मशोधन अब कारतूस equilibrate जाएगा ।
नोट: यह साम्य पशुओं को कोशिका पट्टिका के उपयुक्त कुओं में रखने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करता है ।
4. कीड़ा थाली और परख चलाने की तैयारी
- सेल प्लेट के 8 कुओं में से प्रत्येक में और कुओं के आसपास के जलाशयों में M9 बफर के २०० μl जोड़ें ।
- ngm प्लेटों अनसीडेड पर प्रत्येक तनाव से ~ १०० कीड़े उठाओ और 2-3 मिनट के लिए आराम करने के लिए अनुमति देते हैं. गीला प्लेटिनम के अंत एम9 बफर के साथ उठाओ और 20 आयु-कुओं बी-जी में सिंक्रनाइज़ जानवरों उठाओ, पृष्ठभूमि कुओं एक और एच खाली जा ।
नोट: एक अच्छी तरह से लोड होने के बाद, लगभग 2 मिनट रुको जानवरों कुओं के नीचे में बसने के लिए अनुमति देने के लिए । यह भी उचित है कि एक कीड़ा संख्या वक्र प्रत्येक साधन और प्रयोगशाला की स्थापना के लिए अच्छी तरह से प्रति कीड़ा संख्या का अनुकूलन करने के लिए चलाया जा. - अब तक, आत्मशोधन calibrated किया जाना चाहिए और स्क्रीन पर ठीक क्लिक करके, अंशांकन बफर युक्त थाली बाहर निकाला जाता है और श्वसन यंत्र से हटाया जा सकता है, जबकि सेंसर कारतूस साधन के अंदर रहता है. जानवरों युक्त थाली के साथ औजार प्लेट की जगह । लोड प्लेट और बंद करो मार से दरवाजा जारी रखने और परख चलाने के लिए अनुमति देते हैं ।
5. पोस्ट-प्रयोग डेटा विश्लेषण
- एक बार परख चलाने के पूरा हो गया है, स्क्रीन पर संकेतों का पालन करें और सेल प्लेट और सेंसर कारतूस को हटाने और यूएसबी पोर्ट में एक फ्लैश ड्राइव डालें. war प्रारूप में रन डेटा को बचाने के लिए । सेंसर कारतूस निकालें और पशुओं को लगभग 2 मिनट के लिए कुओं के नीचे बसने के लिए अनुमति देते हैं । एक स्टीरियो विदारक सूक्ष्मदर्शी के तहत सेल प्लेटों प्लेस और प्रति अच्छी तरह से पशुओं की संख्या की गणना ।
- कंप्यूटर पर विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें और ocr पशु संख्या को सामान्य करने के लिए सामान्यीकरण टैब खोलें । संशोधित टैब के अंतर्गत विभिन्न समूहों के लिए उपयुक्त लेबल लागू करें और आगे विश्लेषण के लिए एक प्रिज्म फ़ाइल के रूप में फ़ाइल निर्यात.
नोट: पहले पांच माप का औसत, fccp के अलावा से पहले बेसल ओसीआर है, जबकि fccp इसके अलावा पांच माप का औसत अधिकतम ओसीआर है और पिछले पांच मापन के औसत (दो माप की ंयूनतम किया जाना चाहिए) सोडियम ऐज़ाइड इसके अलावा गैर-mitochondrial श्वसन दर है । परख तीन बार दोहराया जाना चाहिए reproducibility सुनिश्चित करने के लिए ।
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Representative Results
इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, जंगली प्रकार के जानवरों के ocr और तीन अलग sel-12 उत्परिवर्ती उपभेदों निर्धारित किए गए थे. sel-12 एनकोड की सी. एलिगेंस ऑर्थोलोग ऑफ परस्लिलिन17. मानव presenilin में उत्परिवर्तन सबसे आम आनुवंशिक पारिवारिक अल्जाइमर रोग18के विकास के साथ जुड़े विपथन हैं । हमारे अध्ययनों में जंगली प्रकार के जानवरों की तुलना में sel-12 उत्परिवर्ती पशुओं में ऊंचा माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियमका स्तर दिखाया गया है । के बाद से कैल्शियम उतर बदल mitochondrial समारोह में परिणाम कर सकते हैं3,19,20, ओसीआर में sel-12 उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार जानवरों के लिए चयन के प्रभाव की जांच करने के लिए मापा गया -12 म्यूटेशन माइटोकॉन्ड्रियल समारोह और स्वास्थ्य पर । जंगली प्रकार के जानवर लगातार 5 pmol/min/worm के नीचे बेसल ओसीआर दर दिखाया, जबकि सभी तीन उपभेदों sel-12 म्यूटेंट के काफी ऊंचा ओसीआर दिखाया ~ 7 pmol/min/worm (चित्रा 3 और चित्रा 4) । एफसीसीपी के अलावा, उम्मीद के रूप में, जंगली प्रकार के ओसीआर के साथ -साथ sel-12 म्यूटेंट (चित्रा 3 और चित्रा 5) में वृद्धि हुई थी । जंगली प्रकार जानवरों ~ 7 pmol/min/worm के अधिकतम ओसीआर दिखाया, जबकि sel-12 म्यूटेंट ~ 10 pmol/min/worm (चित्रा 5) के ओसीआर था ।
चित्रा 1: सेलुलर श्वसन और fccp और सोडियम azide के प्रभाव में शामिल प्रमुख खिलाड़ियों के योजनाबद्ध. इस नध से इलेक्ट्रॉनों का अंतरण आदि जटिल I के परिणामस्वरूप भीतरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में एक विद्युत प्रवणता की पीढ़ी के रूप में प्रोटॉन इसे भर में पंप हो जाते हैं. प्रोटॉन वापस माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में जटिल वी परिणाम के माध्यम से interमेम्ब्रेन अंतरिक्ष से एटीपी संश्लेषण में बहने. इसके अलावा fccp की इस प्रक्रिया के वियुग्मन में mitochondrial झिल्ली क्षमता और इस तरह एटीपी संश्लेषण को बाधित करके, ऑक्सीजन की खपत जारी है, जबकि अधिकतम ओसीआर की माप के लिए अनुमति देता है । सोडियम एज़ाइड (NaN3) परिसरों IV और वी के एक अवरोधक है, जिससे गैर-mitochondrial श्वसन की माप के लिए अनुमति देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्र 2: C. एलिगेंसमें ocr की माप में शामिल चरणों का योजनाबद्ध । पांच परख सेटअप और भागो में शामिल कदम (बाएं) और प्रत्येक चरण के लिए एक समय सीमा (दाएं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 3: C. एलिगेंस respirometry में विशेषता ओसीआर प्रोफ़ाइल. पांच प्रारंभिक रीडिंग बेसल श्वसन दिखाती है, जो क्रमश: एफसीसीपी और सोडियम एज़ाइड इंजेक्शन के बाद अधिकतम और पांच रीडिंग के पांच रीडिंग और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के द्वारा पीछा किया जाता है । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि मापन (SEM) का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 4: जंगली प्रकार और विभिन्न sel-12 म्यूटेंट में बेसल श्वसन । दिन में औसत बेसल श्वसन 1 वयस्क आयु मिलान जंगली प्रकार और sel-12 उत्परिवर्ती जानवरों । डेटा तीन परख दोहराता से संकलित । त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं और * * * * p < 0.0001 इंगित करता है । p मानों की गणना दो-पुच्छ t-परीक्षण का उपयोग करके की गई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 5: जंगली प्रकार और विभिन्न sel-12 म्यूटेंट में अधिकतम श्वसन । दिन में औसत अधिकतम श्वसन 1 वयस्क आयु-मिलान जंगली प्रकार और sel-12 उत्परिवर्ती जानवरों fccp इंजेक्शन के बाद । डेटा तीन परख दोहराता से संकलित । त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं और * * * * p < 0.0001 इंगित करता है । p मानों की गणना दो-पुच्छ t-परीक्षण का उपयोग करके की गई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
| M9 बफर (1 एल) | |||
| dH2O | १,००० एमएल | ||
| Nacl | 5 ग्राम | ||
| ख2पो4 | 3 ग्राम | ||
| ना2एचपीओ4 | 6 ग्राम | ||
| 1 M mgso4 | 1 मिलीलीटर * ऑटोक्लैविंग के बाद जोड़ें | ||
| 2 बोतलों के बीच भाजित: ५०० मिलीलीटर प्रत्येक । तरल चक्र पर ऑटोक्लेव (15 मिनट एक्सपोजर) | |||
| ब्लीच समाधान (५० mL) | |||
| dH2O | ३६ एमएल | ||
| ब्लीच | 14 मिलीलीटर | ||
| 10 N णह | ८०० μl | ||
| मानक सूत्रकृमि वृद्धि मीडिया (एनजीएम) प्लेट्स | |||
| 1 L | ०.५ L | ०.२५ L | |
| Nacl | 3 ग्राम | १.५ g | ०.७५ g |
| बैक्टो-आगर | 17 ग्राम | ८.५ g | ४.२५ g |
| बैक्टो-पेप्टोन | २.५ g | १.२५ g | ०.६२५ g |
| a. तरल चक्र (४५ मिनट एक्सपोजर) पर autoclave, ~ ६० डिग्री सेल्सियस के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं और फिर बाँझ तकनीक का उपयोग करें और निम्नलिखित जोड़ें: | |||
| 1 L | ०.५ L | ०.२५ L | |
| 1 एम cacl2 | 1 मिलीलीटर | ०.५ एमएल | ०.२५ एमएल |
| 1 M mgso4 | 1 मिलीलीटर | ०.५ एमएल | ०.२५ एमएल |
| 1 M केपीओ4 | 25 मिलीलीटर | १२.५ एमएल | ६.२५ एमएल |
| 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल | 1 मिलीलीटर | ०.५ एमएल | ०.२५ एमएल |
| b. भंवर एक अतिरिक्त के बाद अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । सभी परिवर्धन किए जाने के बाद, प्लेटें डालना | |||
तालिका 1: एनजीएम प्लेटों, M9 बफर, और ब्लीच समाधान के लिए व्यंजनों ।
| अंशांकन | बेसल | एफसीसीपी | सोडियम ऐज़ाइड |
| पोर्ट (s): एक | पोर्ट (s): B | ||
| साम्य: हां | Mix: 00:02:00 | Mix: 00:02:00 | Mix: 00:02:00 |
| प्रतीक्षा करें: 00:00:30 | प्रतीक्षा करें: 00:00:30 | प्रतीक्षा करें: 00:00:30 | |
| उपाय: 00:02:00 | उपाय: 00:02:00 | उपाय: 00:02:00 | |
| चक्र: 5 | चक्र: 5 | चक्र: 2 − 5 | |
| अवधि: 00:22:30 | अवधि: 00:22:30 | अवधि: 00:09:00 |
तालिका 2: विशिष्ट परख मापदंडों में C. एलिगेंस respirometry.
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Discussion
माइटोकॉन्ड्रियल संवेदनाएं माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन का एक व्यावहारिक संकेतक है; इसलिए, एक जैविक प्रणाली में ऑक्सीजन की खपत की दर को मापने में सक्षम किया जा रहा है, चाहे इन विट्रो में या vivo में अत्यधिक मूल्यवान है । respirometers नब्ज ऑक्सीजन से बुझती है कि ऑक्सीजन या amperometric ऑक्सीजन सेंसर के माध्यम से जो ऑक्सीजन दबाव के लिए एक विद्युत वर्तमान आनुपातिक की पीढ़ी पर भरोसा करते हैं पोर्फिरिन आधारित फोस्फोरस का उपयोग कर स्तर. क्लार्क इलेक्ट्रोड उत्तरार्द्ध श्रेणी में आता है और साहित्य में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है, विशेष रूप से, जबकि सी एलिगेंसमें श्वसन का विश्लेषण. हालांकि, एक बड़ा नमूना आकार और एक समय में एक से अधिक नमूने का आकलन करने में असमर्थता के लिए की जरूरत है amperometric ऑक्सीजन सेंसर असक्षम बनाता है ।
यह प्रोटोकॉल एक सरल गाइड के लिए लाइव में ओसीआर को मापने के लिए प्रदान करता है, मिटोकॉन्ड्रिया अलग बिना अक्षुण्ण C. एलिगेंस , एक प्रक्रिया है कि संभावित mitochondria झिल्ली क्षमता को प्रभावित कर सकता है और, इसलिए, ocr. यह देखते हुए कि पशु विभिन्न जीवन चरणों के माध्यम से विभिन्न ओसीआर दर्शाते हैं, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए जानवरों को आयु सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए । छोटे जानवरों वयस्क जानवरों की तुलना में कम ओसीआर है और ocr स्तर जानवरों आगे3उम्र के रूप में फिर से ड्रॉप कर सकते हैं । C. एलिगेंस भी fudr के उपयोग के द्वारा निष्फल कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए कि ocr संतान की उपस्थिति से चकित नहीं कर रहे हैं. फिर भी, अगर अलग आकार के जानवरों की जांच की जा रहे हैं, सामान्यीकरण के लिए रणनीतियों को संबोधित किया जाना चाहिए ।
इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल एक प्लेटिनम लेने के लिए परख थाली को पशुओं के हस्तांतरण उठाओ । जानवरों के तरल हस्तांतरण के विपरीत, इस हेरफेर शोधकर्ता ध्यान से जांच करने के लिए और पहले और हस्तांतरण के दौरान पशुओं के स्वास्थ्य का निर्धारण करने के लिए सक्षम बनाता है । इसके अलावा, यह कृमि संख्या के बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है और अंडे और शवों का परिचय रोकता है । चूंकि पशु जीवित है और परख चलाने के दौरान सक्रिय हैं, परिवर्तनशीलता जांच स्थिति से पैदा होने की संभावना है । इसलिए assays को तीन बार में किया जाना चाहिए और एक ंयूनतम दोहराया जाना चाहिए । इसके अलावा, दोहरी जांच पशु गिनती पोस्ट विश्लेषण पशु संख्या को सामान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख दोष एक ही परख के भीतर प्रतिकृति की संख्या समझौता किए बिना, एक बार में दो से अधिक नमूनों की तुलना करने में असमर्थता है । इस सीमा के बावजूद, इस प्रोटोकॉल ocr विश्लेषण में एक बहुत शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण हो सकता है जब दो जीनोटाइप या शर्तों की तुलना । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को आसानी से विभिन्न खाद्य स्रोतों, पूरक, या दवा उपचार पर उगाए गए पशुओं के ओसीआर की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक प्रयोगशाला में seahorse xfp स्थापित करने में उनके मार्गदर्शन के लिए डॉ केविन bittman स्वीकार करना चाहते हैं । राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थानों GM088213 इस काम का समर्थन किया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
- Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
- Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
- Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
- Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).
